Name: Normes pour Quantitative Metalloproteomic Analyse Utilisation Taille Exclusion ICP-MS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Découvrez la quantification des métalloprotéines par chromatographie d'exclusion stérique couplée à l'ICP-MS. Cette méthode permet d'analyser l'état métallique des protéines dans leur forme native.

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1. Préparation des tampons et des échantillons <ol><li> Préparer 500 ml de tampon, 200 mM de nitrate d&#39;ammonium pH 7,6 à 7,8 (pH ajusté avec de l&#39; hydroxyde d&#39; ammonium (NH 4 OH)) avec le césium (Cs) et antinomie (Sb) a été ajouté à une concentration finale de 10 parties par milliard. Utilisez le césium et antinomie comme standards internes pour surveiller toute dérive dans la réponse de l&#39;ICP-MS. tampon de filtre avant de l&#39;utiliser à travers un filtre de 0,22 um. </li><li> Préparer l&#39;échantillon en fonction du type d&#39;échantillon: liquide, un tissu ou une culture cellulaire. <ol><li> Pour les échantillons qui ont besoin d&#39; homogénéisation (par exemple, des tissus ou des cellules), veiller à ce qu&#39;elles ne contiennent pas de détergent. Utilisez des tampons Tris pour la préparation des échantillons. Vous pouvez également utiliser des tampons de phosphate , mais ils peuvent avoir une incidence négative sur le metalloproteome au fil du temps ou avec des cycles de gel - dégel 12. </li><li> Homogénéiser les tissus ou de culture de cellules échantillons par Dounce manuel ou sonication pendant 5 minutes en utilisant une solution saline tamponnée au Tris (Tris 50 mM, pH 8,0, chlorure de sodium 150 mM(NaCl) + acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), les inhibiteurs de protéase libres). </li><li> Clarifier homogénats par centrifugation à 16.000 xg pendant 5 min. Recueillir le surnageant résultant. Conserver les échantillons à 4 ° C. Note: Tous les échantillons doivent être centrifugés avant le chargement dans la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des flacons pour empêcher les particules de bloquer la colonne de chromatographie d&#39;exclusion stérique (SEC). </li></ol></li><li> Normaliser la quantité totale de protéine chargée sur la colonne dans les échantillons. Déterminer les concentrations en protéines à 280 nm en utilisant un micro volume de spectrophotomètre UV 13. Charge comprise entre 20 et 150 pg de protéine. Utiliser des volumes d&#39;injection typiques allant de 2 à 80 pi en fonction de la concentration de l&#39;échantillon. <ol><li> Nettoyer le bras du micro spectrophotomètre UV volume avec de l&#39;eau distillée avant le chargement des échantillons de l&#39;échantillon. Le bras échantillon est l&#39;endroit où les échantillons de protéines sont chargés. </li><li> Blank l&#39;instrument contre 2 pi de the tampon échantillon. Ensuite, la charge 2 pl de chaque échantillon sur le bras et mesurer l&#39;absorbance à 280 nm. </li><li> Déterminer les concentrations. Pour les échantillons bruts de protéines, en utilisant un coefficient d&#39;extinction de 1 Abs = 1 mg / ml. Pour déterminer la concentration de la protéine dans les échantillons, utiliser la loi de Beer-Lambert, A = ε xlxc, où A est l&#39;absorbance, ε est le coefficient d&#39;extinction, l est la longueur de trajet en cm et c est la concentration. </li></ol></li></ol> 2. Analyse en vrac des normes Métalloprotéines Utilisation plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse <ol><li> Warm-up et régler l&#39;instrument en utilisant les protocoles du fabricant. </li><li> Une fois que l&#39;instrument est réchauffé et réglé, effectuer vrac ICP-MS. Remarque: Les solutions mères de métalloprotéines purifiées ont généralement besoin d&#39;être dilué avant la mesure. La concentration en métal de la norme peut être estimée à partir de la protéine connue: stochiometries métalliques et la concentra protéine estiméetion. Cette information peut être utilisée pour déterminer la dilution qui sera appropriée pour tomber dans la plage de la courbe standard générée. <ol><li> Diluer normes métalloprotéines, thyroglobuline, ferritine, céruloplasmine, Cu / Zn SOD et de la vitamine B 12, pour qu&#39;ils tombent dans la plage de 0-500 ug / L, utilisant de l&#39; acide nitrique à 1%. Pour atteindre les normes au sein de cette gamme, ne pas utiliser des dilutions supérieures à 1 à 20. Effectuer des dilutions en série dans l&#39;eau pour diluer les actions avant cette si nécessaire. </li><li> Mettre en place l&#39;ordre des injections. Tout d&#39;abord, analyser les niveaux d&#39;étalonnage sept concentrations allant de 0 à 500 ug / L, suivies par les normes de métalloprotéines. Les sept niveaux d&#39;étalonnage sont égaux à 0, 1, 5, 10, 50, 100 et 500 ug / L. </li><li> Sélectionnez des éléments