A Quantitative Glycomics et protéomique Stratégie Purification Combined

L’objectif global de ce flux de travail basé sur un filtre unique est de purifier facilement et quantitativement les N-glycanes et les protéines en tandem à partir d’échantillons biologiques issus d’une analyse par spectrométrie de masse. L’évolutivité, la rapidité et la reproductibilité analytique de cette méthode la rendent directement accessible en termes de ressources et de compétences aux laboratoires de spectrométrie de masse biologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs d’étudier simultanément la glycomique, l’occupation du site de glycosylation et la protéomique dans le cadre d’études biologiques à grande échelle et à haut débit.

Nous avons surmonté les défis des mesures de N-glycanes en couplant cette méthode à une stratégie de dérivitation adaptée à la spectrométrie de masse, ce qui a permis d’obtenir une quantification précise et relative entre le cancer et les états témoins. Avec une variabilité analytique réduite, de nouvelles interactions biologiques peuvent être élucidées entre le glycome et le protéome, ce qui permet d’obtenir des informations clés sur les états pathologiques et de nouvelles opportunités de découverte de biomarqueurs. Pour commencer, chargez 2,5 microlitres de plasma sur un filtre.

Ensuite, ajoutez 2 microlitres de solution de dithiothréitol 1M à chaque échantillon dans le filtre. Diluer l’échantillon avec 200 microlitres de tampon de digestion PNGase de bicarbonate d’ammonium de 100 mM. Boucher le tube d’échantillonnage du filtre et agiter légèrement le vortex, en prenant soin de ne pas déranger le filtre de son siège.

Incuber l’échantillon à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes pour dénaturer les protéines et les glycoprotéines. Pour alkiler les échantillons, ajoutez 50 microlitres d’iodoacétamide 1M pour obtenir une concentration finale d’environ 200 mM. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Concentrez la glycoprotéine dénaturée sur le filtre en centrifugeant les échantillons à 14 000 x g pendant 40 minutes avant de jeter le flux. Lavez l’échantillon avec 100 microlitres de tampon de digestion PNGase. Concentrez la glycoprotéine sur le filtre et jetez le flux.

Répétez l’étape de lavage et de concentration deux fois pour un total de trois fois, ce qui donne un concentré dans le volume mort du filtre. Jetez tout le flux et le flacon de collecte une fois les lavages terminés. Ensuite, ajoutez 2 microlitres de peptide sans glycérol N-glycosidase F ou PNGase F dans le filtre après le transfert dans un flacon de collecte frais.

Ajoutez 98 microlitres de tampon de digestion PNGase, ce qui porte le volume total à 100 microlitres, et pipetez doucement de haut en bas sur le filtre pour mélanger. Pour le protocole de pointe de digestion, incubez les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 2 heures. En travaillant rapidement, retirez les échantillons et ajoutez 2 microlitres supplémentaires de PNGase F sans glycérol. Agitez légèrement les échantillons pendant 1 à 2 secondes pour mélanger.

Incuber les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 2 heures supplémentaires. Après avoir éludé les glycanes en centrifugeant l’échantillon à 20 degrés Celsius, ajoutez 100 microlitres de tampon de digestion PNGase dans le filtre et centrifugez à nouveau. Recueillir le nettoyant contenant tout glycane lié à l’azote restant dans le même flacon de collecte que l’éluant.

Après avoir répété deux fois, retirez le filtre et placez-le dans un nouveau flacon de collecte pour la préparation protéomique. Ensuite, incubez les échantillons de glycane dans le congélateur à 80 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes jusqu’à ce qu’ils soient congelés. Ensuite, sécher jusqu’à la fin à température ambiante dans un concentrateur sous vide pendant 4 à 6 heures.

Rincez le filtre contenant les peptides désanimés avec 400 microlitres de tampon d’urée 8M. Boucher le flacon de prélèvement et agiter légèrement pour mélanger. Concentrez les peptides sur le filtre avant de jeter tout le flux.

Après avoir répété le lavage du tampon d’urée deux fois de plus, rincez le filtre contenant les peptides désanimés avec le tampon de digestion de trypsine. Boucher le flacon de prélèvement et mélanger légèrement au tourbillon avant de se concentrer à nouveau sur le filtre comme auparavant. Jetez tout le débit et répétez 2 fois de plus pour un total de 3 lavages de tampon de digestion de trypsine.

Rassemblez tous les futurs éluants et lavages dans un nouveau flacon de collecte. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de trypsine modifiée porcine dans un rapport trypsine/protéine de 1:50 pour la protéomique de découverte ou un rapport trypsine/protéine de 1:5 pour les expériences de protéomique quantitative. Boucher le flacon de prélèvement et agiter légèrement pour mélanger.

Après avoir incubé les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 2 heures, travaillez rapidement pour retirer les échantillons et injecter 50 microlitres supplémentaires de trypsine au rapport trypsine/protéine approprié. Agitez légèrement les échantillons pendant 1 à 2 secondes pour les mélanger. Ensuite, incubez à 50 degrés Celsius pendant 2 heures supplémentaires.

