Name: A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Découvrez une méthode haute résolution pour analyser l'activation phosphorylée d'IRF3 en immunologie. Cette technique par SDS-PAGE et immunoblot permet de distinguer les différentes formes actives du facteur de transcription impliqué dans la réponse immunitaire innée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient les membres précédents et actuels du laboratoire pour le développement des protocoles. Les travaux ont été financés par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) [subvention # MOP-130527] et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada [CRSNG-355306-2012]. NG est récipiendaire d’une chaire de recherche du Canada de niveau II. AR est titulaire d’une bourse d’études du programme de formation du Réseau de recherche en santé respiratoire du Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

<ol><li>Juang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+activation+of+interferon+A+and+interferon+B+gene+transcription+by+interferon+regulatory+factory-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).</li>
<li>Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+casein+kinase+II+phosphorylation+in+the+regulation+of+IRF-1+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity.</a> Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+interferon+regulatory+factor+3+target+genes%3A+direct+involvement+in+the+regulation+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes.</a> J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).</li>
<li>Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptors+and+the+innate+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection.</a> Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).</li>
<li>Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+antiviral+response%3A+from+viral+invasion+to+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion.</a> Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Signaling+Pathways+Leading+to+the+Phosphorylation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3.</a> J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).</li>
<li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+IRF-3+reveals+mechanism+of+autoinhibition+and+virus-induced+phosphoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystal+structure+of+IRF-3+and+its+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ser-386+of+interferon+regulatory+factor+3+as+critical+target+for+inducible+phosphorylation+that+determines+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation.</a> J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).</li>
<li>Clement, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+IRF-3+on+Ser+339+generates+a+hyperactive+form+of+IRF-3+through+regulation+of+dimerization+and+CBP+association%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association.</a> J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+interferon-regulatory+factor+3-dependent+innate+antiviral+response+by+the+prolyl+isomerase+Pin1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1.</a> Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).</li>
<li>Wathelet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+infection+induces+the+assembly+of+coordinately+activated+transcription+factors+on+the+IFN-beta+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo.</a> Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).</li>
<li>Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-3+is+an+in+vivo+target+of+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TAK1-JNK+cascade+is+required+for+IRF3+function+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response.</a> Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).</li>
<li>Solis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TBK1+and+IKKepsilon+in+lipopolysaccharide-induced+activation+of+the+interferon+response+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages.</a> Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).</li>
<li>Soucy-Faulkner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NOX2+and+reactive+oxygen+species+for+efficient+RIG-I-mediated+antiviral+response+through+regulation+of+MAVS+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).</li>
<li>Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-dependent+phosphorylation+of+the+IRF-3+transcription+factor+regulates+nuclear+translocation%2C+transactivation+potential%2C+and+proteasome-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation.</a> Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+triggering+of+the+type+I+interferon+system+by+virus+infection%3A+activation+of+a+transcription+factor+complex+containing+IRF-3+and+CBP%2Fp300%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300.</a> EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimal+phosphoacceptor+site+required+for+in+vivo+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+response+to+virus+and+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA.</a> J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).</li>
<li>Bergstroem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+in+vivo+virus-targeted+phosphorylation+site+in+interferon+regulatory+factor-3+%28IRF3%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3).</a> J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser386+phosphorylation+of+transcription+factor+IRF-3+induces+dimerization+and+association+with+CBP%2Fp300+without+overall+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change.</a> Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).</li>
<li>Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modification+of+interferon+regulatory+factor+3+following+virus+particle+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry.</a> J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).</li>
<li>McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+inhibit+IRF3+phosphorylation+in+response+to+Toll-like+receptor-3+and+-4+by+targeting+TBK1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).</li>
<li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+%28SOCS1%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).</li>
<li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li>
<li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li>
<li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+I%7Bkappa%7DB+Kinase+%28IKK%29-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1%2FIKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole que nous décrivons ici se compose d&#39;une combinaison de haute résolution SDS-PAGE et PAGE natif couplé à l&#39;utilisation de plusieurs anticorps phosphospécifiques à distinguer le monomère / dimère et phosphoforms I-IV de IRF3. Détection approprié de ces espèces IRF3 est essentiel pour caractériser complètement l&#39;activation de IRF3 dans un contexte spécifique. Par exemple, LPS stimulation de macrophages activés conduit à la formation de dimères, Ser396 / 398 IRF3 phosphorylée qui présente une hypoph...

