Name: Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Découvrez l'exocytose médiée par les protéines SNARE dans le branchement axonal dépendant de la netrine en combinant imagerie en cellules vivantes et analyses biochimiques sur neurones corticaux.

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<ol><li>Drachman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+we+have+brain+to+spare%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Do we have brain to spare?</a> Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+Is+Required+for+Commissural+Axon+Guidance+in+the+Developing+Vertebrate+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System.</a> Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).</li>
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<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
<li>Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins%3A+versatile+extracellular+cues+with+diverse+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions.</a> Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).</li>
<li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+expansion%3A+a+neuron%27s+Herculean+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).</li>
<li>Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Netrin-1-sensitive+mechanism+promotes+local+SNARE-mediated+exocytosis+during+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+membrane+fusion+complex%3A+action+of+clostridial+neurotoxins+on+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly.</a> The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Centonze Frohlich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Contrast+and+Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Blasi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+A+selectively+cleaves+the+synaptic+protein+SNAP-25%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25.</a> Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La ramification axonale est un processus neurodéveloppemental fondamental et sous-tend la vaste neuroconnectivité du système nerveux des mammifères. La compréhension des mécanismes impliqués dans l’expansion localisée de la membrane plasmique fait partie intégrante de notre compréhension du neurodéveloppement normal et pathologique. L’utilisation d’une approche à plusieurs volets intégrant à la fois des méthodologies au niveau de la population et au niveau de la cellule unique améliore la reproductibilité et augmente la ...

Des estimations récentes suggèrent que le cerveau humain contient 1011 neurones avec 1014 connexions synaptiques1, soulignant l’importance de la ramification axonale in vivo. Les signaux de guidage axonal extracellulaires tels que la nétrine-1 guident les axones vers les partenaires synaptiques appropriés et stimulent la ramification axonale, augmentant ainsi la capacité synaptique2-5. L’arborisation axonale dépendante de la nétrine 1 implique une expansion substantielle de la membrane plasmique6, ce qui, selon nous, nécessite la livraison de composants membranaires supplémentaires via la fusion des vésicules exocytaires dépendante du complexe SNARE7. 
L’étude du rôle de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine-1 est compliquée par plusieurs facteurs. Tout d’abord, l’hétérogénéité des neurones corticaux augmente la taille de l’échantillon nécessaire pour identifier les effets significatifs, ce qui complique les techniques unicellulaires comme l’imagerie. Deuxièmement, bien que les techniques biochimiques permettent d’observer les changements qui se produisent au niveau de la population, elles n’ont pas la résolution temporelle et spatiale nécessaire pour localiser l’expansion de la membrane plasmique vers l’axone dans le cadre temporel de la ramification de l’axone. Enfin, bien que les branches axonales se forment au fil des heures, les changements cellulaires qui contribuent à l’extension axonale peuvent commencer en quelques minutes et se produire à l’ordre de quelques secondes, élargissant ainsi le champ temporel de l’examen expérimental. 
Nous esquissons une approche multitechnique qui aborde ces diverses échelles temporelles et spatiales de l’exocytose et de la ramification axonale, et améliore ainsi notre compréhension des mécanismes cellulaires fondamentaux. L’utilisation de ces approches fournit des preuves qui soutiennent un rôle essentiel de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification des axones.

<table><tbody><tr><td>Plaques traitées pour la culture tissulaire à 6 puits</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>lamelles en verre</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5 ; doivent être traitées à l’acide nitrique pendant 24 heures, rincées à l’eau DI 2x et séchées avant utilisation. Doit être enrobé de 1 mg/ml de poly-d-lysine et rincé avant le placage des cellules.</td></tr><tr><td>Solution de nucléofection Amaxa</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td>100 ml/transfection</td></tr><tr><td>Amaxa Nucléofecteur/électroporateur</td><td>Lonza</td><td></td><td>program O-005</td></tr><tr><td>35 mm Boîtes d’imagerie à cellules vivantes à fond de verre</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>doivent être enduites de 1 mg/ml de poly-d-lysine et rincées avant le placage des cellules</td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC2 microscope inversé</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampe au xénon Lambda LS</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr> Environmental <tr><td>Stage top incubateur</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA TIRF</td><td>objectif Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor Infrared Imaging System</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>Utilisé pour le balayage des taches</td></tr><tr><td>Studio d’images suite logicielle</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Utilisé pour la numérisation sur le système Odyssey Infrarouge ; Image studio lite utilisé pour l’analyse hors ligne des blots</td></tr><tr><td>Metamorph pour Olympus</td><td>Molecular devices, LLC</td><td>version 7.7.6.0</td><td>Logiciel utilisé pour toutes les images et l’analyse de timelapse DIC</td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle CELL TIRF Logiciel</td><td>Olympus</td><td></td><td>utilisé pour contrôler les lasers pour l’imagerie TIRF</td></tr><tr><td>Fidji (Image J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Version 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 Objectif</td> <td>NAOlympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Objectif apochromatique</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieux neurobasaux</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>Solution de base pour milieux sans sérum et sans trypsine</td></tr><tr><td>Supplément B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml Milieux sans sérum et milieux de trempe à la trypsine</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml Milieux sans sérum</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>solution à 10 % dans 1x PBS pour bloquer les lamelles ; solution à 5 % dans TBS-T pour bloquer les membranes de nitrocellulose.</td></tr><tr><td>10x&nbsp ; trypsine</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr> Solution <tr><td>saline tamponnée au phosphate de Dulbecco’s (DPBS)+ Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fisher scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-Propyl Gallate</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol Qualité photométrique</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol (qualité non optique)</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoethonal</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée&nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>Dissous dans de l’eau stérile à 1 mg/ml</td></tr><tr><td>toxine botulique A Liste BoNTA</td><td>Laboratoires biologiques</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Lapin polyclonal anti humain VAMP2</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti rat Syntaxine1A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre polyclonale anti humain SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti humain &beta ; III-tubuline&nbsp ;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 et Alexa Fluor 488 phalloïdine, ou Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-dye anticorps secondaires</td><td>LI-COR</td><td>P/N 925-32212, P/N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800 âne anti-souris, 680 âne anti lapin, 680 âne anti chèvre</td></tr><tr><td>0.2 &#956 ; m membrane nitrocellulosique taille des pores</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromphénol</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher scientific</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40 % bis-acrylimide</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>Anticorps >Alternative Validated Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Synaptobrevin monoclonal de souris 2 (VAMP2)</td><td>Synaptic Systems</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal de souris SNAP25</td><td>Synaptic Systems</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisant méthodologies combinés pour définir le rôle du plasma membrane livraison pendant axon branching et neuronal morphogénèse

