Name: Lisolement, la caractérisation et de lexamen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Découvrez l'isolation et la caractérisation des cellules immunitaires gingivales chez la souris pour étudier l'immunité orale et la pathogenèse de la parodontite. Cette technique permet d'obtenir suffisamment de cellules viables pour des analyses fonctionnelles détaillées.

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Les auteurs ont été financés en partie par le programme intra-muros du NIDCR (N.M.M) et soutenus par une bourse Stepping Stones du Wellcome Trust (097820/Z/11/B à J.E.K) et par une subvention du Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research (à J.E.K). Les auteurs remercient Teresa Wild d’avoir examiné le manuscrit de manière critique.

Toutes les procédures expérimentales décrites dans ce protocole ont suivi les directives nécessaires et ont été approuvés par l&#39;Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité, NIDCR / NIH. 1. Préparez à l&#39;avance <ol><li> Préparer des milieux complètes: RPMI supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 10% de FBS. </li><li> Préparer des milieux de DNase: 50 ml de milieu RPMI supplémenté avec 7,5 pg de DNase (Ajouter frais, garder sur la glace en tout temps). </li><li> Préparer les médias collagénase-DNase: 5 ml de milieu DNase, plus de 3,2 mg / ml de collagénase de type IV (Ajouter frais, garder sur la glace en tout temps). </li><li> tampon FACS pré-cool: 0,5% de FBS dilué dans du PBS. </li><li> centrifugeuse pré-refroidir à 4 ° C. </li><li> Chaud agitateur incubateur à 37 ° C. </li></ol> 2. Isolement, Dissection, et Cell Isolation de gingivaux Blocks <ol><li> Euthanasier les souris en les exposant à de CO 2 dans une chambre appropriée, conformément aux lignes directrices de l&#39;ARAC. </li> &lt;li&gt; Ouvrez la cavité thoracique et abdominale pour exposer le coeur et les organes internes. À perfuser, faire une incision dans la veine cave inférieure et perfuser 3 ml de PBS par l&#39;intermédiaire du ventricule gauche en utilisant une seringue de 3 ml avec une aiguille 27 G. </li><li> Immobiliser le corps et la tête de la souris sur un bloc avec le ventre vers le haut. </li><li> Couper chaque commissure de la lèvre vers le cou avec des ciseaux, la séparation de la peau qui recouvre la mandibule et le cou région, exposant les tissus sous-jacents et les muscles. Disséquer la lèvre inférieure pour découvrir la mandibule. </li><li> Couper entre les incisives inférieures pour séparer les deux côtés de la mandibule et immobiliser chaque côté pour accéder à la cavité buccale. </li><li> Visualiser et disséquer le palais loin de la cavité nasale. </li><li> Disséquer zones en utilisant une lame 10 et inclure des zones molaires maxillaires et mandibulaires avec entourant gencive (figure 1). Faire des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire et une incision horizontale aula frontière de la gencive (en col blanc des tissus entourant les dents). </li><li> Placez le maxillaire et mandibulaire blocs dans un tube conique de 50 ml avec 5 ml collagénase / DNase (garder sur la glace). </li><li> Incuber dans un incubateur secoueur à 37 ° C pendant 1 h et pendant les 5 dernières minutes de l&#39;incubation ajouter 50 pi de 0,5 M d&#39;EDTA. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu de DNase froid au tube de 50 ml avec des tissus et agiter doucement pour mélanger. </li><li> Transférer les 4 blocs de tissus sur une boîte de Pétri et couvrir avec 500 pi de DNase médias. Retirer la gencive de chaque bloc de tissu, en utilisant une lame de scalpel et montrant la lame dans les zones interdentaires et gingivales. </li><li> Transférer les tissus et les médias de la boîte de Pétri, ainsi que les médias de DNase précédents utilisés lors de la dissection, dans un nouveau tube de 50 ml à travers le tamis de la cellule (70 pm de taille). Laver avec les médias de DNase (3-5 ml) tous les instruments utilisés et filtre. </li><li> En utilisant le piston d&#39;une seringue stérile de 3 ml, écraser le tissu contre le tamis,filtration avec des milieux de DNase froide (30 à 35 ml). </li><li> Laver le tamis cellulaire avec les médias de DNase froid. </li><li> Centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 6 min. </li><li> Jeter le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de milieu complet. </li><li> Compter les cellules (la quantité attendue doit être comprise entre 8 x 10 5 à 1,2 x 10 6 cellules avec une viabilité&gt; 80%) en utilisant un compteur de cellules automatisé. </li></ol> 3. Stimulation et FACS coloration des cellules gingivales <ol><li> Stimuler la suspension de cellules individuelles avec du PMA (50 ng / ml) et de l&#39;ionomycine (2,5 pg / ml) en présence de 1 pl / ml de brefeldine A. </li><li> Incuber pendant 3,5 h à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Isoler et laver avec du PBS et centrifuger à 4 ° C; 314 g pendant 6 min. </li><li> Colorer les cellules en utilisant un colorant de viabilité en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Teinture pour les marqueurs extracellulaires (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ ou de fourmisibodies de choix) selon les instructions du fabricant. </li><li> Laver les cellules avec du tampon FACS froid et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min. </li><li> vortexer doucement pour perturber le culot cellulaire. </li><li> Fixer les cellules avec 2% de paraformaldehyde pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec du tampon FACS à froid, centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 5 min et les taches de cytokines intracellulaires. <ol><li> Remplir les tubes FACS avec une solution froide de 0,5% de saponine dilué dans du tampon pour FACS et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min. </li><li> Ajouter 300 ul de solution de saponine à 0,5% dans les tubes FACS, incuber pendant 15 min à l&#39;obscurité à 4 ° C puis centrifuger à 4 ° C, 314 g pendant 5 min. </li><li> Colorer les cellules de marqueurs intracellulaires (IL-17A et IFNy ou des cytokines de choix) selon les instructions du fabricant. Laver les cellules avec une solution de saponine à 0,5% et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min. </li><li> Laver ensuite avec FACSun tampon et centrifugation à 4 ° C, 314 g pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 300 ul de tampon FACS. </li></ol></li><li> Analyser les résultats sur un cytomètre de flux. </li></ol> 4. Analyse de cytométrie en flux <ol><li> Visualiser les cellules à analyser sur l&#39;avant (FSC) et de diffusion latérale (SCC) et la porte d&#39;exclure les débris. </li><li> Sélectionnez les cellules individuelles avec zone de diffusion vers l&#39;avant (FSC-A) par rapport à la hauteur (FSC-H) paramètres. </li><li> Cellules de grille qui sont en direct (comme indiqué par la viabilité coloration) et positif pour le marqueur CD45 + hématopoïétiques pour une analyse ultérieure (figure 2A et 2C). </li><li> Poursuivre l&#39;analyse de marqueurs spécifiques comme le montre la Figure 2 et la Figure 3. </li></ol>