<html> Le facteur de transcription ubiquitaire et exprimé de façon constitutive interféron (IFN) Facteur de réglementation 3 (IRF3) est crucial pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes principalement par l&#39;induction d&#39;IFNß, mais aussi grâce à l&#39;induction de la chimiokine (CC motif) ligand 5 (CCL5 ) et de plusieurs protéines, y compris la protéine antivirale de l&#39;IFN-induite avec tétratricopeptide répète IFIT1 / 2/3 de 1-3. Activation de IRF3 a été rapporté ci-après infection avec de nombreux virus, ou l&#39;exposition à l&#39;acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou un lipopolysaccharide (LPS) 4. Surtout, les virus les plus étudiés ont développé des mécanismes pour échapper à la réponse de IRF3 médiation, et ainsi échapper à l&#39;hôte de la défense immunitaire innée 5. Ainsi, le suivi de l&#39;activation IRF3 est d&#39;une grande importance pour comprendre les mécanismes moléculaires de la défense de l&#39;hôte antivirale innée, mais aussi d&#39;identifier la stratégie utilisée par les virus pour contrer cette réponse. ent &quot;&gt; De nombreux rapports publiés fournissent cependant seule une analyse limitée de l&#39;activation du IRF3 effectuée par la surveillance de l&#39;induction du gène IRF3-cible (IFNB1 et IFIT1) et / ou de dosage de gène rapporteur de luciférase couplée à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de Polyacrylamide à faible résolution de sodium (SDS- PAGE) analyse des IRF3. Cependant, de nombreuses études biochimiques, l&#39;analyse du comportement des différents mutants IRF3 et l&#39;élucidation de la structure cristalline de IRF3 6-11 ont contribué à établir que IRF3 est soumis à un ensemble complexe de modifications post-traductionnelles séquentielles par phosphorylation au plusieurs sites. L&#39;ensemble de phosphorylation impliqué dans l&#39;activation des IRF3 semble être dépendante de la stimulation et le plus probable sur le type cellulaire. Dans les cellules non infectées, IRF3 coexiste comme espèce non phosphorylés et hypophosphorylé contenant phosphoresidues, y compris Thr135 et Ser173, dans la 1 -198 aa région N-terminale 6,12-14. L&#39;accumulation de cette hypophosphorylé form de IRF3 est induite par des inducteurs de stress, des facteurs de croissance et des agents endommageant l&#39;ADN 6. La phosphorylation de résidus Ser / Thr dans la région C-terminale de IRF3 contenant le domaine de transactivation est déclenchée suite à l&#39;activation par des virus, le poly I: C, ou le LPS dans un type de cellules de manière dépendante de 15 à 17. C-terminal phosphorylation de IRF3 implique pas moins de 7 sites de phosphoacceptor distincts organisés en deux groupes principaux, Ser385 / Ser386 et Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, qui contribuent chacun à l&#39;activation de IRF3 par dimérisation, accumulation nucléaire, association avec le CREB protéine liant le (CBP) / co-activateurs p300, se liant à l&#39;IFN élément de réponse sensible (ISRE) des séquences consensus et la transactivation de gènes cibles 9,10,17-19 ADN. La phosphorylation de Thr390 est également pensé pour contribuer à IRF3 activation induite par le virus 20. Analyses de spectrométrie de masse IRF3 ont démontré que les résidus Ser386, Thr390, Ser396 et Ser402 sont directement phosphorylated par l&#39;inhibiteur de kinase kB ε (IKKε) / TANK contraignant kinase 1 (TBK1) kinases 9,10. Phosphorylation sur les résidus C-terminal est également nécessaire pour la terminaison de l&#39;activation de IRF3 travers polyubiquitination et le protéasome de dégradation 10. Ce processus est également dépendante de la phosphorylation sur Ser339, qui est nécessaire pour le recrutement du propyle isomérase Pin1 10,11. Espèces IRF3 contenant au moins phospho-Ser339 / 386/396 résidus sont considérés comme des formes hyperphosphorylées. La séquence exacte et la fonction de chaque site reste un sujet de discussion 10,21. Il est maintenant clair que IRF3 activé ne représente pas un état ​​homogène, mais que les différentes espèces activées présentant des caractéristiques de phosphorylation ou dimérisation distinctes existent 10,22. Pour fournir une compréhension complète de l&#39;activation de IRF3 en réponse à des agents pathogènes spécifiques, il est donc nécessaire de characterize laquelle des espèces activées sont induites. L&#39;induction de gènes cibles, de IRF3 IFNB1 et IFIT1, est révélée fournir une lecture fiable de l&#39;activation du IRF3. Toutefois, le suivi expression de ces gènes ne fait pas de distinction entre les différents états d&#39;activation du IRF3. Une analyse complète des états d&#39;activation IRF3 dans un contexte particulier repose sur la caractérisation détaillée de sa phosphorylation et dimérisation état ​​10. Phosphorylée (formulaire I), hypophosphorylée (forme II) et (hyperphosphorylées formes III et IV) de formes IRF3 6,18,23 peut être résolu avec succès par une mobilité réduite en haute résolution analyse SDS-PAGE. Espèces IRF3 monomères et