Name: A Quantitative Glycomics et protéomique Stratégie Purification Combined (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez une méthode de purification simultanée des N-glycanes et protéines plasmatiques par LC-MS/MS. Ce protocole haut débit améliore la quantification glycomique et facilite les études biologiques à grande échelle.

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Cette recherche a été généreusement financée par le programme NIH NCI IMAT Grant R33 (CA147988-02), le NIH NIGMS Graduate Training in Molecular Biotechnology à NC State Grant (T32GM008776), le US Dept. of Education GAANN Fellowship Program in Molecular Biotechnology à NC State Grant (P200A140020), la Fondation W.M. Keck et l’Université d’État de Caroline du Nord. Le plasma de poule a été obtenu avec l’aide du Dr James N. Petitte et de Rebecca Wysocky du département des sciences avicoles de l’Université d’État de Caroline du Nord.

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<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
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Nous avons une relation de collaboration avec Cambridge Isotope Laboratories (CIL) pour diffuser le réactif et la technologie P2GPN à l’ensemble de la communauté scientifique sous la forme d’un produit (GTK-1000). Cependant, nous ne recevons aucun revenu basé sur la vente de ce produit.

Des méthodes quantitatives à haut débit sont nécessaires pour faciliter l’analyse de routine des glycanes. Au cours des trente dernières années, l’analyse glycomique a été limitée à un sous-ensemble de groupes de recherche, malgré son importance dans les maladies, les applications cliniques et les produits pharmaceutiques. La méthode de purification et de marquage FANGS-P2GPN pour la glycomique et la protéomique effectue la même analyse sur une seule aliquote d’échantillon, réduisant ainsi le coût des fournitures et la quantité de matériel nécessaire (particulièrement important dans les études humaines et murines). De plus, les efforts visant à minimiser la variabilité des préparations sont d’une importance cruciale, car chaque étape supplémentaire contribue à l’erreur, masquant potentiellement des changements importants mais peu abondants dans les études cas-témoins. Le couplage des FANGS au marquage hydrophobe des hydrazides permet d’analyser des échantillons de protéines et de glycanes sur la même colonne RPLC, améliore l’ionisation des glycanes, permet une quantification relative et peut être appliqué quantitativement au plasma.
Pour l’analyse des N-glycanes, il est essentiel d’utiliser le niveau suggéré de PNGase F pour obtenir une déglycosylation complète. Bien que les glycanes soient exposés aux solvants, la dénaturation des protéines et l’excès d’enzymes aident à assurer un clivage efficace et complet. Pour une quantification précise des glycanes, il est nécessaire de s’assurer qu’ils sont complètement séchés après la dérivatisation afin d’éteindre la réaction et d’éviter les réactions croisées lors du mélange des espèces NAT et SIL. Enfin, lors de l’extension du flux de travail à l’analyse de glycosite, le timing des étapes est essentiel pour minimiser la désamidation non spécifique. Les protocoles modifiés prévoyaient que l’analyse combinée de la glycomique et de la protéomique fonctionnait de manière cohérente lorsqu’elle était effectuée en conséquence.
Le flux de travail permet d’obtenir une quantification relative précise des N-glycanes à partir du plasma par rapport à la méthode SPE de référence. Il n’y a pas de biais apparent dans les types de glycanes extraits en termes de poids moléculaire, d’hydrophilie et de structure de composition. Bien que nous n’ayons pas exploré l’analyse qualitative des glycanes liés à l’O, nous nous attendons à ce que FANGS puisse s’adapter à l’ajout d’une étape de β-élimination après la digestion de la PNGase F des glycanes liés à l’N. Cependant, les procédures nécessiteraient des modifications importantes pour le nettoyage des réactifs avant la spectrométrie de masse, et l’analyse des peptides serait considérablement affectée. Pour la protéomique, la même profondeur de couverture du protéome est obtenue par rapport aux méthodes FASP traditionnelles. Il est important de noter que les méthodes permettent d’obtenir un taux minimal de fausses découvertes pour la désamidation des N-glycanes. Bien que la méthode soit compatible avec le marquage 18O de l’Asn lors de l’étapede digestion PNGase 22,23, le faible taux de fausses découvertes au site de glycosylation suggère qu’elle n’est peut-être pas nécessaire, ce qui réduit encore les coûts et la complexité.