<ol><li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li>
<li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li>
<li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontitis%3A+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li>
<li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis%3A+Keystones%2C+Pathobionts%2C+And+Host+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li>
<li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States%3A+2009+And+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+Errors+In+Immunity%3A+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li>
<li>Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+SO+%22Current+Protocols+In+Immunology%22">Current Protocols In Immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Chapter 5, Unit 5 2 (2001).</li>
<li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+Immune+Axis%3A+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

La technique actuelle obtient avec succès un grand nombre de cellules immunitaires (à partir d&#39;une seule souris) adapté, non seulement pour la caractérisation phénotypique, mais aussi pour des études fonctionnelles ex vivo. Un autre groupe avait déjà publié un protocole pour isoler et caractériser les cellules immunitaires gingivales murin et introduit la valeur de l&#39;utilisation de la cytométrie de flux multicolore dans l&#39;étude de la parodontite chez des modèles animaux 9. À la suite de d...

Tissus gingivaux entourent la dentition humaine et murine et sont constamment exposés à biofilm complexe de la dent 1. Le réseau des cellules immunitaires de police la barrière gingivale est essentiel au maintien de l&#39;intégrité des tissus, assurant l&#39;homéostasie avec les microbes commensaux locales et, dans le même temps, fournir une immunité efficace contre une infection pathogène 2. Pour atteindre l&#39;homéostasie, le système immunitaire est soigneusement adaptée à l&#39;environnement gingival création d&#39;un réseau de cellules immunitaires très spécialisé, mais peu de détails sont connus des populations de cellules immunitaires gingivales et leur rôle dans le maintien du tissu immunité 2. Lorsque l&#39;homéostasie immunitaire est perturbé à la gencive, soit par augmentation de la sensibilité et / ou la présence de communautés microbiennes dysbiotic, un état ​​inflammatoire hôte, la parodontite pose 3 4. La parodontite est une maladie inflammatoire commune, conduisant à la perte de la dent sstructures bandages en. Sous ses formes graves, il est vu dans environ 10% de la population générale 5. Disséquer les facteurs clés impliqués dans la parodontite susceptibilité et la progression est avéré difficile 6. Cependant, les modèles animaux ont été extrêmement utiles pour comprendre les mécanismes de la parodontite initiation et la progression 7. Les modèles peuvent être utilisés pour définir les populations de cellules principales et des médiateurs moléculaires qui sont essentiels pour le maintien de l&#39;homéostasie immunitaire et le développement d&#39;entraînement de la parodontite. Une telle perspicacité va transformer notre compréhension du contrôle spécifique de la gencive de l&#39;homéostasie immunitaire et approfondir notre compréhension actuelle de la pathogenèse de la maladie.

<table><tbody><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils scientifiques</td><td>fins 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel #3</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel #10</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10010-00</td><td>Pince à</td></tr><tr><td>échardes</td><td>stériles Integra Miltex</td><td>6-304</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles à biseau régulier&nbsp ;</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td>27 G, longueur 12,7 mm</td></tr><tr><td>Seringues</td><td>Monoject Covidien</td><td>8881513934</td><td>Embout Luer-lock, 3 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Sans Calcium et Magnésium</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>Sans L-glutamine</td></tr><tr><td>DNase I du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Colgénase de type IV</td><td>Gibco (par Life technologies)</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine 50 mg/ml</td><td>Qualité biologique</td><td>120-098-661EA</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco (par Life technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco (par Life technologies)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Qualité biologique</td><td>351-027-721EA</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Polypropylène, stérile</td></tr><tr><td>70 &mu ; M Cell Strainers</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 5 ml Tubes FACS</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Contient de la brefeldine A solution</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristate 13-Acétate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine Sel de calcium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909</td><td></td></tr><tr><td>Saponine de l’écorce de quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Kit de teinture à cellules mortes</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD45 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD4 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris TCR beta APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris gamma delta TCR FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5711-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IL-17A APC</td><td>eBioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IFN-&gamma ; PE</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris NK1.1 PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD90.2 APC eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0902-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD3e FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD19 FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD11b FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD11c FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris TCR bêta FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Ly-6G FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Ly-6C FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553104</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement, la caractérisation et de l&#39;examen fonctionnel du réseau de cellules gingivale immunitaire

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Les réseaux de cellules immunitaires dans les tissus jouent un rôle essentiel dans la médiation de l’immunité locale et le maintien de l’homéostasie tissulaire, mais on sait peu de choses sur les populations de cellules immunitaires résidentes dans la muqueuse buccale et la gencive. Nous avons mis au point une technique d’isolement et d’étude des cellules immunitaires des tissus gingivaux murins, une zone d’exposition microbienne constante et un site vulnérable à une maladie inflammatoire courante, la parodontite. Notre protocole permet une caractérisation phénotypique détaillée des populations de cellules immunitaires résidant dans la gencive, même à l’état d’équilibre. Notre procédure produit également suffisamment de cellules à haute viabilité pour être utilisées dans des études fonctionnelles, telles que l’évaluation de la sécrétion de cytokines ex vivo. Cette combinaison de caractérisation phénotypique et fonctionnelle du réseau de cellules immunitaires gingivales devrait aider à étudier les mécanismes impliqués dans l’immunité orale et l’homéostasie parodontale, mais fera également progresser notre compréhension des mécanismes impliqués dans l’immunopathologie locale.

Pour illustrer l&#39;application du protocole, nous montrons des résultats représentatifs examinant le réseau des cellules immunitaires dans la gencive de souris avec et sans la parodontite (WT vs LFA - / -, Figure 2A - C). FACS représentatifs parcelles montrent cellules CD45 + hématopoïétiques vivantes dans la gencive (figure 2A, 2C). L&#39;isolement et le traitement des cellules immunitaires avec ...

Nous avons établi une technique pour l&#39;isolement, la caractérisation phénotypique et l&#39;analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.