dimères peuvent être efficacement identifiés par analyse PAGE natif. Ces approches sont grandement améliorées lorsqu&#39;il est utilisé en combinaison avec des anticorps dirigés contre les sites phosphospécifiques IRF3 de phosphoacceptor distinctes. Les protocoles standard permettent une faible résolution deprotéines qui ne permettent pas une séparation efficace des IRF3 distincte formes phosphorylée. Ici, nous décrivons en détail une procédure pour obtenir la plus haute résolution pour surveiller l&#39;induction d&#39;espèces IRF3 de virus activé distinctes en utilisant SDS-PAGE couplé à PAGE natif en combinaison avec immunoblot utilisant des anticorps totaux et phosphospécifiques. In vivo discrimination entre les différentes activé formes de IRF3 est effectuée sur la base de leurs quarts de mobilité observées sur SDS-PAGE. En outre, le monomère et le dimère IRF3 peuvent être distingués par électrophorèse non dénaturantes. La combinaison de ces deux techniques complémentaires avec immunotransfert révèle être une approche abordable et sensible à l&#39;acquisition de toutes les informations nécessaires pour une analyse complète de l&#39;activation de la phosphorylation médiée par IRF3.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Chaud dans un 37 &deg ; C avant utilisation.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA 0,25</td><td> %Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Virus de Sendai Souche Charles</td><td>River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>Coupez l’extrémité de la pointe et pipetez lentement car elle est très épaisse.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>Marque déposée correspondant à Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) détergent</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Activation de l’orthovanadate de sodium 0,2 M : 1) Ajuster le pH à 10,0 en utilisant soit 1 N NaOH, soit 1 N HCl. Le pH de départ de la solution d’orthotovanadate de sodium peut varier avec beaucoup de produit chimique. 2) La solution est jaune à pH 10,0. 3) Faire bouillir jusqu’à ce qu’il soit incolore. 5) Ajustez le pH à 10,0 et répétez les étapes 3 et 4 jusqu’à ce que la solution reste incolore et se stabilise à 10,0. Stocker les aliquotes d’orthovanadate de sodium activé à -20 °C.</td></tr><tr><td>phosphate de p-nitrophényle sel disodique hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-glycérophosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dosage des protéines Bio-Rad&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&nbsp ;</td><td>cytotoxique</td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 %</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp ;</td><td>cytotoxique</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp ;</td><td>Travailler sous hotte. Toxique et irritant.</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&nbsp ;</td><td>irritant.</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Toxique et irritant.</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Fonctionne sous hotte. Toxique pour le système nerveux, les muqueuses. Peut être toxique pour les voies respiratoires supérieures, les yeux, le système nerveux central.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&nbsp ;</td><td>irritant.</td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique (0,45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>Travail sous hotte. Toxique, irritant et inflammable.</td></tr><tr><td>Ponceau rouge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&nbsp ;</td><td>Pour la composition PBS pour immunoblot.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>Pour une composition PBS pour immunoblot.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&nbsp ;</td><td>Pour la composition PBS pour immunoblot.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Pour la composition de PBS-T-BSA pour immunoblot.</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly sorbate 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals</td><td>103168</td><td>Coupez l’extrémité de la pointe et pipetez lentement car elle est très épaisse.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>Stocker aliquote à -20 oC. Eviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Fait maison19</td><td></td><td>Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>4947s</td><td>Stocker à -20 oC.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Fait maison15</td><td></td><td>Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-full-length</td><td>Actif motif</td><td>39033</td><td>Store aliquote à -80 oC. Eviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Magasin aliquote à -20 oC.</td></tr><tr><td>Western Lightning Réactif de chimiluminescence Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini Appareil de caméra CCD</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Normes de poids moléculaire, large gamme</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Magasin aliquote à -20 oC.</td></tr></tbody></table>