d&#39;intérêt. Ici, utilisez Fe, Cu, Zn, Co et moi, car ils sont les éléments que les normes de protéines sont liés à. Sélectionnez les éléments de la méthode de l&#39;acquisition en ouvrant l&#39;onglet élément de sélection et en ajoutant le eleme<html> nts et leurs masses isotopiques respectifs qui doivent être analysés. </li><li> Effectuer une analyse d&#39;échantillon avec l&#39;instrument et le logiciel de l&#39;appareil crée automatiquement les courbes d&#39;étalonnage pour chacun des éléments d&#39;analyse. Les courbes d&#39;étalonnage sont créés par le logiciel en traçant les comptages / sec du métal détecté contre la quantité de métal que la norme est destinée à contenir, en ug / L. En utilisant les courbes d&#39;étalonnage pour déterminer la concentration du métal dans les échantillons inconnus. Remarque: En utilisant la courbe d&#39;étalonnage, le logiciel détermine la concentration du métal dans chacun des normes de métalloprotéines. </li><li> D&#39;après les résultats d&#39;analyse en vrac, générer un niveau de métalloprotéines qui comprennent les trois oligo-éléments les plus abondants dans les tissus des mammifères en utilisant un mélange de Cu, Zn superoxyde dismutase (SOD) diluée à 200 g / L de cuivre et de zinc et de ferritine (FTN) à une finale concentration de 2,000 mg / L de fer. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Configuration du système HPLC et Chromatographie d&#39;exclusion stérique Colonne équilibration Remarque: Cette section doit être effectuée en parallèle à la précédente, car ils ont tous deux nécessaires environ 1 à 1,5 heures pour terminer. <ol><li> Les pompes HPLC purge avec du tampon faite à l&#39;étape 1.1 et purger les pompes pendant 5 min à un débit de 5 ml / min de débit. </li><li> Une fois que le système est purgé, régler le débit à 0,1 ml / min et connecter la colonne d&#39;exclusion de taille (4,6 x 300 mm, 3 um, 150 Å). Remarque: Une connexion humide entre le tubage et la colonne évite les bulles d&#39;air étant pris au piège lors de la connexion de la colonne. </li><li> Connectez l&#39;autre extrémité de la colonne au détecteur UV réglé pour mesurer l&#39;absorbance à 280 nm en utilisant un tube de PEEK. </li><li> Augmenter progressivement le débit de la colonne par incréments de de 0,05 à 0,1 ml / min, jusqu&#39;à un débit final de 0,4 ml / min soit atteint. Bien que cela se produit, vérifiez les branchements à la colonne d&#39;éventuelles fuites. Surveiller la pressiondu système pour s&#39;assurer qu&#39;il ne dépasse pas les exigences de colonne en observant la trace de la pression sur le chromatogramme dans le logiciel. </li><li> Laissez la colonne à l&#39;équilibre au débit requis sur 5 - 10 volumes de colonne. Après il est équilibré, relier les instruments pour permettre l&#39;analyse de l&#39;échantillon de se produire. </li><li> Mettre en place la méthode HPLC à pomper le tampon A sur la colonne à 0,4 ml / min pendant 15 min. </li></ol> 4. Configuration et exécution d&#39;exclusion de taille - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse Remarque: les procédures d&#39;exploitation peuvent varier entre les instruments et les modèles. Contactez le spécialiste technique de l&#39;instrument pour en savoir plus sur la façon de configurer l&#39;ICP-MS utilisé. <ol><li> Placez le ICP - MS en mode veille avant de changer le réglage du matériel. <ol><li> Une fois en mode veille, éteignez la communication pour l&#39;échantillonneur automatique et changer l&#39;introduction échantillon à «autre». Remarque: Selon le logiciel et durWare configuration en sélectionnant &quot;HPLC&quot; comme source d&#39;introduction d&#39;échantillon peut être utilisé. Contactez le spécialiste technique de l&#39;instrument pour savoir si cette option est disponible. </li></ol></li><li> Utiliser un tube en PEEK (ID 0,13 mm) pour connecter le flux sortant du détecteur UV directement sur le nébulisateur ICP-MS. </li><li> Puissance sauvegarder l&#39;ICP - MS et laisser l&#39;appareil se réchauffer pendant 10 - 20 min. </li><li> Après le plasma a allumé, connectez le câble à distance de l&#39;ICP - MS à l&#39;arrière de l&#39;échantillonneur automatique de HPLC. Pour ce faire, une fois que le plasma a enflammé; sinon le système HPLC sera automatiquement arrêté depuis le ICP - MS est pas. </li><li> Changer la méthode ICP-MS pour recueillir des données pour LC-ICP-MS. <ol><li> Modifier la méthode de l&#39;acquisition du spectre à l&#39;acquisition de détermination de temps (TRA). </li><li> Sélectionnez les éléments à analyser, Fe, Cu, Zn, Co, I, ainsi que d&#39;autres éléments d&#39;intérêt, et de définir des temps d&#39;intégration (typiquement entre 0,05-0,3 sec). Après les éléments d&#39;intérêt d&#39;unre choisie, régler le temps d&#39;acquisition en fonction