A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

L’objectif global de cette procédure est de permettre une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés concernant la réponse immunitaire innée médiée par l’interféron. Par exemple, un agent pathogène active ou envahit l’expression de l’interféron bêta dépendant de l’IRF3.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle constitue une approche abordable et sensible pour distinguer les différentes formes activées par IRF3 qui peuvent survenir suite à différentes stimulations. Bien que cette méthode donne un aperçu de l’infection virale des cellules humaines, elle peut également être appliquée à des tissus de souris ou humains soumis à d’autres agents pathogènes ou à des motifs moléculaires associés à des agents pathogènes. Alexa Robitaille et Melissa Mariani, deux expertes en cellules Simulink de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Les cellules A549 utilisées dans cette procédure sont maintenues en culture dans une plaque de 15 centimètres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un milieu de jambon F-12K complet. Vingt-quatre heures avant l’infection, essayez de tester les cellules comme décrit dans le texte du protocole et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger à 350 x G pendant trois minutes à température ambiante.

Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans huit millilitres de milieu de jambon F-12K complet pour obtenir une suspension monocellulaire homogène. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hécoctymètre, ensemencez les cellules à une densité de un fois dixième à six cellules par plaque de 60 millimètres, et quatre millilitres de milieu de jambon complet F-12K préchauffé. Incuber pendant 20 à 24 heures à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone.

Après 20 à 24 heures, les cellules devraient former une monocouche confluente à 90 %. Retirez le milieu et lavez les cellules avec deux millilitres de milieu de jambon F-12K sans sérum, ou SFM. Ajouter deux millilitres de SFM frais par plaque de 60 millimètres.

Diluer à décongelé l’aliquote du virus Sendai dans du SFM préchauffé pour obtenir 60 unités d’hémagglutination, ou HAU, par 100 microlitres. Mélangez en pipetant doucement de haut en bas, puis ajoutez 100 microlitres de virus dilué goutte à goutte dans chaque plaque pour effectuer l’infection à 40 HAU pour 10 à la sixième cellule. N’ajoutez pas de virus dans la plaque de contrôle non infectée.

Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, soit cinq pour cent de dioxyde de carbone. Au cours de la première heure de l’infection, agitez les plaques à la main trois ou quatre fois. Deux heures après l’infection, ajouter deux millilitres de milieu de jambon F-12K contenant 20 % de chaleur et de FDS activés, pour obtenir une concentration finale de 10 % de chaleur et de FDS activés.

Incuber les cellules dans l’incubateur pendant une, quatre et sept heures de plus pour atteindre des durées d’infection totales de trois, six et neuf heures respectivement. Les cellules seront récoltées à chacun de ces points pour la préparation d’extraits de cellules entières, comme le montre le segment vidéo suivant. Commencez cette procédure en retirant le milieu d’infection.

Récoltez les cellules en grattant un millilitre de DPBS glacé. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre. Granulez les cellules par centrifugation à 16 000 x g à 4 degrés Celsius pendant 20 secondes.

Et décantez soigneusement toute trace de DPBS. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 70 microlitres de tampon de lyse. Incuber sur glace pendant 20 minutes.

Congelez le lysat par incubation dans un bain d’azote liquide pendant 15 secondes. Décongelez ensuite le lysat à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu. Vortex pendant dix secondes.

Répétez ce cycle gel-dégel-vortex trois fois. Centrifugeuse à 16 000 x g à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférez le surnageant, qui est l’extrait cellulaire entier, dans un nouveau tube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre.

Il est important de garder les extraits cellulaires entiers sur de la glace à tout moment. Pour résoudre les extraits cellulaires entiers par SDS-PAGE à haute résolution, préparez trois gels d’électrophorèse dénaturants, deux gels de 16 centimètres pour la détection des formes IRF3 et un gel de 8,5 centimètres pour la détection des protéines du virus Sendai. Chargez 14 microlitres d’étalon de poids moléculaire dans un puits de chaque gel de 16 centimètres.

Ensuite, chargez 30 microgrammes d’extrait de cellules entières dénaturées par puits des deux gels de 16 centimètres. Chargez sept microlitres d’étalon de poids moléculaire dans un puits de gel de 8,5 centimètres. Chargez huit à dix microgrammes d’extrait de cellules entières dénaturées par puits du gel de 8,5 centimètres.

