Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

L’objectif global de cette procédure est d’immunolocaliser les protéines qui sont activées dans l’embryon de poisson-zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement et de la biologie cellulaire, telles que la localisation et l’activation des protéines phosphorylées dans un embryon entier. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut localiser la signalisation dépendante du calcium dans un embryon entier par des protéines d’immunomarquage activées par le calcium.

Après avoir obtenu des embryons de type sauvage ou transgéniques selon le protocole de texte, ajoutez 0,003 % de PTU aux embryons dans l’eau du système pour bloquer la pigmentation et incuber jusqu’au stade de développement souhaité. Lorsque les embryons ont atteint le bon stade, ajoutez du MESAB dans la boîte pour anesthésier le poisson. Une fois les poissons anesthésiés, retirez autant d’eau que possible, puis ajoutez du PFA et du PBS frais à 4 % et incubez à température ambiante pendant trois à quatre heures.

Après l’incubation, retirez le PFA et utilisez du méthanol à 100 % pour le remplacer. Ensuite, conservez les embryons à moins 20 degrés Celsius pendant au moins 48 heures. Pour effectuer une immunomarquage, placez un minimum de 10 embryons pour chaque condition expérimentale dans des tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millimètre marqués.

Lorsque les embryons se sont déposés au fond du tube, retirez et jetez le méthanol et utilisez des lavages progressifs de concentrations décroissantes d’éthanol dans PBTx pour réhydrater les embryons. Retirez le dernier lavage PBTx et ajoutez 0,5 millilitre de sérum de chèvre normal à 10 % ou de NGS dans PBTx. Ensuite, incubez à température ambiante pendant au moins une heure en le berçant doucement.

Ensuite, retirez la solution et ajoutez 0,2 à 0,5 millilitre d’une dilution de 1 sur 5 d’anticorps monoclonal anti-tubuline acétylée de souris et 10 % NGS et PBTx. Incuber les embryons avec un léger balancement à température ambiante pendant la nuit. Le matin, retirez et jetez l’anticorps et effectuez trois lavages avec 0,5 millilitre de NGS à 2 % et de PBTx avec un balancement doux pendant cinq minutes chacun.

Tamisez les plafonniers et ajoutez 500 microlitres à chaque échantillon d’une dilution de 1 sur 500 d’anticorps secondaires conjugués à la fluorescence dans 10 % NGS et PBTx. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant quatre heures avec un léger balancement. Après l’incubation, lavez les embryons trois fois.

Pour co-immunocolorer, ajoutez une dilution de 1 sur 20 d’anticorps anti-phospho CaMKII. Incuber dans l’obscurité avec un léger balancement pendant la nuit. Le lendemain matin, après avoir lavé les embryons avec 2 % de NGS et de PBTx trois fois, ajoutez une dilution de 1 sur 5 d’IgG de chèvre conjuguée fluorescente rouge 568 et de 10 % de NGS et de PBTx.

Après l’incubation dans l’obscurité à température ambiante pendant quatre heures, lavez les embryons trois fois et stockez-les dans du PBTx ou du glycérol à 50 % dans du PBS selon la procédure d’imagerie. Pour monter les embryons pour l’imagerie, placez un à cinq embryons sur une lame de verre. Utilisez quatre fragments de lamelle empilés numéro un de chaque côté du poisson pour créer une chambre.

Et placez une lamelle sur le dessus. Avec l’objectif à immersion dans l’huile 100X et la lumière transmise, faites la mise au point sur un seul embryon. Éteignez la lumière.

Allumez le microscope confocal avec les lasers appropriés et engagez la mise au point à distance. Ouvrez le programme confocal et dans la barre d’acquisition, sélectionnez l’objectif approprié. Ensuite, dans la barre de base XY, cliquez sur le bouton 1024 pour définir la taille de l’image.

Dans la barre laser et détecteur, cliquez sur les cases rouge 488 et verte 568 pour allumer le détecteur laser pour chaque canal et régler le sténopé sur moyen. Ensuite, dans la barre de gain, ajustez le gain de chaque canal pour le visualiser. Ensuite, dans la barre des paramètres d’acquisition, cliquez sur en direct pour commencer à acquérir des images.

Dans la barre des paramètres d’affichage, décochez la case Forcer le zoom intégral au centre dans la fenêtre en direct. Dans la barre des paramètres d’acquisition sous l’onglet Z, parcourez les calques de l’image. Après avoir sélectionné le nombre de calques à incorporer dans l’image, déplacez-vous vers un point situé au centre du plan Z.

Sous l’onglet Z, cliquez sur la petite zone de référence rouge. Cela mettra à zéro la RFA au point choisi comme centre. Dans la zone intitulée Taille du pas, sélectionnez l’épaisseur des couches.

Faites attention à la case de taille de fichier et essayez de limiter les fichiers à un gigaoctet. Pour trouver l’extrémité supérieure de l’image, cliquez sur le cercle en regard du haut et parcourez les calques Z. Cliquez maintenant sur le cercle à côté du bas et l’ordinateur ramènera l’image au calque au centre.

Ensuite, dans la boîte des paramètres d’acquisition, cliquez à nouveau sur vivre pour arrêter l’acquisition laser. Dans ce panneau, cliquez sur les cases rouges Moyenne et Pile Z. Ces cases deviendront vertes.

Dans la zone des paramètres d’acquisition, cliquez sur unique pour acquérir la série complète d’images. Surveillez la progression pendant qu’il effectue un balayage dans les deux canaux et dans l’ensemble de la pile Z. Pour enregistrer, cliquez sur la fenêtre du volume, puis cliquez sur Enregistrer sous et nommez le fichier.

Pour effectuer le rendu en volume du fichier, alors que la pile Z est encore ouverte, sélectionnez le menu déroulant des données et cliquez sur le rendu en volume. Enregistrez le fichier rendu en tant que fichier dot tif. Cette figure montre l’immunocoloration pour le P-CaMKII et la tubuline acétylée, qui est un marqueur standard pour les cils dans la vésicule de Kuppfer ou KV du poisson zèbre. L’alimentation des cils primaires génère un flux circulaire de liquide, ce qui conduit à une élévation du calcium dans les cellules ciliées tapissant le KV et à l’activation de CaMKII dans des endroits discrets, comme on le voit ici.

Ces figures montrent le P-CaMKII tel qu’il apparaît sur la surface apicale des cellules ciliées tapissant des régions spécifiques des canaux périnéphriques entre 24 et 72 heures après la fécondation ou HPF. À un jour de développement, l’oreille embryonnaire du poisson-zèbre fixée avec du PFA et du méthanol conserve ses structures et permet la détection de la coloration CaMKII à la base et sur toute la longueur du kinocilum. À 72 HPF, l’oreille interne a été contre-colorée avec de la phalloïdine Alexa 488 et de la tubuline anti-acétylée avec Alexa 568.

La fixation au méthanol PFA a préservé à la fois l’actine F et la tubuline. Ce poisson de 30 HPF exprimait une GFP ciblée sur la membrane, qui serait perdue avec la fixation au méthanol. La fixation du PFA a entraîné une diminution du signal P-CaMKII par rapport à la fixation avec le PFA et le méthanol.

Cependant, à ce stade de développement, le signal est suffisamment fort pour être détecté sans méthanol. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des embryons frais et des agents libres frais.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de localiser les phosphoprotéines dans les embryons de poisson-zèbre.