du temps d&#39;exécution pour la chromatographie (par exemple, 900 secondes pour une chromatographie run 15 min). </li><li> Réglage manuel du ICP - MS pour l&#39;hélium sensibilité et collision cellulaire (He) des débits de gaz avec le tampon de chromatographie circulant en utilisant Cs et Sb inclus dans le tampon. Les débits sont généralement He ~ 1 ml / min, inférieurs à ceux utilisés pour l&#39;analyse en vrac. Une fois les chiffres d&#39;ions métalliques se sont stabilisés et écart type relatif (RSD) les valeurs sont en dessous de 5%, le système est prêt à l&#39;emploi. </li></ol></li><li> Faire échantillons listes exécuter à la fois des programmes logiciels ICP-MS HPLC et. La liste échantillon d&#39;exécution contient l&#39;ordre dans lequel chacun des échantillons est à injecter ainsi que le nom par lequel les données seront enregistrées. Vérifiez que le nombre total d&#39;échantillons dans le match de la liste entre les deux programmes. </li><li> Démarrez le lot d&#39;échantillons pour l&#39;ICP-MS avant la HPLC, comme l&#39;injection de l&#39;échantillon par la HPLC déclenchera l&#39;ICP - MS pour commencer la collectedonnées. Si cela ne se fait pas dans le bon ordre, il se traduira par des données manquantes. </li><li> Générer des points de courbe d&#39;étalonnage en injectant des volumes variables de la SOD et FTN standard mélangé de 200 ug / L à 6000 ug / L injecté sur colonne pour Cu et Zn et 2000 ug / L à 60 000 ug / L pour Fe. Les volumes d&#39;injection vont de 1 à 30 ul. Note: Ces gammes de concentration comprennent les concentrations de Fe, Cu et Zn, typiquement observés dans des homogénats complexes. Pour les échantillons qui ne contiennent que des protéines purifiées la portée maximale de la courbe doit être ajustée en conséquence. Comme la quantité de métal associée à la protéine peuvent nécessiter une plage inférieure ou supérieure car il y a moins de contamination de l&#39;échantillon d&#39;autres facteurs. </li><li> Analyser chacune de la culture des échantillons inconnus du tissu, du plasma ou de la cellule. </li></ol> 5. Analyse des données, manipulation et visualisation <ol><li> Stocker les données de la valeur séparées par des virgules (csv) format de fichier et charger into Les programmes de traitement selon les besoins. </li><li> Afin de contrôler la dérive de l&#39;instrument, diviser les chiffres par seconde pour chaque élément par les comptes par seconde soit pour Cs ou Sb. </li><li> Générer des courbes d&#39;étalonnage pour chacun des éléments. <ol><li> Déterminer la zone sous le pic de métal qui correspond à la métalloprotéine qu &#39;il est lié à chacun des injections en effectuant une intégration des pics dans le logiciel d&#39;analyse de données préférée. </li><li> Tracer la surface sous le pic de métal contre la quantité totale du métal qui a été injecté sur la colonne dans chaque série, 200 - 6.000 mg / L pour le Cu et Zn et 2000 - 60 000 ug / L pour Fe. Effectuer une analyse de régression linéaire en fonction du protocole logiciel. </li><li> Utiliser les résultats de la pente de l&#39;analyse de régression linéaire comme un facteur pour convertir les chiffres par seconde pg / sec. Divisez chacun des comptes par des seconds points de données à travers le chromatogramme par le gradient de la valeur de la ligne. </li></ol></li><li> Graphiquement les donnéespg / sec contre le temps de chromatogramme. Déterminer l&#39;aire sous les pics d&#39;intérêt. La surface sous le pic représente la quantité totale de métal que la protéine est liée à, en pg. </li><li> Générer un étalonnage sur la base du poids moléculaire des métalloprotéines connus et l&#39;heure à laquelle ils éluent. Utilisez cette option pour estimer la taille des pics de protéines dans des échantillons complexes. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

Assurer l&#39;état natif de la protéine signifie une attention particulière aux tampons utilisés et le stockage de l&#39;échantillon sont nécessaires. Toutes ces techniques de chromatographie ou des techniques de préparation d&#39;échantillons peuvent être utilisés. Il est important que les tampons utilisés dans la préparation des échantillons et la Chromatographie sont dépourvus de chélateurs de métaux et tampons d&#39;utilisation qui miment le pH et les concentrations salines physiologiques. Autres conditions pour éviter incluent le chauffage de l&#39;échantillon ou l&#39; ajout de dénaturants de protéines (par exemple, l&#39; urée). Il est essentiel de réduire au minimum le nombre de cycles de gel-dégel. La capacité de la mémoire tampon choisie pour lier les métaux divalents est également importante et est une raison pour laquelle les tampons Tris ou d&#39;ammonium, de nitrate sont choisis sur des tampons à base de phosphate. La résolution