Faites fonctionner les gels à 30 milliampères de courant constant jusqu’à ce que le front de migration atteigne le bas du gel. La migration dure techniquement environ trois heures pour un gel de 16 centimètres et 45 minutes pour un gel de 8,5 centimètres. Commencez cette analyse en préparant un gel résolutif non dénaturant d’un minimum de 8,5 centimètres de longueur, en suivant la procédure décrite dans le texte du protocole.

Appuyez sur l’appareil en marche dans la glace à peu près au niveau du tampon d’électrophorèse de la chambre inférieure, mais assurez-vous que le gel n’est pas dans la glace. Pré-exécutez le gel à 40 milliampères à courant constant pendant 30 minutes sur de la glace. Pendant la pré-exécution, mélangez les extraits cellulaires entiers conservés sur la glace un à un avec le tampon de chargement Two-X Native-PAGE.

Immédiatement à la fin de la pré-course, chargez huit à dix microgrammes d’extrait de cellules entières sur le gel. Il est important de charger les échantillons près du fond du puits afin de ne pas perturber le banderolage. Faites fonctionner le gel à 25 milliampères de courant constant sur de la glace, comme il a été démontré pour la pré-course jusqu’à ce que le front de migration atteigne le bas du gel.

Cela prendra environ 40 minutes. À la fin de tous les cycles de gel, les protéines sont transférées sur des membranes de nitrocellulose et fixées. La procédure de transfert est décrite dans le texte du protocole qui l’accompagne.

Les trois membranes SDS-PAGE, mais pas la membrane Native-PAGE, sont colorées avec une solution rouge de Ponceau pour identifier les marqueurs de poids moléculaire. Après avoir incubé les quatre membranes de SDS-PAGE et Native-PAGE dans une solution bloquante, incubez les membranes avec les anticorps primaires selon l’ordre séquentiel indiqué dans ce schéma. Les membranes doivent subir cinq lavages de cinq minutes dans du PBS-T avant d’être incubées avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort.

Après avoir éliminé les traces de préadolescente avec du PBS, incubez les membranes pendant une minute dans le volume de réactif de chimiluminescence amélioré suffisant pour couvrir complètement les membranes. Utilisez du papier filtre pour sécher les membranes, puis placez-les dans l’analyseur d’images luminescentes pour visualiser les bandes immunoréactives. Avant l’incubation avec les anticorps primaires suivants, lavez les membranes trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à chaque fois.

Lorsqu’un stripping est nécessaire entre les anticorps, incuber les membranes dans une solution de stripping préchauffée à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes sous agitation régulière. Les détails de l’analyse par immunotransfert se trouvent dans le texte du protocole d’accompagnement. Voici une image immunoblot typique d’IRF3 détectée avec des anticorps totaux IRF3 et des anticorps phosphospécifiques IRF3 contre Ser396 et Ser398, après haute résolution d’extraits de cellules entières.

Dans les cellules non stimulées, IRF3 est détecté comme deux bandes correspondant à l’espèce non phosphorylée et à l’espèce hypophosphorylée IRF3. L’exposition des cellules au virus Sendai entraîne un décalage dépendant du temps vers des formes hyperphosphorylées à migration lente des formes trois et quatre, qui sont également spécifiquement immunodétectées à l’aide des anticorps phosphospécifiques contre Ser396 et Ser398. La figure suivante montre un profil de détection d’IRF3 obtenu à partir d’extraits de cellules entières résolus par PAGE natif, suivi d’un immunotransfert utilisant des anticorps anti-IRF3 NES et d’anticorps phosphospécifiques contre Ser386.

Dans les cellules non stimulées, IRF3 est détecté comme une seule bande correspondant à la forme momomérique. Lors de l’infection par le virus Sendai, les niveaux de monomère IRF3 diminuent avec une accumulation concomitante d’une bande migrant lentement qui correspond à la forme dimérique d’IRF3, qui est également spécifiquement immunodétectée à l’aide d’anticorps phosphospécifiques contre Ser386. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la composition et la longueur des différents gels sont essentielles pour obtenir une résolution appropriée des phosphoformes IRF3.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, telles que la liaison à l’ADN ou les acides rapporteurs de gènes, peuvent être effectuées afin d’évaluer l’activité de l’IRF3. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de distinguer les différentes formes actives d’IRF3. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes peut être dangereux et que les manipulations doivent être effectuées conformément aux directives de biosécurité de votre établissement d’accueil.