Normes pour Quantitative Metalloproteomic Analyse Utilisation Taille Exclusion ICP-MS

L’objectif global de cette technique est de pouvoir quantifier différentes métalloprotéines dans des étalons complexes en se basant sur l’utilisation d’étalons métalloprotéiques connus. Cette méthode peut répondre à des questions clés sur le rôle des métaux en biologie. Par exemple, comment le statut métallique d’une protéine change-t-il au cours d’une maladie ?

L’un des principaux avantages de cette technique est qu’elle permet de mesurer l’état métallique d’une protéine dans son état natif. La démonstration de la technique sera faite par Amber Lothian, une étudiante au doctorat de mon laboratoire. Pour commencer, des échantillons de tissus homogénéisés, ou de cultures cellulaires, par descentes manuelles ou sonication pendant cinq minutes à l’aide d’une solution saline tamponnée Tris.

Clarifier les homogénats par centrifugation à 16 000 fois G, pendant cinq minutes. Après avoir recueilli le surnageant résultant, normalisez la quantité totale de protéines en déterminant les concentrations de protéines comme décrit dans le protocole textuel. Réchauffez et réglez le spectromètre à plasma à couplage inductif, en utilisant les protocoles du fabricant.

Diluez les étalons de métalloprotéines pour profiter de la chute dans la gamme de zéro à 500 microgrammes par litre, en utilisant un pour cent d’acide nitrique. Pour atteindre des normes dans cette plage, n’utilisez pas de dilutions supérieures à un et 20. Établissez l’ordre des injections en analysant d’abord les sept niveaux de calibration.

Concentrations allant de zéro à 500 microgrammes par litre, suivies des étalons métalloprotéiques. Les sept niveaux d’étalonnage sont zéro, un, cinq, dix, 50, 100 et 500 microgrammes par litre. Ensuite, sélectionnez les éléments qui vous intéressent.

Ici, utilisez du fer, du cuivre, du zinc, du cobalt et de l’iode. Car ce sont les éléments auxquels les normes protéiques sont liées. Sélectionnez les éléments de la méthode d’acquisition en ouvrant l’onglet du sélecteur d’éléments et en ajoutant les éléments et leurs masses isotopiques respectives à analyser.

Ensuite, effectuez une analyse d’échantillon avec l’instrument. Le logiciel de l’instrument crée automatiquement les courbes d’étalonnage pour chacun des éléments analysés. Utilisez les courbes d’étalonnage pour déterminer la concentration de métal dans les échantillons inconnus.

À partir des résultats de l’analyse en vrac, générez les étalons métalloprotéiques qui incluent les trois oligo-éléments les plus abondants dans les tissus des mammifères en utilisant un mélange de cuivre, de superoxyde de zinc dismutase et de ferritine. Purger les pompes de chromatographie rapide hyperformance, ou HPLC, avec un tampon de nitrate d’ammonium de 200 millimolaires pendant cinq minutes à un débit de cinq millilitres par minute. Une fois le système purgé, réglez le débit au point zéro un millilitre par minute.

Et connectez la colonne d’exclusion du côté. Connectez l’extrémité opposée de la colonne au détecteur UV, réglez l’absorbance de mesure à 280 nanomètres, à l’aide d’un tube de pointe. Augmentez progressivement le débit de la colonne par incréments de zéro virgule un millilitre par minute, jusqu’à ce qu’un débit final de zéro virgule quatre millilitres par minute soit atteint.

Pendant ce temps, vérifiez que les raccords des tubes à la colonne ne présentent pas de fuites. Surveillez la pression de ce système pour vous assurer qu’elle ne dépasse pas les exigences de la colonne en observant la trace de pression sur le chromatogramme dans le logiciel. Laissez la colonne s’équilibrer au débit requis sur cinq à 10 volumes de colonne.

Une fois qu’il est équilibré, connectez les instruments pour permettre l’analyse de l’échantillon. Configurez la méthode HPLC pour pomper le tampon A sur la colonne au point zéro quatre millilitres par minute, pendant 15 minutes. Placez l’ICPMS en mode veille avant de modifier les paramètres matériels.

Une fois en mode veille, désactivez la communication de l’échantillonneur automatique et remplacez l’introduction de l’échantillon par une autre. Utilisez un tube PEEK pour connecter le flux sortant du détecteur UV directement au nébuliseur de l’ICPMS. Mettez l’ICPMS sous tension et laissez l’instrument se réchauffer pendant 10 à 20 minutes.