et le pic à faible capacité de l&#39;exclusion de taille Chromatographie par rapport à d&#39;autres formes de chromatographie est une limitation majeure de cette technique. Cependant, la nature douce de taille exclusion chromaphy est important de maintenir l&#39;état natif de la protéine et ainsi préserver les obligations-protéine de métal relativement faibles. L&#39;exigence de maintenir l&#39;état natif des protéines nécessite une attention particulière au traitement des échantillons , y compris la limitation du nombre de cycles de gel - dégel, ce qui évite des chélateurs de métaux (par exemple, EDTA) ou sels et détergents chaotropiques. Cette faible résolution de cette technique influe sur la capacité de quantifier la quantité de métal associée à une protéine spécifique si elle est dans un échantillon complexe que les pics observés contiendra plus d&#39;une protéine. Par conséquent, la quantité de métal déterminée au moyen de l&#39;intégration du pic serait une indication de la quantité totale de métal associé à la totalité des protéines en éluant à ce point dans le temps et non pas seulement une protéine spécifique. Afin de pallier cette limitation de la protéine d&#39;intérêt devrait être davantage purifié dans des conditions natives. Cela permettrait la quantification dele métal associé à cette protéine pour être signalé avec un degré plus élevé de certainity. Une autre limitation potentielle de cette technique serait la perte de protéines due à une liaison non réversible à la colonne. Afin de déterminer si cela se produit une expérience de récupération doit être effectuée de sorte que la quantité de protéine éluant de la colonne est analysée pour déterminer si cela correspond à la quantité injectée. La même chose peut être faite en mesurant la teneur en métal du matériau d&#39;élution et la matière de départ en vrac par ICP-MS. La récupération de la colonne peut varier en fonction des conditions utilisées, mais il a été montré que le rétablissement complet des protéines provenant d&#39; une colonne d&#39;exclusion de taille est possible 9. Ainsi, il est important de vérifier si oui ou non il y a une perte dans les conditions d&#39;exploitation utilisé. Les modifications apportées au protocole peuvent être liés aux normes de métalloprotéines qui sont utilisés, ainsi que les éléments analysés. Le type de metalloprotein nous normeed différera en fonction des éléments qui sont d&#39;intérêt. Pour les éléments tels que Cu, Fe et Zn protéines, SOD et la ferritine sont employés. Toute autre metalloprotein ayant stoichometries connus peuvent également être utilisés et des exemples ont été représentés ici. Une complication majeure qui peut résulter de l&#39;utilisation de cette technique est l&#39;accumulation de cristaux de sel dans la torche de l&#39;ICP-MS. Afin d&#39;éviter l&#39;accumulation de cristaux de sel, la torche est lavée avec de l&#39;eau distillée après chaque tranche de 500 - 1 000 ml de tampon qui a été transmis à travers le système ou, lorsqu&#39;il est déterminé par inspection visuelle que la torche doit être lavée. Un autre problème qui peut se poser est une baisse plus rapide de la propreté de l&#39;échantillon et d&#39;extraction des cônes. Celles-ci doivent être nettoyés régulièrement en suivant les protocoles du fabricant. La préparation de l&#39;échantillon initial est l&#39;étape la plus critique dans le protocole. S&#39;il y a des changements à la protéine - complexe métallique l&#39;information généré ne sera pas valide. C&#39;est l&#39;une des principales limitations de la technique; En outre, l&#39;utilisation de la basse résolution, une colonne d&#39;exclusion stérique donne une vue détaillée limitée de la complexité réelle de métalloprotéines en biologie. La technique décrite ici permet l&#39;expansion de la connaissance de la metalloproteome d&#39;un organisme. analyse en vrac ne donne qu&#39;une indication grossière de modifications à la quantité de métal dans un échantillon. Outre les considérations générales qui doivent être pris en compte, cette technique fournit un outil qui peut être utilisé pour quantifier la quantité de métal associée à des protéines ainsi que l&#39;identification des métalloprotéines qui diffèrent en comparant les traces obtenues. L&#39;utilisation de cette technique peut être utilisée pour identifier les différences entre les états pathologiques. Les métalloprotéines identifiés peuvent ensuite être étudiés pour aider à déterminer le rôle qu&#39;ils jouent dans les processus de la maladie. L&#39;application de césure ICP-MS a une croissanceavenir afin de déterminer le rôle des médicaments qui ont un hétéroatome tel que le platine, l&#39;iode ou le cuivre comme ICP-MS peut être utilisée pour identifier les protéines qui se lie au médicament.

métaux essentiels jouent un rôle vital dans les fonctions biologiques normales, y compris les voies de messagers secondaires, les voies du métabolisme et les fonctions des organites. 30% de toutes les protéines sont considérées comme métallo - 1 et 50% de toutes les enzymes 2. Métalloenzymes utilisent ces métaux traces en tant que cofacteurs pour catalyser des réactions chimiques, stabilisent la structure des protéines, ainsi que pour des rôles régulateurs tels que des messagers secondaires. Certains des éléments de traces les plus étudiés en ce qui concerne la neurodégénérescence sont le cuivre, le fer et le zinc 3. Ils sont considérés comme étant impliqués dans de nombreuses voies de la maladie où par dyshomeostasis peut avoir des effets néfastes. Par exemple , l&#39;état du métal de la superoxyde dismutase (SOD) influe directement sur ​​la durée de vie et le phénotype des modèles de souris transgéniques de type familial de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) 4. Dans la maladie d&#39;Alzheimer, metalloproteomics techniques ont été utilisées pour découvrir une diminution de l&#39;état du métal de la transferrine dans la pLasma 5. Ces études mettent en évidence les importants métalloprotéines de rôle peuvent jouer dans la maladie. L&#39;étude de métalloprotéines directement à partir de tissus biologiques est un champ de développement. Bien que certaines métalloenzymes ont été caractérisés, la majorité reste encore non caractérisé ou inconnue 6. L&#39; un des principaux défis dans métalloprotéines de mesure est la nécessité de maintenir l&#39;état natif de la protéine 7. Classical bottom-up techniques protéomiques reposent sur la digestion des protéines en peptides. Ce processus perturbe l&#39;interaction non covalente de métaux et de leurs protéines. Ainsi, aucune information sur l&#39;état de métal d&#39;une protéine est acquise. Une façon de surmonter ce problème est d&#39;utiliser la chromatographie d&#39;exclusion stérique associé à plasma à couplage inductif - 8,9 spectrométrie de masse (SEC-ICP-MS). Cela génère des informations sur la taille approximative de la protéine ainsi que tous les métaux qui sont associated 10 avec elle. En outre, l&#39;exclusion de taille est une technique chromatographique douce qui peut préserver l&#39;état natif d&#39;un complexe d&#39;enzyme ou protéine-protéine. Un avantage d&#39;utiliser le plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (ICP-MS) est la nature quantitative de la technologie. L&#39; utilisation d&#39; un ensemble de normes de métalloprotéines il est possible de fournir une quantification absolue de métalloprotéines à partir d&#39; échantillons biologiques 9,11. Ce résultat est obtenu en générant une courbe d&#39;étalonnage en injectant métallo connues sur une plage de concentrations de métaux. Ce protocole montre un exemple de la façon dont cela peut être réalisé pour une variété de normes de métalloprotéines. Dans cet article, nous visons à créer des courbes standard pour les métaux qui sont largement étudiés dans les domaines biologiques, y compris le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), l&#39;iode (I), et le cobalt (Co).

<table><tbody><tr><td>Pompe binaire Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Échantillonneur automatique Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat d’échantillonneur automatique Agilent série 1200</td><td>Agilent</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Compartiment de colonne thermostaté</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de longueur d’onde variable Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7700 ICP-MS</td><td>Agilent</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; base de traces de métaux hydroxyde d’ammonium&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td> Nitrate d’ammonium&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>256064</td><td>Préparez une solution fraîche de 200 mM le jour de l’expérience</td></tr><tr><td>. Antinomie&nbsp ;</td><td>Choix analytique&nbsp ;</td><td>10002-3&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Céruloplasmine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Césium&nbsp ;</td><td>Choix analytique&nbsp ;</td><td>100011-1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Inhibiteurs de protéase complets, sans EDTA. &nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td> Conalbumine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td> Concanavalin A de Canavalia ensiformis (haricot jack)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Cu, Zn Superoxyde dismutase&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Ferritine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>² ; Étalons d’étalonnage multiélémentaires ICP-MS&nbsp ;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>Livré jusqu’aux concentrations requises en acide nitrique à 1 %</td></tr><tr><td>. Spectrophotomètre UV microvolume&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; 65 % d’acide nitrique&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>100441</td><td>Dilué à 1 % pour utilisation</td></tr><tr><td>&nbsp ; Tube d’œil&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Agilent</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td> Colonne d’exclusion stérique BioSEC-3 Colonne PLC., 4,6 x 300 mm, 3 &mu ; m, 150 et Aring ; &nbsp ;</td><td>Agilent</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Approvisionnement en chimie</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Chlorhydrate de Tris&nbsp ;</td><td>ICN Biomedicals inc.&nbsp ;</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Thyroglobuline&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>° ; Vitamine B12</td><td>Sigma</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

normes pour quantitative metalloproteomic analyse utilisation taille exclusion icp-ms

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Les métaux sont essentiels à la fonction des protéines en tant que cofacteurs pour catalyser les réactions chimiques. La perturbation de l’homéostasie des métaux est impliquée dans un certain nombre de maladies, notamment la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson, mais le rôle exact que jouent ces métaux n’a pas encore été entièrement élucidé. L’identification des métalloprotéines rencontre de nombreux défis et difficultés. Nous rapportons ici une approche qui permet de quantifier les métalloprotéines dans des échantillons complexes. Ceci est réalisé à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique couplée à la spectrométrie plasma - masse à couplage inductif (SEC-ICP-MS). À l’aide de six métalloprotéines connues, la colonne d’exclusion stérique peut être calibrée et les oligo-éléments respectifs (fer, cuivre, zinc, cobalt, iode) peuvent être utilisés pour la quantification. Des traces SEC-ICP-MS du cerveau humain et du plasma sont présentées. L’utilisation de ces étalons métalloprotiques permet de comparer quantitativement les abondances métalloprotéiques entre échantillons biologiques. Cette technique est sur le point de contribuer à mettre en lumière le rôle des métalloprotéines dans les maladies neurodégénératives ainsi que dans d’autres maladies où des déséquilibres en oligo-éléments sont impliqués.

