Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer des observations quantifiables de la survenue temporelle et spatiale de la fusion des vésicules exocytotiques neuronales et du bourgeonnement axonal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que le moment et l'endroit où la fusion des vésicules insère du matériel membranaire dans la membrane plasmique en expansion au cours du développement neuronal. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle combine l'imagerie de cellules vivantes pour obtenir une résolution spatiale et temporelle élevée au niveau de cellules individuelles, et des approches biochimiques pour obtenir des informations basées sur des populations cellulaires.

Après la culture et la simulation de neurones corticaux avec la Netrine-1 ou un contrôle selon le texte du protocole. Aspirez le PBS à partir du premier puits d'une condition et remplacez-le par 250 microlitres de tampon d'homogénéisation. Incubez sur de la glace pendant cinq minutes, puis, à l’aide d’un grattoir à cellules, homogénéisez les cellules sur de la glace.

Aspirez le PBS du puits suivant de la même condition et ajoutez-y une partie du mélange récemment homogénéisé afin d'augmenter les concentrations en protéines. Ensuite, transférez la solution homogénéisée dans un tube microcentrifuge de 1,6 millilitre prérefroidi, placé sur de la glace, puis ajoutez du Triton X-100 à 20 % pour obtenir une concentration finale de 1 %. À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, effectuez dix aspirations et dispensations du mélange en minimisant la formation de bulles. Incubez les tubes sur de la glace pendant deux minutes afin de solubiliser les protéines.

Ensuite, centrifuger à 6 010 RCF à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes pour former un culot avec le matériau non solubilisé. Transférer le surnageant liquide dans un nouveau tube de 1,6 millilitre refroidi, placé sur de la glace. Ensuite, utiliser le dosage de Bradford pour déterminer la concentration en protéines.

Ensuite, utilisez un tampon d'homogénéisation contenant 1 % de Triton X-100 et un tampon d'échantillonnage 5X supplémenté en BME pour diluer les échantillons à une concentration finale de 3 à 5 milligrammes par millilitre. Répartissez chaque échantillon expérimental de manière égale dans deux tubes. Incubez ensuite un échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, et l'autre à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Inverser les tubes de manière intermittente pour maintenir les échantillons en solution. Ensuite, réaliser l'électrophorèse SDS-PAGE et le transfert Western selon le protocole décrit dans le texte. Après avoir configuré le microscope TIRF et l'échantillon, et trouvé un plan focal neuronal selon le protocole décrit dans le texte.

Démarrez le logiciel du laser et connectez-vous au logiciel de contrôle du laser. Réglez l'illumination en champ large et sélectionnez l'objectif. Ensuite, définissez l'indice de réfraction de l'échantillon et ajustez l'intensité du laser en désactivant le TTL pour le laser 491.

L'optimisation des paramètres d'imagerie est importante lors de l'acquisition d'images de vésicules exocytaires intactes au niveau du plancher afin d'éviter la dérive de mise au point et la phototoxicité, tout en produisant des images présentant un rapport signal sur bruit suffisamment élevé pour l'analyse. Réglez le curseur sur 100, puis ramenez-le à une valeur comprise entre 20 et 40. Vérifiez ensuite à nouveau le TTL.

Ensuite, recentrez l'échantillon en utilisant l'éclairage en lumière transmise. Puis, dans le logiciel d'imagerie, sélectionnez l'éclairage au laser 491 et ouvrez l'obturateur. Placez le condenseur à l'envers sur la platine optique afin de ne pas rayer l'objectif.

Réglez finement le point focal du laser sur le plafond et, avec le condenseur retiré, centrez le point au milieu du diaphragme de champ fermé. Remettez ensuite le condenseur en place et, dans le logiciel TIRF, réglez la profondeur de pénétration à 110 nanomètres. Puis passez du mode d'illumination en champ large au mode d'illumination TIRF pour l'acquisition d'images.

Maintenant, utilisez la microscopie à fluorescence en champ large pour repérer les cellules exprimant VAMP2 fluorescent à l’aide des oculaires. Ensuite, afin de réduire la photodégradation et la phototoxicité, ajustez les paramètres d’imagerie pour maximiser le rapport signal sur bruit et la plage dynamique en utilisant un temps d’exposition et une intensité laser minimaux. Activez la mise au point automatique continue par cellule.

Ensuite, acquérez un ensemble d'images en laps de temps avec une acquisition toutes les 0,5 seconde pendant cinq minutes. Pour la condition stimulée par la nétrine-1 dans une hotte à flux laminaire, ajoutez de la nétrine-1 à une concentration finale de 500 nanogrammes par millilitre dans une boîte de culture contenant les cellules, puis replacez la boîte dans l'incubateur pendant une heure avant l'acquisition d'images. Pour quantifier la fréquence des événements exocytaires normalisés par surface cellulaire et par temps.

Dans ImageJ, ouvrez les piles d'images en faisant glisser le fichier dans la fenêtre ou en choisissant Fichier, Ouvrir, nom du fichier. Pour supprimer les signaux fluorescents stables qui ne représentent pas des événements de fusion vésiculaire, utilisez Image, Pile, Projection Z, type de projection Intensité moyenne. Pour créer une projection Z moyenne de toute la pile.

Soustrayez l'image moyenne résultante de chaque image de l'acquisition temporelle à l'aide de Traitement, Calculatrice d'image, Image 1 : votre pile, Opération : soustraire l'image 2. Cela donne une nouvelle projection Z. Cette manipulation mettra en évidence les événements d'exocytose.