Le protéome n’est pas enrichi en glycoprotéines dans cette méthode, ce qui présente à la fois des avantages et des inconvénients. Certaines glycoprotéines peu abondantes peuvent ne pas être détectées dans l’analyse. Cependant, l’occupation des sites glycosylés par protéine peut être comparée entre les échantillons biologiques. De plus, l’erreur et le biais introduits par la purification de l’affinité des lectines ou l’enrichissement chimique sont éliminés. En conclusion, le couplage de FANGS à la normalisation de l’individualité lors du marquage avec des marqueurs d’hydrazide de glycane permet d’obtenir une méthode simplifiée, quantitative et à haut débit pour l’analyse en tandem du glycome et du protéome avec un grand potentiel d’application dans les études cliniques cas-témoins.

Dans le domaine de la protéomique, filtre aidé la préparation de l&#39; échantillon (FASP) a été largement adopté pour sa capacité à réduire la quantité de matériau de départ, diminuer l&#39; échantillon des artefacts de préparation, et de maximiser le débit d&#39; échantillons 1. Cependant, une telle méthode n&#39;a pas encore d&#39;émerger et de gagner du terrain pour le domaine de la glycomique. Développement de haut débit, les flux quantitatifs sont nécessaires en raison du rôle essentiel de la glycosylation dans la défense biologique et sa modulation par le cancer ou les maladies 2,3. Chez les mammifères, N -glycans sont composées de motifs répétitifs saccharides (hexoses (Hex), hexosamines (HexNAc), acides sialique (NeuAc), et fucoses (Fuc)), qui décorent une structure de noyau (Hex 3 HexNAc 2) 4 à liaison covalente asparagine. Bien que le glycospace est considérablement élevée lorsque les isomères sont comptés (&gt; 10 12), il est tout à fait petite sur une base de la composition et les poids moléculaires varient généralement de 1,000-8,000 Da 5 &lt;/ Sup&gt;. L&#39;homogénéité de la composition de la classe et l&#39;hydrophilie de glycanes posent des défis uniques pour la purification, la séparation et la spectrométrie de masse (MS) workflows 6. Traditionnellement, N -glycans sont digérées à partir des protéines ou des peptides par le peptide N -glycosidase F (PNGase F), puis enrichi par chromatographie d&#39;affinité sur lectine 7, capturé par des billes 8 hydrazide ou purifiés par extraction en phase solide (SPE) 9,10. Bien que ces méthodes sont très efficaces, ils introduisent des étapes supplémentaires pour le dessalage et de limiter le nombre d&#39;échantillons traités simultanément. Au cours de la dernière décennie, un certain nombre de plates-formes à haut débit pour glycomique ont été proposées. Kim et al. , Publié un procédé semi-automatisé à l&#39; aide, d&#39; une plaque SPE de 96 puits à commande par aspiration 11. Alternativement, une méthode d&#39; affinité-filtre (N -glyco-FASP) a été développé par le groupe Mann, qui a nécessité la dérivation initiale de la filtre avec un composite de lectines 12. Enfin, le groupe Thomas-Oates a proposé une méthode semi-quantitative, le filtre Aided N Séparation -Glycan (FANGS), qui exploitait la taille étroite de composition du glycospace 13. En se fondant sur ​​les filtres coupe-off poids moléculaire, de petits contaminants ont d&#39; abord été lavés à perdre et ensuite les -glycans N ont été digérés et élues. protéines déglycosylée restent sur le filtre dans ce protocole et peuvent être soumis à FASP en ligne. Identification et quantification des glycanes par ionisation électrospray (ESI) MS exige des séparations hors ligne pour (partielle) la résolution des isomères et dérivatisation pour la détection d&#39;espèces à faible abondance. Marquer l&#39;individualité quand la normalisation avec la stratégie de balises hydrazide glycanes confère une compatibilité avec la chromatographie liquide en phase inverse (RECH) 14,15. Le 4-phénéthyl-benzohydrazide (P2PGN) tag hydrophobe médie l&#39;hydrophilie des glycanes, enhFINANCEZ ionisation par, en moyenne, quatre fois 16. Bien que d&#39; autres techniques, telles que perméthylation ou 17 chimies de marquage amine réactive 18, présentent des avantages similaires hydrazide dans la réaction, on fait réagir glycanes 1: 1 stoechiométriquement dans des conditions faciles. Quantification relative est obtenue par l&#39; analyse en tandem d&#39;échantillons dérivés avec native (NAT) ou 13 C 6 étiquettes stabile isotopiques (SIL). La méthode suivante évolue FANGS pour les applications de plasma et les couples à l&#39;étiquette hydrophobe P2GPN pour la quantification relative précise. En outre, il a été conçu pour effectuer la protéomique shot-gun, désamidation profilage, et glycomique quantitatives sur une seule aliquote de l&#39;échantillon, sans compromettre l&#39;intégrité des analyses.