L&#39;utilisation des normes de métalloprotéines permet l&#39;étalonnage de la colonne d&#39;exclusion de taille. La figure 1A montre le profil d&#39;élution pour les normes thyroglobuline, la ferritine, la céruloplasmine, la Cu / Zn SOD et la vitamine B 12 sur la base du métal qu&#39;ils sont liés à (Fe, co, Cu, Zn et I). la figure 1B représente la courbe d&#39;étalonnage pour la colonne d&#39;exclusion de taille sur la base du poids moléculaire des étalons de protéine et de leur temps d&#39;élution, présenté sous la forme du volume d&#39;élution (Ve) , divisé par le volume de vide de la la colonne (Vo). Les protéines utilisées pour générer cette courbe standard sont concanavaline A, conalbumine, céruloplasmine, ferritine, SOD et thyroglobuline. La figure 2A montre l&#39;élution de la ferritine dans une plage de 2000 - 60 000 pg de Fe injecté sur la colonne et la figure 2D est une analyse de régression effectuée en utilisant la pzone de EAK. Les figures 2B et 2C sont les profils d&#39;élution pour Cu / Zn SOD pour Cu et Zn et 2E et 2F sont les analyses de régression générées à l&#39; aide des zones de pointe. Les résultats de l&#39;analyse de régression sont utilisés pour convertir les données brutes en coups / s à pg / s de sorte que la quantité de métal associée à la protéine peut être déterminée quantitativement. La conversion se fait en divisant le compte / sec par la pente de la régression linéaire (par exemple, 334,6 (coups / s) x (s / p) de cuivre). Comme indiqué précédemment, cette technique peut être utilisée pour identifier les métalloprotéines dans des échantillons biologiques complexes. Cerveau humain et de plasma ont été soumis à cette technique et les figures 3 et 4, respectivement, montrent les résultats obtenus. Cerveau humain séparé par SEC-ICP-MS est représenté sur les figures 3A à 3C, dont chacun représente un métal différent de<html> intérêt (Cu, Zn ou Fe). Les figures 4A à 4C montrent les traces obtenues lorsque du plasma humain est soumis à cette technique. La complexité et l&#39;abondance de l&#39;échantillon auront un impact sur le nombre de pics qui sont vus. Comme le plasma attendu est dominé par quelques métalloprotéines dont céruloplasmine et la transferrine. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Figure 1. Calibration de chromatographie d&#39; exclusion stérique - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse utilisant Connu profil Métalloprotéines (A) Elution pour les normes de métalloprotéines en fonction de leurs métaux respectifs.. (B) poids moléculaire courbe d&#39;étalonnage pour des protéines étalons thyroglobuline (i), la ferritine (ii), la céruloplasmine (iii), conalbumine (iv), SOD Cu / Zn (v) et la concanavaline A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Figure 2. Utilisation de ferritine et Cu / Zn SOD en tant que normes Métalloprotéines pour déterminer la quantité de Cu, Fe ou Zn associés à Métalloprotéines dans un échantillon biologique complexe (A) Profil d&#39;élution de ferritine sur la plage d&#39;injection de 2000 -. 60.000 ug / L de fer. (B) et (C) Profil d&#39;élution pour SOD Cu / Zn dans l&#39;intervalle d&#39;injection de 200 - 6000 mg / L de cuivre et de zinc, respectivement. (D), (E) et (F) montrent les résultats de l&#39; analyse de régression pour les métaux fer, le cuivre et le zinc, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 3. Cu, Fe et Zn Metalloproteome du cerveau humain. (A) trace de cuivre (B) trace de fer (C) Zinc trace. Elution des normes de protéines pour chaque métal est représenté par la trace noire avec leur poids moléculaire indiquée sous le graphique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Figure 4. Cu, Fe et Zn Metalloproteome pour le plasma humain. (A) trace de cuivre (B) trace de fer (C) Zinc trace. L&#39;élution des étalons de protéine pour chaque métal est représentée par la trace noire avec leur poids moléculairedicated sous le graphique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La chromatographie d’exclusion stérique couplée à un plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (ICP-MS) est un outil puissant pour mesurer les changements dans l’abondance des métalloprotéines directement à partir d’échantillons biologiques. Nous décrivons ici un ensemble d’étalons métalloprotéiques utilisés pour estimer la masse moléculaire et la quantité de métal associée à des protéines inconnues.

