Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

L’objectif global de cette procédure est de faire des observations quantifiables de l’occurrence temporelle et spatiale de la vésicule exocytaire neuronale, du fushion et de la ramification axonale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que quand et où la fusion des vésicules insère un matériau membranaire dans la membrane plasmique en expansion pendant le développement neuronal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine l’imagerie de cellules vivantes pour acquérir à la fois une résolution spatiale et temporelle élevée dans des cellules uniques et des approches biochimiques pour acquérir des informations basées sur la population.

Après avoir cultivé et simulé des neurones corticaux avec Netrin-1 ou un contrôle selon le texte du protocole. Aspirer le PBS du premier puits d’une condition et le remplacer par 250 microlitres de tampon d’homogénéisation. Incuber sur glace pendant cinq minutes, puis à l’aide d’un élévateur de cellules, homogénéiser les cellules sur la glace.

Aspirez le PBS du puits suivant de la même condition et ajoutez le mélange récemment homogénéisé dans le puits, ce qui augmentera les concentrations de protéines. Ensuite, transférez la solution homogénéisée dans un tube microfuge pré-refroidi de 1,6 millilitre sur de la glace, et ajoutez 20 % de Triton X-100 pour atteindre une concentration finale de 1 % Puis, avec une pipette de 1 000 microlitres, triturez le mélange dix fois tout en minimisant les bulles. Incuber les tubes sur de la glace pendant deux minutes pour solubiliser les protéines.

Ensuite, centrifuger à 6, 010 RCF à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler le matériau non solubilisé. Transférez le surnageant d’état de lie dans un nouveau tube réfrigéré de 1,6 millilitre sur de la glace. Ensuite, utilisez le test de Bradford pour déterminer la concentration en protéines.

Ensuite, utilisez un tampon d’homogénéisation avec 1 % de Triton X-100 et un tampon d’échantillon 5X complété par du BME pour diluer les échantillons à une concentration finale de 3 à 5 milligrammes par millilitre. Divisez chaque échantillon expérimental uniformément dans deux tubes. Ensuite, incubez un échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et l’autre à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Retournez les tubes par intermittence pour garder les échantillons en solution. Effectuez ensuite la page SDS et le western blot selon le protocole texte. Après avoir configuré le microscope TIRF et l’échantillon et trouvé un plan focal neuronal selon le protocole de texte.

Démarrez le logiciel laser et connectez-vous au logiciel de contrôle laser. Réglez l’éclairage sur champ large et sélectionnez l’objectif. Réglez ensuite l’indice de réfraction de l’échantillon et ajustez l’intensité du laser en décochant TTL pour le laser 491.

L’optimisation des paramètres d’imagerie est importante lors de l’imagerie des vésicules exocytaires intactes du sol afin d’éviter la dérive de la mise au point et la phototoxicité tout en produisant des images dont le rapport signal/bruit est élevé et qui est suffisant pour l’analyse. Ajustez le curseur sur 100, puis rabaissez-le à une valeur comprise entre 20 et 40. Vérifiez ensuite à nouveau la durée de vie.

Ensuite, concentrez-vous à nouveau sur l’échantillon en éclairage en lumière transmise. Ensuite, dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez l’éclairage laser 491 et ouvrez l’obturateur. Placez le condenseur à l’envers sur le banc optique afin de ne pas rayer l’objectif.

Ajustez avec précision le point focal du laser au plafond et, avec le condenseur retiré, centrez le point au centre du diaphragme à champ fermé. Ensuite, remplacez le condenseur et dans le logiciel TIRF, envoyez la profondeur de pénétration à 110 nanomètres. Passez ensuite de l’éclairage grand champ au mode d’éclairage TIRF pour l’imagerie.

Maintenant, en utilisant l’épifluorescence à champ large, trouvez les cellules exprimant le fluorent VAMP2 à travers les oculaires. Ensuite, pour réduire le photoblanchiment et la phototoxicité, ajustez les paramètres d’imagerie pour maximiser le rapport signal/bruit et la plage dynamique en utilisant un temps d’exposition minimal et une intensité laser. Réglez la mise au point automatique continue par cellule.

Ensuite, acquérez un ensemble d’images en accéléré avec une acquisition toutes les 0,5 seconde pendant cinq minutes. Pour l’état stimulé par la nétrine-1 dans une hotte à flux laminaire, ajoutez à une concentration finale de 500 nanogrammes par millilitre de nétrine-1 dans une boîte de cellules et remettez la boîte dans l’incubateur pendant une heure avant l’imagerie. Quantifier la fréquence des événements exocytaires normalisée par surface cellulaire et par temps.

Dans ImageJ, ouvrez les piles d’images en faisant glisser le fichier dans la fenêtre ou en choisissant Fichier, Ouvrir, nom du fichier. Pour supprimer les signaux fluorescents stables qui ne représentent pas des événements de fusion de vésicules, utilisez Image, Empile, Projet Z, Type de projection Intensité moyenne. Pour créer une projection Z moyenne de l’ensemble de la pile.

Soustrayez l’image moyenne résultante de chaque image dans le timelapse à l’aide de Processus, Calculatrice d’image, Image 1 votre pile, Opération Soustraire l’image deux. Il en résulte une projection Z nouvellement créée. Cela mettra l’accent sur les événements exocytaires.