a haute résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de irf3

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Le facteur de transcription IRF3 est essentiel pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes, principalement par le biais de l’interféron β et de l’expression des gènes antiviraux. Une analyse détaillée de l’activation d’IRF3 est essentielle pour comprendre comment les agents pathogènes induisent ou échappent à la réponse antivirale innée. Des formes activées distinctes d’IRF3 peuvent être distinguées en fonction de leur phosphorylation et de leur statut monomère vs dimère. La discrimination in vivo entre les différentes espèces activées d’IRF3 peut être réalisée par la séparation des formes phosphorylées d’IRF3 en fonction de leurs déplacements de mobilité sur SDS-PAGE. De plus, les niveaux de monomères et de dimères IRF3 peuvent être surveillés à l’aide d’une électrophorèse non dénaturante. Ici, nous détaillons une procédure pour atteindre la résolution la plus élevée afin d’obtenir le plus d’informations concernant l’état d’activation de l’IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps totaux et phosphospécifiques. Cette stratégie expérimentale constitue une approche abordable et sensible pour acquérir toutes les informations nécessaires à une analyse complète de l’activation d’IRF3 par la phosphorylation.

La figure 2 montre une image typique de immunoblot IRF3 détecté avec IRF3 anticorps totaux et des anticorps IRF3-phosphospécifiques contre Ser396 et Ser398 après la résolution de WCE par haute résolution SDS-PAGE. Dans les cellules non stimulées A549, IRF3 est détecté comme deux bandes à 50 et 53 kDa sur SDS-PAGE correspondant à la non-phosphorylée (formulaire I) et le hypophosphorylé (forme II) espèces de IRF3. L&#39;exposition des cellules A549 au SEV pour les 3 - 9 ré...

Nous décrivons ici une procédure permettant une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps phosphospécifiques.

