Ex vivo l'imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

Nous décrivons une méthode relativement simple pour ex vivo l'imagerie en direct de la tumeur interactions cellule-stroma dans les métastases du poumon, en utilisant journalistes fluorescentes chez la souris. Utilisation à disque rotatif microscopie confocale, cette technique permet de visualiser les cellules vivantes pendant au moins 4 heures et peut être adapté à l'étude d'autres maladies pulmonaires inflammatoires.

L’objectif global de cette procédure est de visualiser les interactions dynamiques entre les cellules tumorales et le stroma au sein des métastases pulmonaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des métastases cancéreuses, telles que comment les métastases s’établissent.et quels types de cellules dans le micro-environnement sont impliqués dans ce processus ? Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode rapide et facile d’imagerie pulmonaire ex vivo qui permet de visualiser des cellules vivantes pendant au moins quatre heures. Cette technique a peut-être permis de mieux comprendre les mécanismes d’action de diverses thérapies ciblées pour le traitement des métastases pulmonaires. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous examinions les métastases par imagerie en coupe pulmonaire et que nous étions aux prises avec une mort cellulaire étendue à la suite de cette procédure. Pour préparer les poumons à l’imagerie en direct ex vivo, commencez par immobiliser la souris sur un couvercle en mousse de polystyrène recouvert d’un morceau de trempage et stérilisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision épigastrique transversale à travers la peau, suivie d’une incision similaire à travers le péritoine. Ensuite, en déplaçant la planche de dissection en position verticale, coupez l’aorte descendante, de sorte que le sang s’accumule dans l’abdomen et non dans la cavité thoracique. Coupez la petite ouverture du diaphragme pour libérer le vide. Ensuite, coupez le long de la cage thoracique pour exciser le diaphragme et visualiser les poumons. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez la peau jusqu’à la trachée sur la cage thoracique en laissant les côtes intactes. Ensuite, séparez la peau de la cage thoracique et retirez le tissu conjonctif environnant pour exposer la trachée, en prenant soin de ne pas endommager la trachée elle-même. Coupez une petite ouverture d’environ un millimètre de diamètre dans la trachée exposée, parallèlement aux anneaux cartilagineux aussi près que possible du larynx sans couper complètement la trachée. Ensuite, insérez doucement une aiguille de calibre 20 de quatre à cinq millimètres dans la trachée sans aucune contre-force. L’extrémité de l’aiguille doit être visible à travers la trachée. Remplissez une seringue de 400 microlitres d’agarose à 37 degrés Celsius 2 % à basse température de fusion, puis stabilisez l’aiguille avec une pince. En gardant la planche de dissection verticale, instillez lentement toute la quantité d’agarose chaude à travers l’aiguille dans les poumons. Une fois les poumons gonflés, détachez la seringue tout en gardant l’aiguille à l’intérieur de la trachée et versez environ 50 millilitres de PBS à 20 degrés Celsius sur les poumons pour aider à fixer l’agarose. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, retirez l’aiguille et utilisez une pince pour fermer la trachée afin d’éviter la fuite de toute agarose non solidifiée. Maintenant, ouvrez davantage la poitrine par sternotomie et saisissez la trachée avec des pinces. Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux, coupez complètement la trachée. Pour retirer les poumons, tirez doucement la trachée vers le haut, coupez le tissu conjonctif et l’œsophage, et retirez complètement les poumons de la cavité thoracique. Immergez le tissu dans 37 degrés Celsius RPMI 1640 pour éliminer l’excès de sang. À l’aide de ciseaux et de pinces, coupez les lobes