L&#39;isolement, la caractérisation et de l&#39;examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

L'objectif général de cette méthode est d'isoler les cellules immunitaires gingivales afin de caractériser en profondeur les réponses immunitaires liées à l'immunité orale et à la parodontite. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunité orale, telles que quels facteurs cellulaires sont impliqués dans la pathogenèse de la parodontite. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet l'évaluation du réseau des cellules immunitaires orales et l'isolement d'un nombre suffisant de cellules viables pour des analyses in vitro ultérieures.Comme première étape de ce protocole, commencez par placer des épingles afin d'immobiliser le corps de la souris et ouvrez les cavités thoracique et abdominale pour exposer le cœur et les organes internes. Ensuite, pratiquez une incision dans la veine cave et utilisez une seringue de 3 millilitres, équipée d'une aiguille de 27 gauge, pour perfuser 3 millilitres de PBS par le ventricule gauche. Une fois tout le sang éliminé, épinglez la tête de la souris sur un plateau de dissection, le ventre vers le haut.Ensuite, utilisez des ciseaux pour inciser chaque commissure labiale en direction du cou, séparant ainsi la peau recouvrant la région de la mandibule et du cou, et exposant les tissus et muscles sous-jacents. Incisez entre les incisives inférieures afin de séparer les deux côtés de la mandibule. Immobilisez chaque côté de la mandibule séparée à l’aide d’aiguilles de calibre 25 pour accéder à la cavité buccale.Après avoir identifié le palais, utilisez une lame chirurgicale n°10 pour effectuer des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire. Ensuite, disséquez le tissu de la cavité nasale et séparez également les blocs de la mandibule. Puis éliminez le tissu excédentaire le long de la limite de la gencive et transférez les blocs maxillaires et mandibulaires dans un tube conique de 50 millilitres contenant 5 millilitres de collagénase et de DNase placé sur de la glace.Digérer le tissu dans un incubateur agitateur à 37 degrés Celsius pendant une heure, en ajoutant 50 microlitres de EDTA 0,5 molaire durant les cinq dernières minutes. Ensuite, ajouter 5 millilitres de milieu de DNase froid aux tissus, et mélanger délicatement le contenu du tube par rotation. Puis, transférer les quatre fragments de tissu dans une boîte de Pétri.Et recouvrez-les de 500 microlitres de milieu de DNase frais. Utilisez un scalpel pour retirer la gencive de chaque fragment de tissu. Transférez ensuite l'ensemble du contenu de la boîte dans un tamis cellulaire de 70 microns placé sur un tube de 50 millilitres.Lavez la boîte de Pétri et le tamis avec 3 à 5 millilitres de milieu DNase frais. Ensuite, utilisez le piston d'une seringue stérile de 3 millilitres pour broyer le tissu gingival contre la maille du tamis. Rincez le tamis avec 30 à 35 millilitres de milieu DNase froid, puis centrifugez le filtrat.Ensuite, resuspendre le palais dans 1 millilitre de milieu complet et déterminer le nombre de cellules viables. L'isolement et la mise en œuvre des cellules immunitaires tel que vient d'être démontré permettent d'obtenir un nombre suffisant de cellules pour réaliser une stimulation ex vivo et caractériser les profils de sécrétion de cytokines par les cellules gingivales provenant à la fois de souris de type sauvage et d'animaux sensibles à la parodontite. En effet, la composition des cellules immunitaires gingivales chez la souris peut être analysée comme le montrent ces diagrammes de densité évaluant les compartiments des cellules T et des cellules tueuses naturelles chez des souris knock-out LFA sensibles à la parodontite.En utilisant les stratégies de sélection appropriées, la production intracellulaire de cytokines par les cellules T TCR bêta CD4 positives, TCR bêta CD8 positives et TCR gamma delta positives, ainsi que par les cellules NK et les cellules lymphoïdes innées, peut également être déterminée. Une fois maîtrisée, la technique permet d'isoler les cellules en trois heures pour la coloration immunologique, à condition d'être réalisée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer toutes les étapes de manière efficace et rapide, en gardant les cellules sur de la glace chaque fois qu'elles ne sont pas manipulées.Après cette procédure, d'autres méthodes, comme le tri cellulaire, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la fonction des sous-populations cellulaires spécifiques.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette méthode pour isoler les cellules immunitaires fonctionnelles du cœur offre une alternative aux méthodes classiques de digestion à la collagénase, ce qui provoque l'activation des cellules immunitaires indésirables, résultant en une diminution de la réactivité de ces cellules. Notre méthode d'isolement des rendements fonctionnelle cardiaque des cellules immunitaires en évitant les problèmes liés à la digestion enzymatique.

Isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques

Cette vidéo montre la procédure d’isolement du réseau de cellules immunitaires gingivales à partir d’un modèle murin. La digestion enzymatique libère le tissu gingival des dents et de l’os attachés, qui est ensuite digéré mécaniquement, libérant les cellules immunitaires de la gencive. Les cellules isolées sont prêtes pour des expériences immunologiques.

Isolement du réseau de cellules immunitaires gingivales à partir de blocs de dents murines

Cette étude décrit une technique efficace pour isoler et traiter des tissus gingivaux de la cavité buccale de la souris afin de produire une culture unicellulaire. Les cellules obtenues peuvent en outre être utilisés pour l'analyse par cytométrie en flux et des études moléculaires.

Isolation, traitement et analyse des cellules gingivales murins

Cet article présente deux protocoles : l’un pour mesurer les bactéries anaérobies qui peuvent envahir et survivre avec succès dans l’hôte, et l’autre pour visualiser les bactéries anaérobies interagissant avec les cellules hôtes. Cette étude peut être appliquée à n’importe quel anaérobie cultivable et à tout type de cellule eucaryote.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

La surface oculaire normale exposée est constituée de cornée et de conjonctive. Les cellules épithéliales, les cellules caliciformes et les cellules immunitaires sont présentes dans la conjonctive. Ici, une technique non invasive de cytologie d'impression est décrite en utilisant un dispositif de cytologie d'impression et une cytométrie de flux pour analyser les cellules immunitaires dans la conjonctive.

Une manière non invasive d&#39;isoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite

L’objectif du protocole est de construire un modèle d’inflammatoire gencive humaine in vitro. Ce modèle de tissu co cultive trois types de cellules humaines, HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, dans des conditions en trois dimensions. Ce modèle peut être appliqué à une enquête sur les maladies parodontales, telles que la gingivite et la parodontite.

Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive

Dans le protocole actuel, nous expliquons comment traiter et culturer facilement les cellules monnucléaires amygdaler des humains sains subissant l’amygdalectomie chirurgicale partielle pour étudier les réponses immunitaires innées lors de l’activation, imitant l’infection virale dans les tissus muqueuses.

Isolement des cellules monnucléaires tonsillar pour étudier les réponses immunitaires innées Ex Vivo dans un tissu lymphoïde muqueuse humain

Nous présentons ici une méthode modifiée pour l’isolement et la culture de cellules épithéliales gingivales humaines en ajoutant l’inhibiteur de Rock, Y-27632, à la méthode traditionnelle. Cette méthode est plus facile, prend moins de temps, améliore les propriétés des cellules souches et produit un plus grand nombre de cellules épithéliales à fort potentiel à la fois pour le laboratoire et pour les applications cliniques.

Isolement et culture de cellules épithéliales gingivales humaines primaires à l’aide de Y-27632

Le protocole actuel présente une méthode rapide, efficace et douce pour isoler des cellules individuelles adaptées à l’analyse de l’ARN unicellulaire à partir d’une incisive de souris, d’une molaire de souris et de dents humaines en croissance continue.

Isolement rapide des cellules individuelles des dents de souris et humaines

Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2), impliquées dans l’inflammation de type 2, participent principalement à la réponse à l’infection par les helminthes, aux maladies allergiques, à l’homéostasie métabolique et à la réparation des tissus. Dans cette étude, une procédure pour isoler les ILC2 de la muqueuse nasale murine et détecter l’expression de CD226 est démontrée.

Isolement de cellules lymphoïdes innées du groupe 2 de la muqueuse nasale de souris pour détecter l’expression de CD226

L’objectif de ce protocole est de fournir une approche standardisée pour évaluer quantitativement l’intégrité de la barrière épithéliale gingivale murine en appliquant localement des dextrans marqués à la fluorescence de tailles moléculaires variées sur la surface gingive in vivo, suivies d’imagerie ex vivo à l’aide d’un système de microscopie à photon unique.

Évaluation fonctionnelle de la barrière épithéliale gingivale de la souris à l’aide de traçeurs fluorescents

Découvrez l'isolation et la caractérisation des cellules immunitaires gingivales chez la souris pour étudier l'immunité orale et la pathogenèse de la parodontite. Cette technique permet d'obtenir suffisamment de cellules viables pour des analyses fonctionnelles détaillées.

L'isolement, la caractérisation et de l'examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

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