A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

L’objectif global de cette procédure est de permettre une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés concernant la réponse immunitaire innée médiée par l’interféron. Par exemple, un agent pathogène active ou envahit l’expression de l’interféron bêta dépendant de l’IRF3.Le principal avantage de cette technique est qu’elle constitue une approche abordable et sensible pour distinguer les différentes formes activées par IRF3 qui peuvent survenir suite à différentes stimulations. Bien que cette méthode donne un aperçu de l’infection virale des cellules humaines, elle peut également être appliquée à des tissus de souris ou humains soumis à d’autres agents pathogènes ou à des motifs moléculaires associés à des agents pathogènes. Alexa Robitaille et Melissa Mariani, deux expertes en cellules Simulink de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Les cellules A549 utilisées dans cette procédure sont maintenues en culture dans une plaque de 15 centimètres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un milieu de jambon F-12K complet. Vingt-quatre heures avant l’infection, essayez de tester les cellules comme décrit dans le texte du protocole et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger à 350 x G pendant trois minutes à température ambiante.Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans huit millilitres de milieu de jambon F-12K complet pour obtenir une suspension monocellulaire homogène. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hécoctymètre, ensemencez les cellules à une densité de un fois dixième à six cellules par plaque de 60 millimètres, et quatre millilitres de milieu de jambon complet F-12K préchauffé. Incuber pendant 20 à 24 heures à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone.Après 20 à 24 heures, les cellules devraient former une monocouche confluente à 90 %. Retirez le milieu et lavez les cellules avec deux millilitres de milieu de jambon F-12K sans sérum, ou SFM. Ajouter deux millilitres de SFM frais par plaque de 60 millimètres.Diluer à décongelé l’aliquote du virus Sendai dans du SFM préchauffé pour obtenir 60 unités d’hémagglutination, ou HAU, par 100 microlitres. Mélangez en pipetant doucement de haut en bas, puis ajoutez 100 microlitres de virus dilué goutte à goutte dans chaque plaque pour effectuer l’infection à 40 HAU pour 10 à la sixième cellule. N’ajoutez pas de virus dans la plaque de contrôle non infectée.Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, soit cinq pour cent de dioxyde de carbone. Au cours de la première heure de l’infection, agitez les plaques à la main trois ou quatre fois. Deux heures après l’infection, ajouter deux millilitres de milieu de jambon F-12K contenant 20 % de chaleur et de FDS activés, pour obtenir une concentration finale de 10 % de chaleur et de FDS activés.Incuber les cellules dans l’incubateur pendant une, quatre et sept heures de plus pour atteindre des durées d’infection totales de trois, six et neuf heures respectivement. Les cellules seront récoltées à chacun de ces points pour la préparation d’extraits de cellules entières, comme le montre le segment vidéo suivant. Commencez cette procédure en retirant le milieu d’infection.Récoltez les cellules en grattant un millilitre de DPBS glacé. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre. Granulez les cellules par centrifugation à 16 000 x g à 4 degrés Celsius pendant 20 secondes.Et décantez soigneusement toute trace de DPBS. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 70 microlitres de tampon de lyse. Incuber sur glace pendant 20 minutes.Congelez le lysat par incubation dans un bain d’azote liquide pendant 15 secondes. Décongelez ensuite le lysat à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu. Vortex pendant dix secondes.Répétez ce cycle gel-dégel-vortex trois fois. Centrifugeuse à 16 000 x g à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférez le surnageant, qui est l’extrait cellulaire entier, dans un nouveau tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre.Il est important de garder les extraits cellulaires entiers sur de la glace à tout moment. Pour résoudre les extraits cellulaires entiers par SDS-PAGE à haute résolution, préparez trois gels d’électrophorèse dénaturants, deux gels de 16 centimètres pour la détection des formes IRF3 et un gel de 8,5 centimètres pour la détection des protéines du virus Sendai. Chargez 14 microlitres d’étalon de poids moléculaire dans un puits de chaque gel de 16 centimètres.Ensuite, chargez 30 microgrammes d’extrait de cellules entières dénaturées par puits des deux gels de 16 centimètres. Chargez sept microlitres d’étalon de poids moléculaire dans un puits de gel de 8,5 centimètres. Chargez huit à dix microgrammes