Maintenant, à l’œil nu, comptez les événements de fushion exocytaire, qui peuvent être identifiés comme des taches de signaux fluorescents limités en diffraction qui se diffusent rapidement lorsque le fluoren VAMP2 diffuse dans la membrane plasmique. Mettez en surbrillance la première image à l’aide des options Image, Ajuster, Seuil, puis ajustez le curseur jusqu’à ce que la cellule entière soit mise en surbrillance. Ensuite, sous Analyser, choisissez Définir les mesures et vérifiez la zone et l’étiquette d’affichage.

À l’aide de l’outil de traçage de baguette, définissez la zone cellulaire seuillée et appuyez sur M pour mesurer. Transférez les données collectées dans une feuille de calcul selon le protocole texte. Au bout de deux jours, in vitro, placez la parabole d’imagerie à fond de verre contenant les neurones non transfectés dans une chambre environnementale humide préchauffée.

Utilisez un microscope équipé d’un objectif DIC apochromatique 1.4 NA à six plans DX et d’un condenseur à grande ouverture numérique pour une qualité d’image et une résolution optimales. Ensuite, avec l’éclairage en lumière transmise, ajustez le plan focal pour trouver les neurones à travers les oculaires. Pour l’imagerie DIC de la ramification axonale, la configuration appropriée d’un éclairage plus froid fera partie intégrante de l’optimisation de l’image et est essentielle pour produire des résultats analysables.

Ensuite, avec les neurones d’intérêt dans le champ de vision, utilisez la fonction d’acquisition multizone dans le logiciel d’imagerie pour trouver et enregistrer les emplacements XYZ d’au moins six cellules. Maintenant, ajoutez à une concentration finale de 250 nanogrammes par millilitre de Netrin-1 ou d’un autre facteur d’intérêt pour simuler les cellules et appuyez sur le bouton de démarrage de l’acquisition multi-zones. Acquérez séquentiellement des images à chaque position toutes les 20 secondes pendant 24 heures.

Mettre l’acquisition en pause et se recentrer si nécessaire. Dans le logiciel d’imagerie, examinez les images en sélectionnant Applications, Examiner les données multidimensionnelles et ouvrez le fichier souhaité. Identifiez les branches axonales stables qui se sont formées pendant la séance d’imagerie.

Utilisez l’outil de région de trace pour mesurer une branche axonale stable de la base de l’axone à la pointe. Après avoir traité les neurones avec de la nétrine et de la toxine botulique et la fixation et l’immunomarquage, et l’immunocoloration pour la bêta-3 tuboline et l’actine selon le protocole de texte. Utilisez un microscope inversé pour recueillir des images d’épifluorescence à grand champ.

Ouvrez une pile d’images dans ImageJ et pour analyser manuellement la branche, utilisez la ligne, la ligne segmentée et tracez l’axone qui est défini comme le neurite le plus long s’étendant du soma. Avec Analyser, Outils, Gestionnaire de ROI, enregistrez le tracé axonal en tant que région d’intérêt. Ensuite, tracez et enregistrez chaque branche axonale, qui est définie comme un neurite de longueur supérieure ou égale à 20 micromètres.

N’incluez que les branches principales dans l’analyse. On voit ici un transfert de Western après l’achèvement du test du complexe SNARE résistant au SDS. Sonde pour SNAP25, Syntaxin 1A et VAMP2.

Des protéines SNARE en complexes, des monomères identifiables sont représentés ici. Un exemple d’événement exocytaire médié par VAMP2 fluroen se produisant au fil du temps dans un neurone cortical est présenté ici. Les encarts zoomés désignent le soma, une branche axonale et un cône de croissance axonale, ce qui montre l’utilité spatiale de ce test.

Les cercles déclenchent des événements de fusion exocytaire uniques, qui peuvent être observés par microscopie TIRF. Cette imagerie DIC en accéléré montre la formation stimulée par la nétrine d’une branche axonale en temps réel. Ces emplacements dénotent la saillie initiale d’un site de branchement.

Il s’agit de branches stables entièrement formées d’au moins 20 micromètres, mesurées de l’axone principal à l’extrémité de la branche. Dans cette expérience, les neurones corticaux à 3 DIV ont été traités soit avec de la nétrine-1, qui stimule la ramification, soit avec de la toxine botulique A, qui clive SNAP25, un composant du complexe SNARE et bloque l’exocytose. Les résultats démontrent que l’exocytose médiée par SNARE est nécessaire à la ramification dépendante de la nétrine.

Une fois maîtrisée, l’imagerie DIC peut être réalisée en une seule séance d’imagerie de nuit. L’imagerie TIRF d’événements exocytaires individuels peut être prise en charge en 4 à 5 heures. Le protocole de biochimie de la formation complexe SNARE peut être réalisé en deux heures.

Lorsque vous tentez ces procédures, il est important de ne pas oublier de vous calmer et de ne pas précipiter une seule étape. Chaque procédure nécessite de l’attention et de la patience pour obtenir les meilleurs résultats. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la cotransfection de composants de vésicules marqués avec des cargaisons candidates étiquetées peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires.

Comme quelle est la cargaison des vésicules exocytaires ? Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer la neuritogenèse, la ramification des axones et d’autres étapes de la morphogenèse dans toute culture neuronale dissociée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’observer et de quantifier la nature spatiale et temporelle des événements de fusion des vésicules exocytaires neuronales correspondant à des changements dans la morphogenèse neuronale.

N’oubliez pas que travailler avec de la toxine botulique ou des lasers de haute puissance peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de vêtements de sécurité appropriés et l’utilisation du mécanisme de verrouillage de sécurité du microscope doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.