Normes pour Quantitative Metalloproteomic Analyse Utilisation Taille Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

L'objectif général de cette technique est de pouvoir quantifier différents métalloprotéines dans des échantillons complexes en se basant sur l'utilisation d'étalons de métalloprotéines connus. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles concernant le rôle des métaux en biologie. Par exemple, comment l'état métallique d'une protéine évolue-t-il au cours d'une maladie ?Un avantage clé de cette technique est qu'elle permet de mesurer l'état métallique d'une protéine dans son état natif. La démonstration de la technique sera assurée par Amber Lothian, étudiante au doctorat de mon laboratoire. Pour commencer, homogénéisez les tissus ou les échantillons de culture cellulaire manuellement par passages en seringue ou par sonication pendant cinq minutes à l'aide d'une solution saline tamponnée au Tris.Clarifier les homogénats par centrifugation à 16 000 ×g pendant cinq minutes. Après avoir récupéré le surnageant obtenu, normaliser la quantité totale de protéines en déterminant les concentrations en protéines comme décrit dans le protocole écrit. Préchauffer et régler le spectromètre de masse à plasma induit selon les protocoles du fabricant.Étendre les étalons de métalloprotéines afin que la concentration se situe dans la plage de zéro à 500 microgrammes par litre, en utilisant de l'acide nitrique à un pour cent. Pour obtenir des étalons dans cette plage, ne pas utiliser de dilutions supérieures à un sur vingt. Établir l'ordre des injections en analysant d'abord les sept niveaux de calibration.Des concentrations allant de zéro à 500 microgrammes par litre, suivies par les étalons de métalloprotéines. Les sept niveaux de calibration sont zéro, un, cinq, dix, 50, 100 et 500 microgrammes par litre. Ensuite, sélectionnez les éléments d'intérêt.Ici, utilisez le fer, le cuivre, le zinc, le cobalt et l'iode, car ce sont les éléments auxquels les étalons protéiques sont liés. Sélectionnez les éléments dans la méthode d'acquisition en ouvrant l'onglet du sélecteur d'éléments, puis ajoutez les éléments ainsi que les masses de leurs isotopes respectifs à analyser.Ensuite, effectuez l'analyse des échantillons à l'aide de l'instrument. Le logiciel de l'instrument crée automatiquement les courbes de calibration pour chacun des éléments analysés. Utilisez les courbes de calibration pour déterminer la concentration en métal dans les échantillons inconnus.À partir des résultats d'analyse en vrac, préparez les étalons de métalloprotéines contenant les trois oligo-éléments les plus abondants dans les tissus de mammifères en utilisant un mélange de cuivre, de superoxyde dismutase au zinc et de ferritine. Rincez les pompes de chromatographie rapide haute performance, ou HPLC, avec un tampon de nitrate d'ammonium 200 millimolaire pendant cinq minutes à un débit de cinq millilitres par minute. Une fois le système rincé, réglez le débit à zéro virgule un millilitre par minute.Et connectez la colonne d'exclusion latérale. Reliez l'extrémité opposée de la colonne au détecteur UV, réglez la mesure de l'absorbance à 280 nanomètres, en utilisant un tube capillaire. Augmentez progressivement le débit de la colonne par incréments de 0,1 mL/min, jusqu'à atteindre un débit final de 0,4 mL/min.Pendant ce temps, vérifiez les raccords du tube à la colonne afin de détecter d'éventuelles fuites. Surveillez la pression du système pour vous assurer qu'elle ne dépasse pas les limites requises par la colonne, en observant l'évolution de la pression sur le chromatogramme dans le logiciel. Laissez la colonne s'équilibrer au débit requis pendant cinq à dix volumes de colonne.Une fois l'équilibre atteint, connectez les instruments afin de permettre l'analyse des échantillons. Configurez la méthode de CPG en faisant circuler le tampon A à travers la colonne à un débit de 0,4 millilitre par minute pendant 15 minutes. Placez le SMIC en mode veille avant de modifier les paramètres matériels.Une fois en mode veille, désactiver la communication pour l'échantillonneur automatique et changer l'introduction de l'échantillon vers un autre. Utiliser un tube en PEEK pour relier le flux sortant du détecteur UV directement au nébuliseur de l'ICPMS. Mettre l'ICPMS sous tension et laisser l'appareil chauffer pendant 10 à 20 minutes.Une fois que le plasma est allumé, reliez le câble à distance de la spectrométrie de masse à plasma induit (ICPMS) à l’arrière du système d’échantillonnage automatique de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Effectuez cette étape après l’allumage du plasma. Sinon, le