d’extrait de cellules entières dénaturées par puits du gel de 8,5 centimètres.Faites fonctionner les gels à 30 milliampères de courant constant jusqu’à ce que le front de migration atteigne le bas du gel. La migration dure techniquement environ trois heures pour un gel de 16 centimètres et 45 minutes pour un gel de 8,5 centimètres. Commencez cette analyse en préparant un gel résolutif non dénaturant d’un minimum de 8,5 centimètres de longueur, en suivant la procédure décrite dans le texte du protocole.Appuyez sur l’appareil en marche dans la glace à peu près au niveau du tampon d’électrophorèse de la chambre inférieure, mais assurez-vous que le gel n’est pas dans la glace. Pré-exécutez le gel à 40 milliampères à courant constant pendant 30 minutes sur de la glace. Pendant la pré-exécution, mélangez les extraits cellulaires entiers conservés sur la glace un à un avec le tampon de chargement Two-X Native-PAGE.Immédiatement à la fin de la pré-course, chargez huit à dix microgrammes d’extrait de cellules entières sur le gel. Il est important de charger les échantillons près du fond du puits afin de ne pas perturber le banderolage. Faites fonctionner le gel à 25 milliampères de courant constant sur de la glace, comme il a été démontré pour la pré-course jusqu’à ce que le front de migration atteigne le bas du gel.Cela prendra environ 40 minutes. À la fin de tous les cycles de gel, les protéines sont transférées sur des membranes de nitrocellulose et fixées. La procédure de transfert est décrite dans le texte du protocole qui l’accompagne.Les trois membranes SDS-PAGE, mais pas la membrane Native-PAGE, sont colorées avec une solution rouge de Ponceau pour identifier les marqueurs de poids moléculaire. Après avoir incubé les quatre membranes de SDS-PAGE et Native-PAGE dans une solution bloquante, incubez les membranes avec les anticorps primaires selon l’ordre séquentiel indiqué dans ce schéma. Les membranes doivent subir cinq lavages de cinq minutes dans du PBS-T avant d’être incubées avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort.Après avoir éliminé les traces de préadolescente avec du PBS, incubez les membranes pendant une minute dans le volume de réactif de chimiluminescence amélioré suffisant pour couvrir complètement les membranes. Utilisez du papier filtre pour sécher les membranes, puis placez-les dans l’analyseur d’images luminescentes pour visualiser les bandes immunoréactives. Avant l’incubation avec les anticorps primaires suivants, lavez les membranes trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à chaque fois.Lorsqu’un stripping est nécessaire entre les anticorps, incuber les membranes dans une solution de stripping préchauffée à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes sous agitation régulière. Les détails de l’analyse par immunotransfert se trouvent dans le texte du protocole d’accompagnement. Voici une image immunoblot typique d’IRF3 détectée avec des anticorps totaux IRF3 et des anticorps phosphospécifiques IRF3 contre Ser396 et Ser398, après haute résolution d’extraits de cellules entières.Dans les cellules non stimulées, IRF3 est détecté comme deux bandes correspondant à l’espèce non phosphorylée et à l’espèce hypophosphorylée IRF3. L’exposition des cellules au virus Sendai entraîne un décalage dépendant du temps vers des formes hyperphosphorylées à migration lente des formes trois et quatre, qui sont également spécifiquement immunodétectées à l’aide des anticorps phosphospécifiques contre Ser396 et Ser398. La figure suivante montre un profil de détection d’IRF3 obtenu à partir d’extraits de cellules entières résolus par PAGE natif, suivi d’un immunotransfert utilisant des anticorps anti-IRF3 NES et d’anticorps phosphospécifiques contre Ser386.Dans les cellules non stimulées, IRF3 est détecté comme une seule bande correspondant à la forme momomérique. Lors de l’infection par le virus Sendai, les niveaux de monomère IRF3 diminuent avec une accumulation concomitante d’une bande migrant lentement qui correspond à la forme dimérique d’IRF3, qui est également spécifiquement immunodétectée à l’aide d’anticorps phosphospécifiques contre Ser386. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la composition et la longueur des différents gels sont essentielles pour obtenir une résolution appropriée des phosphoformes IRF3.Suite à cette procédure, d’autres méthodes, telles que la liaison à l’ADN ou les acides rapporteurs de gènes, peuvent être effectuées afin d’évaluer l’activité de l’IRF3. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de distinguer les différentes formes actives d’IRF3. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes peut être dangereux et que les manipulations doivent être effectuées conformément aux directives de biosécurité de votre établissement d’accueil.