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique (50 %)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile, grade HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp ;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Bradford</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>B6916</td><td>Alternative : Kit d’acide bicchoninique (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>Les centrifugeuses alternatives qui atteignent 14 000 x g conviennent</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol, 1&nbsp ; M en solution</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>Les LC alternatifs nano ou ultra haute pression produiront des données similaires, telles que : 1. Dionex UltiMate&Ograve ; 3000 LC (Thermo Scientific) ; 2. Acquity UPLC (Waters).</td></tr><tr><td>Rack à tubes flottants</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp Fours de laboratoire standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>Incubateurs alternatifs atteignant 56 &deg ; C conviennent à</td></tr><tr><td>l’acide formique</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE Four à micro-ondes</td><td>General Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>Tout four à micro-ondes avec des réglages de puissance réglables convient</td></tr><tr><td>INLIGHT Glycane Kit d’étiquetage&nbsp ;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>Le kit INLIGHT fournit des versions NAT et SIL du réactif P2GPN.</td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &�ring ;, C18 phase stationnaire en vrac</td><td>Phenomenex&nbsp ;</td><td>Alternative aux supports en vrac</td><td>: Tout C18 phase stationnaire 5 mM</td></tr><tr><td>Mascot Daemon Software et Server</td><td>Matrix Science</td><td></td><td>Alternative : Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>Méthanol, grade HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp ;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Colonne auto-pack : 360&nbsp ; &#956 ; m, OD 75&nbsp ; &#956 ; m ID, 15&nbsp ; &#956 ; pointe m, non enduite, 5 par boîte, 50 cm</td><td>Nouvel objectif</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F (sans glycérol), 75 000&nbsp ; unités/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Spectromètre de masse</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Alternate haute précision de masse (5&nbsp ; ppm) fournira des données similaires</td></tr><tr><td>RNase B</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine du pancréas</td><td>porcin Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur sous videSavant SPD131DDA Concentrateur SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>Les concentrateurs sous vide alternatifs conviennent Vivacon</td></tr><tr><td>500 30 kDa Filtres&nbsp ;</td>Alternative <td>à la VN01H22</td> <td>Sartorius Stedim Biotech</td> : unités de <td>filtration centrifuge Amicon Ultra 0.5 avec Ultracel-10&nbsp ; Membrane kDa (Millipore UFC501096)</td></tr><tr><td>Eau, grade HPLC</td><td>Burdick & Jackson&nbsp ;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>Eau, 18O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>L’ajout de 18O dans l’étape de digestion PNGase F est facultatif et peut ne pas être nécessaire pour les études de désamidation réalisées avec un degré de confiance de 95 %</td></tr><tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent Test Kit</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative glycomics et protéomique stratégie purification combined

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