Après l’élution des peptides par centrifugation comme précédemment pendant 20 minutes, rincez les peptides restants du filtre avec un tampon de trempe. Éluer le filtre en le centrifugeant comme précédemment pendant 15 minutes. Après avoir quantifié la concentration de peptides dans les échantillons, incubez les échantillons de peptides dans le congélateur à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient congelés.

Ensuite, sécher jusqu’à la fin à température ambiante dans un concentrateur sous vide pendant 4 à 6 heures. Puis les protéines tryptiques juste avant l’analyse par chromatographie liquide, spectrométrie de masse ou LCMS en phase A mobile jusqu’à la concentration souhaitée. Les concentrations de peptides tryptiques à partir d’un plasma de 2,5 microlitres varient de 100 à 300 nanogrammes par microlitre.

Avant l’analyse des glycanes, reconstituer les réactifs de benzohydrazide de 4-phénéthyl marqués à l’isotope stable séché, ainsi que les réactifs natifs de P2GPN dans un millilitre de solution de dérivitation pour une concentration finale de 0,25 milligramme par millilitre. La solubilisation complète des réactifs prend jusqu’à 10 minutes. Vortex étendu pour assurer une solubilisation complète.

Étiquetez les N-glycanes séchés avec 200 microlitres de réactif P2GPN marqué à des isotopes stables ou natif. Pipetez de haut en bas pour remettre en suspension les glycanes séchés. Ensuite, vortex les échantillons et faites-les tourner pendant environ 5 secondes sur une centrifugeuse de paillasse.

Faites réagir les glycanes avec le réactif pendant 3 heures à 56 degrés Celsius. Transférez immédiatement les glycanes de l’incubateur vers le concentrateur sous vide et séchez-les jusqu’à ce qu’ils soient terminés à 55 degrés Celsius pendant 3 à 5 heures. Remettre en suspension le N-glycane marqué dans 25 à 50 microlitres d’eau juste avant l’analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse.

Pipeter de haut en bas pour s’assurer que les N-glycanes sont complètement solubilisés. Après avoir centrifugé les échantillons comme précédemment pendant 5 minutes, retirez le surnageant en faisant attention de ne pas laisser la pointe de la pipette toucher le fond du tube de centrifugation. Combinez une paire d’échantillons marqués par des isotopes natifs et stables dans un rapport de 1:1 pour une analyse en tandem de quantification relative.

Préparez 2 méthodes LCMS différentes pour les flux de travail protéomique et glycomique. Pour l’analyse des protéines, injectez environ 400 nanogrammes de protéines dans la colonne de NPA. Analysez l’échantillon à 300 nanolitres par minute, avec une équilibration en pré-colonne de 1 microlitre et une équilibration en colonne analytique de 5 microlitres.

Ioniser les protéines dans les conditions MS fournies dans le protocole texte. Pour l’analyse des glycanes, injectez 5 microlitres d’échantillons d’équi-M marqués au P2GPN et marqués à des isotopes stables dans la colonne. Analysez l’échantillon à 300 nanolitres par minute avec une équilibrage de pré-colonne de 2 microlitres et une équilibrage de colonne analytique de 5 microlitres.

Ensuite, ionisez les glycanes dans les conditions MS fournies dans le protocole textuel. Le protocole de purification par filtre a été comparé à la méthode standard d’extraction en phase solide, et les abondances de glycanes plasmatiques détectées entre les 2 protocoles n’étaient pas significativement différentes. Dans les deux méthodes, les mêmes glycanes se trouvent près de la limite de détection où la variabilité augmente.

L’intervariabilité pour les mélanges equiM de plasma purifié par le protocole d’extraction par filtre ou en phase solide standard a été évaluée. Les deux protocoles avaient des distributions gaussiennes dont les moyennes n’étaient pas significativement différentes de zéro. 80 % des glycanes sont tombés dans un double changement.

Les distributions de poids moléculaire des glycanes détectées dans les nouveaux protocoles de purification traditionnels n’étaient pas significativement différentes et couvraient la même gamme. Qualitativement, aucun biais entre les glycanes n’a été observé. Les protéines plasmatiques ont été préparées par une préparation d’échantillon standard assistée par filtre et plusieurs protocoles en ligne.

Le nombre de protéines identifiées était similaire pour les différents protocoles. La désamidation non spécifique a été contrôlée dans les protocoles de digestion par micro-ondes et d’indigestion de pointe à moins de 10 %. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’occupation précise du site de glycosylation dépend de la minimisation de l’exposition à la chaleur et du temps.

Une fois maîtrisée, la purification en ligne du pecurikene N-glycane peut être réalisée en 2 jours. En suivant cette procédure, la quantification précise des N-glycanes protéiques et l’occupation du site de glycosylation peuvent être intégrées et modélisées à l’aide de techniques statistiques d’ordre supérieur. Cette technique permet de relire rapidement le langage complexe de la biologie du cancer, de comparer quantitativement les différences dans les thérapies protéiques et de révéler véritablement l’importance de la glycosylation dans un contexte biologique.