a-high-resolution-method-to-monitor-phosphorylation-dependent

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

FRET basée sur les journalistes sont de plus en plus utilisées pour suivre les activités kinases et de phosphatases dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici une méthode sur la façon d'utiliser FRET basé journalistes afin d'évaluer le cycle cellulaire dépendante des changements dans la phosphorylation cible.

Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

Cette vidéo présente une technique de quantification sensible de la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test pull-down à molécule unique. La fonctionnalisation de la polyéthylène glycol-biotine et l’utilisation d’anticorps marqués augmentent la détection de la tyrosine phosphorylée avec spécificité.

Dosage par pull-down d’une seule molécule pour l’analyse de la phosphorylation des protéines : une technique à haut débit pour quantifier la phosphorylation des protéines dans le lysat cellulaire

Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Les tests de compétition peptidique sont largement utilisés dans une variété d'expériences moléculaires et immunologiques. Cet article décrit une méthode détaillée pour un test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro et les procédures de validation associées, qui peuvent être utiles pour trouver des sites de phosphorylation spécifiques.

Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

La présente étude décrit une méthode simple de détecter des taux endogènes de la phosphorylation de Rab10 de leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

Une méthode occidentale indigène de tache pour analyser le facteur réglementaire endogène d'interféron 5 dimerization dans la ligne de cellules dendritiques plasmacytoid de CAL-1 est décrite. Ce protocole peut également être appliqué à d'autres lignées cellulaires.

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analyse de la dimérisation Endogenous IRF5

Ce protocole décrit un test non radioactif pour mesurer l’activité de kinase des kinases de polynucléotide (PNK) sur de petits substrats d’ADN et d’ARN.

Essai non radioactif pour mesurer la phosphorylation polynucléotide des petits substrats nucléotides

L’activation de la kinase ser/Thr multifonctionnelle AURKA est caractérisée par son autophosphorylation sur Thr288. Les sondes fluorescentes s’appuyant sur FRET peuvent faire la distinction entre ses états inactif et activé. Ici, nous illustrons quelques stratégies pour l’ingénierie des sondes, ainsi qu’un protocole FRET rapide pour suivre l’activation des kinases tout au long de la mitose.

Surveillance en temps réel de l’activation de l’aurora kinase A à l’aide de biocapteurs FRET conformationnels dans des cellules vivantes

Les protocoles de dosage basés sur les cellules de transfert d’énergie de résonance de Förster résolues dans le temps sont décrits pour la quantification simple, spécifique, sensible et robuste du transducteur de signal phosphorylé endogène et de l’activateur de la transcription (STAT) 1/3/4/5/6 dans les lysats cellulaires dans un format de 384 puits.

Tests de transfert d’énergie par résonance de Förster à résolution temporelle pour la mesure des protéines STAT phosphorylées endogènes dans les cellules humaines

Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).

Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

Découvrez une méthode haute résolution pour analyser l'activation phosphorylée d'IRF3 en immunologie. Cette technique par SDS-PAGE et immunoblot permet de distinguer les différentes formes actives du facteur de transcription impliqué dans la réponse immunitaire innée.

A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

Explorer plus de vidéos