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Au cours du développement neuronal, les axones en croissance s’étendent à plusieurs partenaires synaptiques en élaborant des branches axonales. La ramification axonale est favorisée par des signaux de guidage extracellulaires comme la nétrine-1 et entraîne une augmentation spectaculaire de la surface de la membrane plasmique axonale. La ramification axonale dépendante de la nétrine 1 implique probablement un contrôle temporel et spatial de l’expansion de la membrane plasmique, dont les composants sont fournis par la fusion des vésicules exocytaires. Ces événements de fusion sont précédés par la formation de complexes SNARE, comprenant un v-SNARE, tel que VAMP2 (vésicule associée à la protéine membranaire 2), et les t-SNARE de membrane plasmique, la syntaxine-1 et SNAP25 (protéine associée au synaptosomal 25). Vous trouverez ci-dessous une approche à plusieurs volets utilisée pour examiner le rôle de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification des axones. La force de l’approche combinée réside dans l’acquisition de données à une gamme de résolutions spatiales et temporelles, allant de la dynamique des événements de fusion de vésicules uniques dans des neurones individuels à la formation de complexes SNARE et à la ramification axonale dans des populations de neurones en culture. Ce protocole tire parti des approches biochimiques établies pour doser les niveaux de complexes SNARE endogènes et de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) des neurones corticaux exprimant VAMP2 marqués avec une GFP sensible au pH (VAMP2-pHlourin) afin d’identifier les changements dépendants de la nétrine-1 dans l’activité exocytaire dans les neurones individuels. Pour élucider le moment de la ramification dépendante de la nétrine-1, la microscopie à contraste interférentiel différentiel (CID) time-lapse de neurones uniques sur un ordre d’heures est utilisée. L’immunofluorescence à cellules fixes associée à des neurotoxines botuliques qui clivent la machinerie SNARE et bloquent l’exocytose démontre que la ramification axonale dépendante de la nétrine-1 nécessite une activité exocytaire médiée par SNARE.

Utilisant des techniques biochimiques in vitro de doser la quantité de complexes SNARE SDS-résistants dans une population de neurones. La figure 1 montre le western blot après l&#39; achèvement résultant du SNARE dosage complexe SDS résistant sondé pour SNAP-25, syntaxin1A et VAMP2. Microscopie TIRF à la membrane des cellules basales fournit des images haute résolution des différents événements de fus...

Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer des observations quantifiables de la survenue temporelle et spatiale de la fusion des vésicules exocytotiques neuronales et du bourgeonnement axonal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que le moment et l'endroit où la fusion des vésicules insère du matériel membranaire dans la membrane plasmique en expansion au cours du développement neuronal. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle combine l'imagerie de cellules vivantes pour obtenir une résolution spatiale et temporelle élevée au niveau de cellules individuelles, et des approches biochimiques pour obtenir des informations basées sur des populations cellulaires.Après la culture et la simulation de neurones corticaux avec la Netrine-1 ou un contrôle selon le texte du protocole. Aspirez le PBS à partir du premier puits d'une condition et remplacez-le par 250 microlitres de tampon d'homogénéisation. Incubez sur de la glace pendant cinq minutes, puis, à l’aide d’un grattoir à cellules, homogénéisez les cellules sur de la glace.Aspirez le PBS du puits suivant de la même condition et ajoutez-

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Imagerie in vitro en temps réel de la ramification axonale dans les neurones corticaux de souris

Nous décrivons ici l’utilisation d’une variante fluorescente verte pH-sensible de protéine, pHluorin, pour étudier la dynamique spatio-temporelle des récepteurs de guidage axon en trafic à la surface cellulaire. Le récepteur marqué par la pHluorine est exprimé à la fois en culture cellulaire et in vivo, enutilisant l’électroporation de l’embryon de poussin.

Utilisation de la pHluorine pour évaluer la dynamique des récepteurs de guidage axonaux dans la culture cellulaire et dans l’embryon de poussin

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Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures

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In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

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