système HPLC s’arrêtera automatiquement, car l’ICPMS sera éteint.Modifier la méthode ICPMS pour collecter des données en LC-ICPMS en changeant d'abord la méthode d'acquisition du mode spectre au mode d'acquisition résolu en temps. Ensuite, sélectionner les éléments à analyser : fer, cuivre, zinc, cobalt, iode, ainsi que tout autre élément d'intérêt, et régler les temps d'intégration.Une fois les éléments d'intérêt choisis, ajustez le temps d'acquisition afin qu'il corresponde au temps d'exécution de la chromatographie. Régler manuellement la sensibilité du ICPMS et les débits de gaz hélium dans la cellule de collision à l’aide d’un tampon de chromatographie contenant du césium et de l’antimoine. Lorsque les signaux des ions métalliques sont stabilisés et que les valeurs d’écart-type relatif sont inférieures à cinq pour cent, le système est prêt à être utilisé.Créez des listes d'exécution des échantillons dans les logiciels HPLC et ICPMS. La liste d'exécution des échantillons indique l'ordre dans lequel chaque échantillon doit être injecté, ainsi que le nom sous lequel les données seront enregistrées.Vérifiez que le nombre total d'échantillons dans la liste corresponde entre les deux programmes. Démarrez le lot d'échantillons pour l'ICPMS avant la CPG, car l'injection de l'échantillon par la CPG déclenchera la collecte de données par l'ICPMS. Si cela n'est pas effectué dans le bon ordre, cela entraînera une perte de données.Générez des points de courbe d'étalonnage en injectant des volumes variables du mélange étalon de superoxyde dismutase et de ferritine. Les volumes injectés varient d'un microlitre à 30 microlitres. Enfin, analysez chacun des échantillons inconnus, tels que des tissus, du plasma ou des cultures cellulaires, avant d'analyser les données comme décrit dans le protocole écrit.L'illusion de la ferritine sur une gamme allant de 2000 à 60 000 picogrammes de fer injectés sur la colonne est présentée. Une analyse de régression a été effectuée à l'aide de la surface du pic. Les profils d'illusion pour le cuivre, le zinc et la superoxyde dismutase sont montrés à la fois pour le cuivre et le zinc.Les analyses de régression générées à l’aide des aires des pics sont également présentées. Les résultats de l’analyse de régression sont utilisés pour convertir les données brutes exprimées en comptes par seconde en picogrammes par seconde, afin de déterminer quantitativement la quantité de métal associée à la protéine.Cette technique peut être utilisée pour identifier des métalloprotéines dans des échantillons biologiques complexes. Ici, on présente un cerveau humain séparé par SEC ICPMS, chacun représentant un métal d'intérêt différent.À savoir, le cuivre, le zinc ou le fer. On montre ici les tracés obtenus lorsque le plasma humain est soumis à cette technique. La complexité et l'abondance de l'échantillon influenceront le nombre de pics observés.Comme prévu, le plasma est dominé par quelques métalloprotéines, notamment la céruléoplasmine et la transferrine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment configurer un instrument afin de mesurer l'état natif des métalloprotéines dans des échantillons complexes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée avec succès en trois à quatre heures.Cela permet d'analyser de 20 à 36 échantillons en une seule journée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'utiliser les étalons appropriés de métalloprotéines, tels que la SOD cuivre-zinc si vous vous intéressez au cuivre et au zinc. Ainsi que les étalons internes dans le tampon, comme le césium, qui permet de corriger tout dérive de l'appareil au fil du temps.Après avoir suivi cette procédure, vous pouvez également mettre en œuvre d'autres formes de spectrométrie de masse afin de répondre à des questions importantes. Par exemple, quelles sont les métalloprotéines présentes dans mon échantillon ? Cela peut être réalisé grâce à des digestions standards suivies d'un séquençage des peptides protéiques par spectrométrie de masse.Ou, en analysant les protéines intactes, dans leur état natif. Après son développement, cette technique pourra ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique afin de comprendre le rôle des métalloprotéines dans des maladies telles que la maladie d'Alzheimer. N'oubliez pas de manipuler avec précaution l'acide nitrique concentré et les échantillons cliniques.Des équipements de protection individuelle appropriés doivent être portés.

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Normes pour Quantitative Metalloproteomic Analyse Utilisation Taille Exclusion ICP-MS

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