Il y a un désir croissant dans les sciences biologiques et cliniques d’intégrer et de corréler plusieurs classes de biomolécules pour démêler la biologie, définir les voies, améliorer le traitement, comprendre la maladie et aider à la découverte de biomarqueurs. La glycosylation liée à l’azote est l’une des modifications post-traductionnelles les plus importantes et les plus robustes des protéines et régule les fonctions cellulaires critiques telles que la signalisation, l’adhésion et la fonction enzymatique. Les techniques analytiques de purification et d’analyse des N-glycanes sont restées relativement statiques au cours de la dernière décennie. Bien que précis et efficaces, ils nécessitent généralement une expertise et des ressources importantes. Bien que certains systèmes de purification à haut débit aient été développés, ils n’ont pas encore été largement adoptés et reposent souvent sur l’enrichissement en glycopeptides. Une méthode prometteuse, développée par Thomas-Oates et al., la séparation des N-glycanes assistée par filtre (FANGS), a été démontrée qualitativement sur des tissus. Ici, nous avons adapté FANGS au plasma et l’avons couplé à la normalisation de l’individualité lors du marquage avec des marqueurs d’hydrazide de glycane afin d’obtenir une quantification relative précise par chromatographie liquide, spectrométrie de masse et ionisation par électronébulisation améliorée. De plus, nous avons conçu de nouvelles fonctionnalités pour le protocole en réalisant une analyse en tandem, en protéomique et en site de glycosylation sur du plasma de poule. Nous avons montré que les N-glycanes purifiés sur filtre et dérivés par des marqueurs d’hydrazide hydrophobes étaient comparables en termes d’abondance et de classe à ceux par extraction en phase solide (SPE) ; Ce dernier est considéré comme une référence dans le domaine. Il est important de noter que la variabilité entre les deux protocoles n’était pas statistiquement différente. Les données protéomiques recueillies en ligne avec les données glycomiques avaient la même profondeur qu’une digestion standard à la trypsine. La désamidation peptidique est minimisée dans le protocole, limitant la désamidation non spécifique détectée aux motifs de glycosylation. Cela a permis une analyse directe du site de glycosylation, bien que le protocole puisse également prendre en charge le marquage du site 18O. Dans l’ensemble, nous avons fait la démonstration d’un nouveau protocole en ligne, à haut débit, non biaisé et basé sur un filtre pour l’analyse quantitative de la glycomique et de la protéomique.

<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> Figure 1:. Le schéma de la méthode FANGS-P2GPN marquage hydrophobe couplé (méthode A) pour la protéomique et glycomique combinés analyse est donnée étapes qui diffèrent entre glycomique-seulement le traitement et tandem glycomique et analyse protéomique, avec l&#39; identification des sites de glycosylation, sont mis en évidence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> L&#39;en-ligne protéomique et glycomique, P2GPN méthode de marquage hydrophobe à base de filtre (méthode A) a été validée pour l&#39; identification, la quantification, et le biais de poids moléculaire en utilisant des échantillons de plasma de poule groupée (figure 1). Pour uniquement glycomique expériences, inter-comparaisons dans les abondances de N -glycans extraites par la méthodeA à Carbograph SPE (étalon-or, méthode B) ont été faites (Figure 2). Il n&#39;y avait aucune différence significative dans les abondances de glycanes entre les deux méthodes. La variabilité intra a également été évaluée par la quantification de la SIL: NAT rapport de glycanes obtenus par la même méthode. Le log 2 -distributions des deux méthodes étaient gaussienne, centrée sur zéro, et non significativement différents (figure 3A-B). Le poids moléculaire se situe entre les deux protocoles complètement superposées, ce qui suggère que le filtre ne discriminait pas N -glycans basée sur la gamme de poids moléculaire et hydrophilie (Figure 4). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> Figure 2: Un mélange équimolaire de NAT et SIL N -glycans extrait par la méthode A ou B a été préparé à partir de 2,5 pi de poule plasma (N = 4) Les échantillons ont été anal.yzed par UPLC-MS selon les paramètres recommandés suggérés dans la section 6. Les abondances pour chaque glycane, dans chaque canal NAT / SIL, ont été calculés en intégrant la zone sous le chromatogramme ionique extrait (MMA = 3 ppm), la correction de la molécule poids de chevauchement, et l&#39;ajustement par le TGNF. Ces ratios sont présentés avec leurs erreurs standard. Les abondances de la Méthode B: Méthode A N -glycans sont pas significativement différentes (p&gt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> Figure 3: La variabilité intra-en (A) Méthode A (N = 133) ou (B) Méthode B (n = 123) des stratégies ont été comparées. NAT et SIL mélanges équimolaires de N -glycans, du même schéma d&#39;extraction, Ont été analysés sur trois répétitions techniques. Le journal 2 -distributions étaient centrés sur zéro et ne sont pas significativement différents entre les deux flux de travail. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> Figure 4: Les gammes de poids moléculaires de glycanes à partir de chacune de ces stratégies ont été comparées. Les deux flux de travail ont donné glycanes couvrant la même gamme de poids moléculaire. N -glycans détecté dans un protocole par rapport à l&#39;autre est tombé juste au- dessus de la limite de détection (1 × 10 5 abondance) et ne reflètent pas de biais systématique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.dans les pages = &quot;1&quot;&gt; Rétention des protéines déglycosylées par le filtre de poids moléculaire activé en ligne protéome analyse et site de glycosylation large identification. De nombreux protocoles pour la purification combinée des glycanes et des protéines ont été comparées à une préparation traditionnelle , sans FASP déglycosylation (tableau 5). Notre typique filtre 18 h base PNGase F de digestion, suivie par FASP trypsine digest (protocole Std) a donné lieu à des niveaux significatifs de désamidation non spécifique, ce qui peut interférer avec l&#39;identification des glycosites. Par conséquent, un procédé utilisant un temps d&#39;incubation plus courte à une température élevée (50 ° C) et une étape de pointe dans la PNGase F (protocole SPI) a été étudiée comme une alternative, ainsi qu&#39;un protocole de micro-ondes de digestion (protocole MD), pour réduire au minimum la non- désamidation spécifique. Les glycanes observées dans les nouvelles méthodes de digestion ne sont pas significativement différents dans les compositions ou les abondances de 18 h standard, 37 ° C filtre PNGase F digest ( <strong&gt; La figure 5). Combiné avec une incubation de trypsine courte, désamidation non spécifique a été réduite de manière significative, avec un taux de faux positifs glycosites &lt;5% (tableau 5). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Protéines </td><td></td><td colspan="4"> peptides </td><td></td><td colspan="4"> peptides Désaminée </td><td></td><td colspan="4"> Glycosites </td><td></td><td colspan="4"> glycoprotéines </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; 249 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 5 </td></tr><tr><td colspan="2"> 18hr </td><td colspan="2"> 217 </td><td colspan="2"> 304 </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> 24 </td><td></td><td colspan="2"> 112 </td><td colspan="2"> 18 </td></tr><tr><td colspan="2"> MARYLAND </td><td colspan="2"> 270 </td><td colspan="2"> 266 </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> 455 </td><td></td><td colspan="2"> 254 </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> 102 </td><td colspan="2"> 7 </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4482 </td><td></td><td colspan="2"> 602 </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> 232 </td><td colspan="2"> dix </td><td></td><td colspan="2"> 145 </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> . Tableau 5: Comparaison des données protéomiques d&#39;une trypsine norme digérer par rapport à la méthode de marquage en ligne FANGS-P2GPN ont fait des préparatifs ont été effectués avec (+) et sans (-) PNGase F pour déterminer les taux de désamidation et une estimation non spécifique fond glycosite taux de faux positifs. Les protéines ont été identifiées avec 1% le taux de fausses découvertes (FDR); peptides ont été filtrés en fonction de &quot;haut&quot; la confiance des peptides dans Proteome Discoverer 1.4 (q &lt;0,01); glycosites ont été identified sur la base de séquences uniques contenant désamidation du motif de glycosylation conservés (NXS / T); et glycoprotéines ont été définies comme des protéines identifiées contenant au moins une glycosite identifiée. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> Figure 5: Raccourcissement des protocoles de glycanes ont été mis au point pour minimiser la désamination dans les échantillons et on les compare à la PNGase F 18hr FANGS digestion. Les différences moyennes en abondances étaient de 10% et 5% pour le rapport de gestion (2.2.3) et SPI (2.2.2) protocoles, respectivement. Sur les 48 glycanes identifiés, 90% affiché moins de variation de 1,5 fois. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Un protocole à haut débit a été développé pour la purification combinée de la protéomique et de la glycomique et la quantification LC-MS/MS dans le plasma. L’analyse par désamidation des motifs de glycosylation liés à l’azote était spécifique aux sites déglycosylés. Une quantification précise des N-glycanes a été obtenue en couplant la séparation des N-glycanes assistée par filtre à la normalisation de l’individualité lors du marquage avec la stratégie de marquage avec des marqueurs d’hydrazide de glycane.

A Quantitative Glycomics et protéomique Stratégie Purification Combined

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

L'objectif général de ce protocole basé sur un seul filtre est de purifier facilement et de manière quantitative les N-glycannes et les protéines en parallèle à partir d'échantillons biologiques pour une analyse par spectrométrie de masse. La reproductibilité analytique, la rapidité et la possibilité de mise à l'échelle de cette méthode la rendent directement accessible, en termes de ressources et de compétences requises, aux laboratoires de spectrométrie de masse biologique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet aux chercheurs d'étudier simultanément des questions liées à la glycomique, à l'occupation des sites de glycosylation et à la protéomique dans des études biologiques à grande échelle et haut débit.Nous avons surmonté les difficultés liées aux mesures des N-glycannes en couplant cette méthode à une stratégie de dérivation adaptée à la spectrométrie de masse, permettant ainsi une quantification relative précise entre les états cancéreux et les états témoins. Grâce à une variabilité analytique réduite, de nouvelles interactions biologiques pourraient être mises au jour entre le glycome et le protéome, offrant des informations essentielles sur les états pathologiques ainsi que de nouvelles opportunités pour la découverte de biomarqueurs. Pour commencer, déposez 2,5 µL de plasma sur un filtre.Ensuite, ajoutez 2 microlitres de solution de dithiothr&eacute;itol &agrave; 1 M &agrave; chaque &eacute;chantillon dans le filtre. Diluez l&rsquo;&eacute;chantillon avec 200 microlitres de tampon de digestion PNGase &agrave; l&rsquo;hydrog&eacute;nocarbonate d&rsquo;ammonium &agrave; 100 mM. Boucher le tube d&rsquo;&eacute;chantillon du filtre et vortexer doucement, en prenant soin de ne pas d&eacute;loger le filtre de son si&egrave;ge.Incuber l'échantillon à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes afin de dénaturer les protéines et les glycoprotéines. Pour alkylater les échantillons, ajouter 50 microlitres de iodoacétamide 1 M afin d'obtenir une concentration finale d'environ 200 mM. Puis, incuber à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes.Concentrez la glycoprotéine dénaturée sur le filtre en centrifugeant les échantillons à 14 000 x g pendant 40 minutes avant d'éliminer l'écoulement. Lavez l'échantillon avec 100 microlitres de tampon de digestion PNGase. Concentrez la glycoprotéine sur le filtre et éliminez l'écoulement.Répétez deux fois l'étape de lavage et de concentration, pour un total de trois fois, afin d'obtenir un concentré dans le volume mort du filtre. Jetez tout l'écoulement et le flacon de collecte une fois les lavages terminés. Ensuite, ajoutez 2 microlitres de peptide N-glycosidase F sans glycérol ou PNGase F au filtre après l'avoir transféré