Une fois le plasma enflammé, connectez le câble à distance de l’ICPMS à l’arrière de l’échantillonneur automatique HPLC. Faites-le une fois que le plasma s’est enflammé. Sinon, le système HPLC s’arrêtera automatiquement, car l’ICPMS n’est pas allumé.

Modifiez la méthode ICPMS pour collecter des données pour LC ICPMS en modifiant d’abord la méthode d’acquisition du spectre à l’acquisition à résolution temporelle. Ensuite, sélectionnez les éléments à analyser. Fer, cuivre, zinc, cobalt, iode, ainsi que tout autre élément d’intérêt, et des temps d’intégration définis.

Une fois les éléments d’intérêt choisis, ajustez le temps d’acquisition pour qu’il corresponde au temps d’exécution de la chromatographie. Réglez manuellement l’ICPMS pour la sensibilité et les débits d’hélium gazeux des cellules de collision avec un tampon de chromatographie s’écoulant avec du césium et de l’antimoine inclus dans le tampon. Une fois que le nombre d’ions métalliques s’est stabilisé et que les valeurs d’écart-type relatif sont inférieures à cinq pour cent, le système est prêt à l’emploi.

Créez des exemples de listes d’exécution dans les logiciels HPLC et ICPMS. La liste d’exécutions d’échantillons contient l’ordre dans lequel chacun des échantillons doit être injecté. Ainsi que le nom sous lequel les données seront enregistrées.

Vérifiez que le nombre total d’échantillons de la liste correspond entre les deux programmes. Démarrez le lot d’échantillons pour l’ICPMS avant la HPLC, car l’injection de l’échantillon par la HPLC déclenchera l’ICPMS pour commencer à collecter des données. Si cela n’est pas fait dans le bon ordre, il en résultera des données manquantes.

Générez des points de courbe d’étalonnage en injectant des volumes variables de l’étalon mixte de superoxyde dismutase et de ferritine. Les volumes d’injection varient d’un microlitre à 30 microlitres. Enfin, analysez chacun des échantillons inconnus, tels que les tissus, le plasma ou la culture cellulaire, avant d’analyser les données comme décrit dans le protocole textuel.

L’illusion de ferritine sur une plage de 2000 à 60 000 picogrammes de fer injectés sur la colonne est montrée. Une analyse de régression a été effectuée à l’aide de l’aire du pic. Les profils d’illusion pour le cuivre, le zinc, la superoxyde dismutase sont illustrés pour le cuivre et le zinc.

Les analyses de régression générées à partir des zones de pics sont également présentées. Les résultats de l’analyse de régression sont utilisés pour convertir les données brutes en nombres par seconde en picogrammes par seconde. Pour que la quantité de métal associée à la protéine puisse être déterminée quantitativement.

Cette technique peut être utilisée pour identifier les métalloprotéines dans des échantillons biologiques complexes. Ici, le cerveau humain séparé par SEC ICPMS est montré. Chacun d’entre eux représente un métal d’intérêt différent.

À savoir, le cuivre, le zinc ou le fer. On voit ici les traces obtenues lorsque le plasma humain est soumis à cette technique. La complexité et l’abondance de l’échantillon auront un impact sur le nombre de pics observés.

Comme prévu, le plasma est dominé par quelques métalloprotéines, dont la céruloplasmine et la transferrine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration d’un instrument pour mesurer l’état natif des métalloprotéines dans des échantillons complexes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée avec succès en trois à quatre heures.

Cela permet d’analyser de 20 à 36 échantillons en une seule journée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser les étalons métalloprotéiques appropriés, tels que le cuivre zinc SOD si vous vous intéressez au cuivre et au zinc. Ainsi que les étalons internes dans le tampon, tels que le césium, qui vous permet de corriger toute dérive de l’instrument au fil du temps.

En suivant cette procédure, vous pouvez également mettre en œuvre d’autres formes de spectrométrie de masse pour répondre à des questions importantes. Par exemple, quelles sont les métalloprotéines présentes dans mon échantillon ? Cela peut être fait par des voyages standard dans la digestion et le séquençage des peptides de protéines de masse.

Ou, en analysant les protéines intactes, dans leur état natif. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la protéomique pour comprendre le rôle des métalloprotéines dans des maladies, telles que la maladie d’Alzheimer. N’oubliez pas que travailler avec de l’acide nitrique concentré et des échantillons cliniques.

Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté.