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L'objectif général de cette méthode est d'administrer des déclencheurs d'interférence ARN chez Anopheles gambiae afin d'initier des inhibitions géniques commençant au stade pupal du développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie des vecteurs et à identifier les gènes jouant un rôle au cours des stades développementaux pré-adultes ou début de l'âge adulte. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre aux chercheurs la possibilité de réaliser rapidement des études fonctionnelles du génome, en amorçant l'inhibition génique durant l'intervalle de développement, le stade pupal, période durant laquelle les protocoles d'injection d'interférence ARN n'avaient pas été mis en œuvre auparavant.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d'injection peuvent être difficiles à maîtriser en raison de la précision requise et de la nature délicate des nymphes durant ce stade de développement. Après avoir sélectionné le gène d'intérêt, identifiez une région de 200 à 800 paires de bases dont on prévoit qu'elle n'aura aucun effet hors cible, puis effectuez une amplification PCR standard afin d'obtenir un modèle pour la synthèse d'ARN double brin encadré par une séquence promoteur T7. Ensuite, synthétisez l'ARN double brin et purifiez les produits à l'aide d'un kit commercial de synthèse in vitro.

Ajustez la concentration finale en ARN à trois microgrammes par microlitre. Ensuite, utilisez un gel d'agarose standard à 2 % pour comparer une demi-microlitre d'ARN double brin avec l'ADN matrice et des marqueurs standards. Une fois l'électrophorèse terminée, vérifiez la qualité et la longueur de la bande d'ARN double brin.

Il ne devrait y avoir aucun produit non spécifique visible. L'ARN double brin migre plus lentement que l'ADN matrice. Pour le stockage, préparez des aliquotes d'ARN double brin et conservez-les à moins 20 degrés Celsius.

Commencez par préparer le colorant Fast Green FCF. Diluez d'abord le colorant à 0,1 % volume par volume dans de l'eau sans RNase. Ensuite, transférez des volumes d'un microlitre de la préparation dans des tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre.

Chauffer les tubes chargés à 65 degrés Celsius pendant environ trois heures afin d'évaporer l'eau. Ensuite, refroidir les tubes pendant au moins 30 minutes avant d'utiliser les pigments solides. Préparer ensuite des aiguilles d'injection en verre étiré à partir de tubes en verre borosilicaté.

Régler le tireur d'aiguille pour un diamètre de pointe compris entre 10 et 30 micromètres. Pour un tireur de capillaires NARISHIGE, régler le premier chauffage sur 100 et le second chauffage sur 70. Ensuite, fixer la micropipette capillaire en place et procéder au tirage.

Maintenant, préparez la station d'injection. Sélectionnez une plateforme pouvant être facilement manipulée sous le microscope. Sur la plateforme, fixez d'abord une feuille de papier filtre épaisse à l'aide de ruban adhésif.

Ensuite, fixez avec du ruban adhésif une feuille de papier filtre fin sur le papier filtre épais. Puis, ajoutez 10 microlitres de chaque ARN double brin à injecter dans les tubes contenant le colorant solide, et remettez en suspension le colorant. Conservez ces tubes sur de la glace.

Prélève maintenant les nymphes destinées à être injectées. Remplis une boîte de Pétri de 60 millimètres avec 10 millilitres d’eau déionisée, puis transfère environ 50 nymphes de couleur pâle dans la boîte à l’aide d’une pipette plastique de transfert. N’utilise que les nymphes faiblement pigmentées, car celles qui ont déjà atteint un niveau de brunissement moyen à foncé subiraient des dommages au niveau du cuticule et présenteraient de faibles taux de survie.

La première étape de la microinjection consiste à ouvrir l'aiguille. Sous le microscope, rompre l'extrémité la plus distale de l'aiguille à l'aide de fines pinces. Ensuite, remplir l'aiguille avec de l'huile minérale à l'aide d'une aiguille de calibre 30 et d'une seringue.

Une fois remplie, expulsez l'excès d'huile à l'aide du microinjecteur. Réglez le microinjecteur pour aspirer des volumes de 69 nanolitres. Ensuite, remplissez l'aiguille par l'avant avec l'ARN d'injection préparé.

Tester la distribution d'ARN double brin pour détecter d'éventuels problèmes. L'obstruction de l'embout et les aiguilles mal fixées sont les principales sources de problèmes. Une fois l'injecteur préparé, sélectionner un à trois pupes et les transférer sur la feuille de papier filtre.

À l’aide d’un pinceau, positionner la nymphe de manière à ce que sa cuticule dorsale soit accessible. En appuyant sur le papier, l’eau excédentaire sur les nymphes sera absorbée. Tout en maintenant la nymphe immobile avec un pinceau humide, insérer l’aiguille dans sa cuticule dorsale entre l’abdomen et le thorax selon un mouvement allant de l’avant vers l’arrière, à un angle d’environ 30 degrés.

Ensuite, injectez une à deux impulsions d'ARN double brin dans l'hémolymphe. La dispersion du colorant dans tout le corps doit être visible si l'injection a réussi. Lors de l'injection dans la nymphe, il est essentiel que l'aiguille perce uniquement la cuticule dorsale.

Si la perforation par l'aiguille traverse la cuticule ventrale, une accumulation de liquide marqué par le colorant sera visible à l'extérieur de la nymphe, ou bien le colorant se transférera sur le papier filtre. Dans de tels cas, la nymphe doit être jetée. Si le colorant ne se répartit pas dans tout l'hémolymphe, l'extrémité de l'aiguille est très probablement obstruée.

Déplacez légèrement la pointe et déterminez si une libération d'ARN et de colorant a eu lieu. S'il n'y a aucune indication de libération du colorant, jetez la nymphe. Ensuite, examinez la pointe de l'aiguille et effectuez une autre injection sur une nouvelle nymphe.

Après avoir injecté avec succès une nymphe, utilisez un pinceau humide pour la détacher délicatement de l'aiguille, puis déplacez-la dans la boîte contenant de l'eau où elle achevera son développement. Placez la boîte contenant les nymphes injectées dans une cage à moustiques ou un récipient, dans des conditions d'élevage normales. En guise de source alimentaire pour les adultes, fournissez une solution de glucose à 10 % poids par volume absorbée par une boule de coton.

Une fois les adultes émergés, les comparer aux témoins. Par exemple, les insectes SRPN2 à ARN double brin doivent être évalués quotidiennement pour la formation de pseudotumeurs. Pour ce faire, refroidir les adultes pendant deux à trois minutes à moins 20 degrés Celsius, puis les transférer sur une plaque froide à deux degrés Celsius pour l'observation.

Après avoir observé les adultes, les remettre dans la zone d'élevage des insectes. Une fois la technique maîtrisée, les pupes injectées sont écloses avec une fréquence d'environ 70 %. Dans un sous-ensemble des pupes injectées, une émergence partielle hors de l'exuvie a eu lieu, conduisant à des moustiques non viables. Aucun retard n'a été observé dans les taux d'émergence entre les moustiques injectés et non injectés, et les effets de l'injection ne variaient pas selon le sexe.

Dix jours après l'émergence, aucune modification notable de la survie des moustiques injectés n'a été observée par rapport aux témoins non injectés. L'inhibiteur de sérine protéase, SRPN2, a été utilisé comme témoin positif, et le LacZ double brin comme témoin négatif pour les injections d'ARN double brin. Trois jours après l'émergence, des pseudotumeurs chez les adultes injectés avec le SRPN2 double brin étaient visibles par microscopie optique.

Après huit jours, les pseudotumeurs étaient très prononcées. Chez les moustiques adultes, des pseudotumeurs mélaniques étaient observables à travers la cuticule de la plupart des animaux injectés avec l'ARN double brin ciblant SRPN2, tandis qu'aucune pseudotumeur n'était observable chez les témoins. Cinq jours après l'injection, les niveaux de la protéine SRPN2 étaient significativement plus faibles chez les moustiques injectés avec l'ARN double brin ciblant SRPN2, par rapport aux témoins injectés avec l'ARN double brin ciblant LacZ et aux témoins non injectés.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'administration d'un agent déclencheur d'interférence ARN chez les nymphes d’*Anopheles gambiae*, en utilisant ce nouveau protocole d'injection. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison des mouvements imprévisibles de la nymphe. Toutefois, la pratique d'un positionnement et d'une stabilisation adéquats de la nymphe améliore grandement le taux de réussite des injections, ainsi que la qualité de celles-ci.

Une fois la technique maîtrisée, ces injections prennent environ 30 secondes par nymphe. Grâce au développement de cette méthode, nous avons ouvert la voie aux chercheurs en biologie des vecteurs pour explorer et évaluer la fonction des gènes durant les stades développementaux pré-adultes et début de l’âge adulte chez le vecteur du paludisme Anopheles gambiae. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'analyse par immunotransfert (Western blot) ou la PCR quantitative peuvent être réalisées afin de déterminer l'ampleur de la diminution de l'expression du gène ciblé au niveau protéique ou de l'expression des transcrits, respectivement.

En fin de compte, cette technique peut aider à identifier les gènes essentiels à la transmission du parasite par les moustiques, et cette approche nous aidera à repérer de nouvelles cibles et à fournir de nouvelles perspectives sur la manière de concevoir des stratégies de lutte antivectorielle plus efficaces.