À présent, comptez visuellement les événements de fusion exocytique, que l'on peut identifier comme des taches de signaux fluorescents limités par la diffraction et qui diffusent rapidement lorsque la fluoren de VAMP2 se diffuse dans la membrane plasmique. Mettez en évidence la première image avec Image, Réglage, Seuil, puis ajustez le curseur jusqu'à ce que toute la cellule soit mise en surbrillance par le seuil. Ensuite, dans Analyser, choisissez Définir les mesures et cochez la case surface et affichage du libellé.

Avec l'outil de suivi manuel, définissez la surface cellulaire seuillée et appuyez sur M pour mesurer. Transférez les données recueillies dans un tableur conformément au protocole écrit. Après deux jours in vitro, placez la boîte d'imagerie à fond de verre contenant les neurones non transfectés dans une chambre environnementale humide préalablement réchauffée.

Utilisez un microscope équipé d'un objectif à immersion apochromatique Plan 6 DX avec une ouverture numérique (NA) de 1,4 et d'un condenseur à haute ouverture numérique pour obtenir la meilleure qualité d'image et la meilleure résolution. Ensuite, à l'aide d'un éclairage en lumière transmise, ajustez le plan focal pour repérer les neurones à travers les oculaires. Pour l'imagerie en contraste interférentiel différentiel (DIC) des ramifications axonales, un réglage adéquat de l'éclairage du réfrigérateur sera essentiel à l'optimisation des images et est crucial pour produire des résultats analysables.

Ensuite, avec les neurones d'intérêt situés dans le champ de vision, utilisez la fonction d'acquisition multipoints du logiciel d'imagerie pour détecter et enregistrer les positions XYZ d'au moins six cellules. Ajoutez maintenant du Netrin-1 ou tout autre facteur d'intérêt à une concentration finale de 250 nanogrammes par millilitre afin de stimuler les cellules, puis démarrez l'acquisition multipoints. Acquérez successivement des images à chaque position toutes les 20 secondes pendant 24 heures.

Interrompre l'acquisition et effectuer une nouvelle mise au point si nécessaire. Dans le logiciel d'imagerie, examiner les images en choisissant Applications, Examiner les données multidimensionnelles, puis ouvrir le fichier souhaité. Identifier les branches d'axones stables qui se sont formées pendant la session d'imagerie.

Utilisez l'outil de région de trace pour mesurer une branche d'axone stable, de la base de l'axone jusqu'à son extrémité. Après avoir traité les neurones avec la netrine et la toxine botulique, puis fixé et immunomarqué selon le protocole décrit, effectuez un immunomarquage pour la bêta-3 tubuline et l'actine. Utilisez un microscope inversé pour acquérir des images en épifluorescence en champ large.

Ouvrez une pile d'images dans ImageJ et, pour analyser manuellement les ramifications, utilisez l'outil ligne ou ligne segmentée afin de suivre l'axone, défini comme la neurite la plus longue s'étendant à partir du soma. À l'aide de l'outil Analyser, puis Outils, Gestionnaire de zones d'intérêt (ROI Manager), enregistrez le tracé de l'axone comme une région d'intérêt. Ensuite, suivez et enregistrez chaque ramification de l'axone, définie comme une neurite dont la longueur est supérieure ou égale à 20 micromètres.

N'inclure que les branches primaires dans l'analyse. On observe ici un immunoblot après la réalisation du test des complexes SNARE résistants au SDS. Détection de SNAP25, de Syntaxine 1A et de VAMP2.

Des protéines SNARE en complexe, ainsi que des monomères identifiables, sont représentées ici. Un exemple d'événement exocytique médié par VAMP2-fluoroen se produisant au fil du temps dans un neurone cortical est montré ici. Les agrandissements montrent le soma, une branche axonale et un cône de croissance axonal, illustrant l'utilité spatiale de ce test.

Les cercles indiquent des événements de fusion exocytaires uniques, visibles par microscopie TIRF. Cette imagerie temporelle en contraste interférentiel différentiel montre en temps réel la formation d'une branche axonale stimulée par la netrine. Ces emplacements indiquent la protrusion initiale à partir d'un site de branchement.

Ces structures représentent des branches stables complètement formées d'au moins 20 micromètres, mesurées depuis l'axone principal jusqu'à l'extrémité de la branche. Dans cette expérience, des neurones corticaux à 3 DIV ont été traités soit avec la nétrine-1, qui stimule la ramification, soit avec la toxine botulique de type A, qui clive SNAP25, un composant du complexe SNARE et bloque l'exocytose. Les résultats démontrent que l'exocytose médiée par le complexe SNARE est nécessaire à la ramification dépendante de la nétrine.

Une fois maîtrisée, l'imagerie DIC peut être réalisée en une seule séance d'imagerie nocturne. L'imagerie TIRF des événements exocytaires individuels peut être effectuée en 4 à 5 heures. Le protocole biochimique d'formation du complexe SNARE peut être réalisé en deux heures.

Lors de la réalisation de ces procédures, il est important de garder un rythme mesuré et de ne pas précipiter une étape quelconque. Chaque procédure exige de l'attention et de la patience pour obtenir les meilleurs résultats. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme la cotransfection de composants vésiculaires marqués avec des cargaisons candidates marquées, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires.

Quel est, par exemple, le contenu des vésicules exocytaires ? Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs du domaine des neurosciences d'explorer la néuritogenèse, le bourgeonnement de l'axone et d'autres étapes de la morphogenèse dans n'importe quelle culture neuronale dissociée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'observer et de quantifier la nature spatiale et temporelle des événements de fusion des vésicules exocytaires neuronaux, en lien avec les changements de la morphogenèse neuronale.

N'oubliez pas que le travail avec la toxine botulique ou des lasers de haute puissance peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de vêtements de sécurité appropriés et l'utilisation du mécanisme de verrouillage de sécurité du microscope doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.