L'isolement, la caractérisation et de l'examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

L’objectif global de cette méthode est d’isoler les cellules immunitaires gingivales pour la caractérisation approfondie des réponses immunitaires liées à l’immunité buccale et à la parodontite. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunité orale, telles que les facteurs cellulaires impliqués dans la pathogenèse de la parodontite. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet d’évaluer le réseau de cellules immunitaires orales et d’isoler suffisamment de cellules viables pour des investigations in vitro en aval.

Comme première étape de ce protocole, commencez par placer des broches pour immobiliser le corps de la souris et ouvrir les cavités thoracique et abdominale pour exposer le cœur et les organes internes. Ensuite, faites une incision dans la veine cave et utilisez une seringue de 3 millilitres, équipée d’une aiguille de calibre 27, pour profuser 3 millilitres de PBS via le ventricule gauche. Lorsque tout le sang a été rincé, épinglez la tête de la souris sur un tampon de dissection, avec l’estomac vers le haut.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper chaque commissure de la lèvre vers le cou, en séparant la peau qui recouvre la région de la mandibule et du cou, et en exposant les tissus et les muscles sous-jacents. Coupez entre les incisives inférieures pour séparer les deux côtés de la mandibule. Immobilisez chaque côté de la mandibule séparée à l’aide d’aiguilles de calibre 25 pour accéder à la cavité buccale.

Après avoir identifié le palais, utilisez une lame chirurgicale numéro 10 pour faire des incisions verticales juste en avant de la première molaire et en arrière de la troisième molaire. Ensuite, disséquez le tissu loin de la cavité nasale, et disséquez également les blocs de la mandibule. Ensuite, éliminez l’excès de tissu du bord de la gencive et transférez les blocs maxillaire et mandibulaire dans un tube conique de 50 millilitres contenant 5 millilitres de collagénase et de DNase sur de la glace.

Digérez le tissu dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure, en ajoutant 50 microlitres d’EDTA à 0,5 molaire au cours des cinq dernières minutes. Ajoutez ensuite 5 millilitres de milieu DNase froid aux mouchoirs et mélangez doucement le contenu du tube en remuant. Ensuite, transférez les quatre blocs de tissu dans une boîte de Pétri.

Et couvrez-les de 500 microlitres de milieu DNase frais. Utilisez un scalpel pour retirer la gencive de chaque bloc de tissu. Et transférez tout le contenu du plat dans une passoire à cellules de 70 microns sur un tube de 50 millilitres.

Lavez la boîte de Pétri et la passoire avec 3 à 5 millilitres de milieu frais DNase. Ensuite, utilisez le piston d’une seringue stérile de 3 millilitres pour écraser le tissu gingival contre le grillage de la passoire. Rincer la passoire avec 30 à 35 millilitres de milieu DNase froid, et centrifuger le filtrat.

Ensuite, mettez le palais en suspension dans 1 millilitre de milieu complet et déterminez le nombre de cellules viables. L’isolement et le traitement des cellules immunitaires, tels qu’ils viennent d’être démontrés, produisent un nombre suffisant de cellules pour effectuer une stimulation et une caractérisation ex-vivo des modèles de sécrétion de cytokines des cellules gingivales chez les animaux de type sauvage et les animaux sensibles à la parodontite. En effet, la composition des cellules immunitaires gingivales murines peut être analysée, comme le démontrent ces graphiques de densité évaluant les compartiments des cellules T et des cellules tueuses naturelles chez les souris knock-out LFA sensibles à la parodontite.

À l’aide des stratégies de contrôle appropriées, la production intracellulaire de cytokines des lymphocytes TCR bêta CD4 positifs, TCR bêta CD8 positifs et TCR gamma delta positifs, ainsi que des cellules NK et lymphoïdes innées, peut également être déterminée. Une fois maîtrisées, les cellules peuvent être isolées en trois heures pour l’immunomarquage si la technique est correctement réalisée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de terminer toutes les étapes efficacement et rapidement, en gardant les cellules sur la glace chaque fois qu’elles ne sont pas manipulées.

En suivant cette procédure, d’autres méthodes, comme le tri des cellules, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires liées à la fonction des sous-ensembles de cellules spécifiques.