dans un nouveau flacon de collecte.Ajouter 98 microlitres de tampon de digestion PNGase pour obtenir un volume total de 100 microlitres, puis mélanger délicatement par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette sur le filtre. Pour le protocole de digestion avec ajout, incuber les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 2 heures. En travaillant rapidement, retirer les échantillons et ajouter 2 microlitres supplémentaires de PNGase F sans glycérol. Vortexer légèrement les échantillons pendant 1 à 2 secondes pour homogénéiser.Incubez les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 2 heures supplémentaires. Après avoir élué les glycanes par centrifugation de l'échantillon à 20 degrés Celsius, ajoutez 100 microlitres de tampon de digestion PNGase sur le filtre et centrifugez à nouveau. Récupérez le lavage contenant les glycanes N-liés restants dans le même flacon de collecte que l'éluat.Après avoir répété l'opération deux fois, retirez le filtre et placez-le dans un nouveau tube de collecte pour la préparation en protéomique. Ensuite, incubez les échantillons de glycanes dans le congélateur à 80 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes jusqu'à ce qu'ils soient complètement gelés. Puis, séchez-les complètement à température ambiante dans un concentrateur sous vide pendant 4 à 6 heures.Rincez le filtre contenant les peptides désaminés avec 400 microlitres de tampon urée 8 M. Baissez le bouchon du flacon de collecte et vortexez doucement pour homogénéiser. Concentrez les peptides sur le filtre avant de jeter tout l'écoulement.Après avoir répété deux fois supplémentaires le lavage avec le tampon urée, rincez le filtre contenant les peptides désaminés avec le tampon de digestion par la trypsine. Boucher le tube de collecte et vortexer doucement pour homogénéiser, puis concentrer à nouveau sur le filtre comme précédemment. Jeter tout l'écoulement et répéter deux fois supplémentaires, pour un total de trois lavages avec le tampon de digestion par la trypsine.Recueillir tous les éluants et lavages ultérieurs dans un nouveau flacon de collecte. Ensuite, ajouter 50 microlitres de trypsine modifiée porcine selon un rapport trypsine-protéine de 1:50 pour des protéomiques exploratoires ou un rapport trypsine-protéine de 1:5 pour des expériences de protéomique quantitative. Boucher le flacon de collecte et vortexer doucement pour homogénéiser.Après avoir incubé les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 2 heures, travaillez rapidement pour retirer les échantillons et ajouter 50 microlitres supplémentaires de trypsine selon le rapport trypsine-protéine approprié. Vortexez légèrement les échantillons pendant 1 à 2 secondes pour homogénéiser. Incubez ensuite à 50 degrés Celsius pendant 2 heures supplémentaires.Après élution des peptides par centrifugation comme précédemment pendant 20 minutes, rincez les peptides restants sur le filtre avec le tampon d'arrêt. Éluerez les peptides du filtre par centrifugation comme précédemment pendant 15 minutes. Après avoir quantifié la concentration en peptides dans les échantillons, incubez les échantillons de peptides dans le congélateur à 80 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient congelés.Ensuite, sécher complètement à température ambiante dans un concentrateur sous vide pendant 4 à 6 heures. Puis, redissoudre les protéines trypsiques juste avant l'analyse par spectrométrie de masse en chromatographie liquide (LCMS) dans la phase mobile A jusqu'à la concentration souhaitée. Les concentrations de peptides trypsiques provenant de 2,5 microlitres de plasma varient de 100 à 300 nanogrammes par microlitre.Avant l'analyse des glycanes, reconstituez les réactifs séchés de 4-phényléthyl benzo-hydrazide marqués par des isotopes stables, ainsi que les réactifs P2GPN natifs, dans un millilitre de solution de dérivation pour obtenir une concentration finale de 0,25 milligramme par millilitre. La solubilisation complète des réactifs peut prendre jusqu'à 10 minutes. Vortexez soigneusement pour garantir une solubilisation totale.Marquez les N-glycanes séchés avec 200 microlitres de réactif P2GPN marqué aux isotopes stables ou natif. Pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour re-suspendre les glycanes séchés. Ensuite, vortexez les échantillons et centrifugez-les brièvement pendant environ 5 secondes sur une centrifugeuse de banc.Faire réagir les glycanes avec le réactif pendant 3 heures à 56 degrés Celsius. Transférer immédiatement les glycanes de l'incubateur vers le concentrateur sous vide et sécher complètement à 55 degrés Celsius pendant 3 à 5 heures. Re-suspendre le N-glycane marqué dans 25 à 50 microlitres d'eau juste avant l'analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse.Pipeter plusieurs fois de haut en bas pour s'assurer que les N-glycanes sont complètement solubilisés. Après avoir centrifugé les échantillons comme précédemment pendant 5 minutes, retirer le surnageant en prenant soin de ne pas laisser la pointe de la pipette toucher le fond du tube de centrifugation. Combiner une paire d'échantillons natifs et marqués par un isotope stable dans un rapport de 1:1 pour une analyse en tandem de quantification relative.Préparez 2 méthodes LC-MS différentes pour les protocoles de protéomique et de glycomique. Pour l'analyse des protéines, injectez environ 400 nanogrammes de protéine sur la colonne en NPA. Faites passer l'échantillon à 300 nanolitres par minute, avec une équilibration préalable de 1 microlitre sur la colonne préparatoire et une équilibration de 5 microlitres sur la colonne analytique.Ionisez les protéines dans les conditions de spectrométrie de masse indiquées dans le protocole. Pour l'analyse des glycanes, injectez 5 microlitres d'échantillons natifs marqués P2GPN et d'échantillons équimolaires marqués par isotopes stables, re-suspendus, sur la colonne. Faites circuler l'échantillon à 300 nanolitres par minute avec une équilibration préalable de 2 microlitres en amont de la colonne et une équilibration de la colonne analytique de 5 microlitres.Ensuite, ionisez les glycanes dans les conditions de spectrométrie de masse indiquées dans le protocole écrit. Le protocole de purification par filtration a été comparé à la méthode standard d'extraction en phase solide, et les abondances des glycanes plasmatiques détectés entre les deux protocoles n'étaient pas significativement différentes. Dans les deux méthodes, les mêmes glycanes situés près de la limite de détection présentaient une variabilité accrue.On a évalué l'intervariabilité pour des mélanges équimolaires de plasma purifié selon le protocole d'extraction en phase solide classique ou basé sur un filtre. Les deux protocoles présentaient des distributions gaussiennes dont les moyennes ne différaient pas significativement de zéro. Quatre-vingts pour cent des glycanes se situaient dans une variation d'un facteur deux.Les distributions des masses moléculaires des glycanes détectées dans les protocoles de purification nouveaux et traditionnels n'étaient pas significativement différentes et couvraient la même gamme. Sur le plan qualitatif, aucun biais entre les glycanes n'a été observé. Les protéines plasmatiques ont été préparées selon la méthode standard de préparation d'échantillons assistée par filtration et par plusieurs protocoles en ligne multiples.Le nombre de protéines identifiées était similaire pour les différents protocoles. La désamination non spécifique a été contrôlée à moins de 10 pour cent dans les protocoles de digestion par micro-ondes et de précipitation de l'indigestion. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que la détermination précise du taux d'occupation des sites de glycosylation dépend de la minimisation de l'exposition à la chaleur et à la durée. Une fois maîtrisée, la purification en ligne des N-glycannes pecurikènes peut être réalisée en deux jours. En suivant cette procédure, la quantification précise des N-glycannes protéiques et l'occupation des sites de glycosylation peuvent être intégrées et modélisées à l'aide de techniques statistiques avancées. Cette méthode permet de décoder rapidement le langage complexe utilisé par la biologie du cancer, de comparer quantitativement les différences entre thérapeutiques protéiques, et de révéler véritablement l'importance de la glycosylation dans un contexte biologique.

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