L'isolement, la caractérisation et de l'examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

L'objectif général de cette méthode est d'isoler les cellules immunitaires gingivales afin de caractériser en profondeur les réponses immunitaires liées à l'immunité orale et à la parodontite. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunité orale, telles que quels facteurs cellulaires sont impliqués dans la pathogenèse de la parodontite. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle permet l'évaluation du réseau des cellules immunitaires orales et l'isolement d'un nombre suffisant de cellules viables pour des analyses in vitro ultérieures.

Comme première étape de ce protocole, commencez par placer des épingles afin d'immobiliser le corps de la souris et ouvrez les cavités thoracique et abdominale pour exposer le cœur et les organes internes. Ensuite, pratiquez une incision dans la veine cave et utilisez une seringue de 3 millilitres, équipée d'une aiguille de 27 gauge, pour perfuser 3 millilitres de PBS par le ventricule gauche. Une fois tout le sang éliminé, épinglez la tête de la souris sur un plateau de dissection, le ventre vers le haut.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour inciser chaque commissure labiale en direction du cou, séparant ainsi la peau recouvrant la région de la mandibule et du cou, et exposant les tissus et muscles sous-jacents. Incisez entre les incisives inférieures afin de séparer les deux côtés de la mandibule. Immobilisez chaque côté de la mandibule séparée à l’aide d’aiguilles de calibre 25 pour accéder à la cavité buccale.

Après avoir identifié le palais, utilisez une lame chirurgicale n°10 pour effectuer des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire. Ensuite, disséquez le tissu de la cavité nasale et séparez également les blocs de la mandibule. Puis éliminez le tissu excédentaire le long de la limite de la gencive et transférez les blocs maxillaires et mandibulaires dans un tube conique de 50 millilitres contenant 5 millilitres de collagénase et de DNase placé sur de la glace.

Digérer le tissu dans un incubateur agitateur à 37 degrés Celsius pendant une heure, en ajoutant 50 microlitres de EDTA 0,5 molaire durant les cinq dernières minutes. Ensuite, ajouter 5 millilitres de milieu de DNase froid aux tissus, et mélanger délicatement le contenu du tube par rotation. Puis, transférer les quatre fragments de tissu dans une boîte de Pétri.

Et recouvrez-les de 500 microlitres de milieu de DNase frais. Utilisez un scalpel pour retirer la gencive de chaque fragment de tissu. Transférez ensuite l'ensemble du contenu de la boîte dans un tamis cellulaire de 70 microns placé sur un tube de 50 millilitres.

Lavez la boîte de Pétri et le tamis avec 3 à 5 millilitres de milieu DNase frais. Ensuite, utilisez le piston d'une seringue stérile de 3 millilitres pour broyer le tissu gingival contre la maille du tamis. Rincez le tamis avec 30 à 35 millilitres de milieu DNase froid, puis centrifugez le filtrat.

Ensuite, resuspendre le palais dans 1 millilitre de milieu complet et déterminer le nombre de cellules viables. L'isolement et la mise en œuvre des cellules immunitaires tel que vient d'être démontré permettent d'obtenir un nombre suffisant de cellules pour réaliser une stimulation ex vivo et caractériser les profils de sécrétion de cytokines par les cellules gingivales provenant à la fois de souris de type sauvage et d'animaux sensibles à la parodontite. En effet, la composition des cellules immunitaires gingivales chez la souris peut être analysée comme le montrent ces diagrammes de densité évaluant les compartiments des cellules T et des cellules tueuses naturelles chez des souris knock-out LFA sensibles à la parodontite.

En utilisant les stratégies de sélection appropriées, la production intracellulaire de cytokines par les cellules T TCR bêta CD4 positives, TCR bêta CD8 positives et TCR gamma delta positives, ainsi que par les cellules NK et les cellules lymphoïdes innées, peut également être déterminée. Une fois maîtrisée, la technique permet d'isoler les cellules en trois heures pour la coloration immunologique, à condition d'être réalisée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer toutes les étapes de manière efficace et rapide, en gardant les cellules sur de la glace chaque fois qu'elles ne sont pas manipulées.

Après cette procédure, d'autres méthodes, comme le tri cellulaire, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la fonction des sous-populations cellulaires spécifiques.