Name: Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Découvrez l'analyse de la rétrotransposition LINE-1 au niveau du noyau unique par hybridation in situ en fluorescence (FISH) dans les cellules HepG2. Cette méthode permet d'évaluer avec précision les taux et les schémas de rétrotransposition.

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Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’Institut national des sciences de la santé environnementale (ES014443 et ES017274) et d’AstraZeneca à KSR.

Remarque: Toutes les étapes doit être effectuée à la température ambiante, sauf indication contraire. S&#39;il vous plaît se référer à la section Réactifs pour plus de détails sur la façon de préparer des réactifs individuels. 1. Étiquetage L1 Sondes REMARQUE: Les sondes peuvent être marquées par un marquage chimique ou PCR. <ol><li> Marquage chimique <ol><li> Faire gel d&#39;agarose à 0,7-1% dans le tampon Tris-acétate-EDTA (TAE) du tampon, de la chaleur dans un four micro-ondes jusqu&#39;à ce que fondu, laisser refroidir le gel, puis ajouter du bromure d&#39;éthidium (0,5 pg / ml). Verser dans le bac de gel, ajouter des peignes et laisser le gel se solidifier à la température ambiante. </li><li> Marquer la sonde Sneo (1-2 pg) avec ou CY3 FITC à 37 ° C pendant 1 heure selon le protocole du fabricant. NOTE: Sneo désigne le S pliced ​​gène mycin Neo exprimé après un cycle complet de retrotransposition. La sonde est de ~ 1000 pb. Sneo peut être amplifié par PCR de tout vecteur ou de genomic ADN. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur streptavidine CY3 / FITC réactifs de marquage. </li><li> Mélanger la solution de sonde Sneo marquée avec un tampon d&#39;ADN 1x de chargement, charge dans chaque puits et exécuter à 75-100 volts pendant 15-20 min. </li><li> Visualiser la bande de sonde en utilisant un Ultra Violet (UV) Illuminateur. Notez que la taille de la sonde Sneo peut être ajustée et que les noyaux de verrouillage d&#39; acide (LNA) peut également être ajoutée (figure 2). </li><li> Cut sonde marquée Sneo du gel avec une lame propre, solubiliser et purifier la sonde Sneo du gel en utilisant un kit Clean-Up PCR selon le protocole du fabricant. ATTENTION: Couvrir chaque de partie exposée du corps avec des boucliers de protection (c. -à- manteaux de laboratoire et UV masque clair) lors de la visualisation et la coupe du gel. Voir le tableau des matières et réactifs pour information au gel purifier les produits de PCR. </li><li> Re-run 5 pi de Sneo étiquetés sonde avec une sonde Sneo non marqué sur un gel d&#39;agarose à 0,7% (voir 1.1.1) pour conAugmenter la taille de l&#39; entreprise et la perte d&#39;intensité du signal (figure 2). </li><li> Quantifier la quantité de sonde Sneo marqué en mesurant l&#39;absorbance à 260 nm et diluer la sonde Sneo à 10 ng / ul aliquotes dans nucléase libre H 2 O. aliquotes de conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Étiquetage PCR (méthode alternative pour l&#39; étiquetage de la sonde) <ol><li> Combiner des amorces spécifiques (5&#39;-Sneo ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;et 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) avec des réactifs de PCR dans un seul tube: 13,6 ul de nuclease libre H 2 O; 0,1 pi de dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ul dTTP (10 nM); 0,05 ul dUTP-biotine / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 pi Go Tag 5x tampon; 0,4 ul Go Tag Polymerase; 1 pl Sneo gabarit (10 ng). Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur les réactifs de PCR. </li><li> Ajuster la quantité de chaque réactif en multipliant par le nombre total d&#39;échantillons. </li><li> Utilisez le paramètre vélo PCR suivants pour amplifier et d&#39;étiquettes Sneo sondes: 95 ° C pendant 2 minutes; 35 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 62 ° C pendant 30 secondes, 72 ° C pendant 60 secondes; 72 ° C pendant 2 min; Tenir à 4 ° C indéfiniment. REMARQUE: La température de recuit peut être ajustée ou PCR gradient peut être effectuée pour déterminer des températures de recuit optimales pour d&#39;autres sondes. </li><li> Faire gel 0,7-1% comme dans la section 1.1.1, la charge et de visualiser la bande de sonde dans la section 1.1.4. </li><li> Couper et purifier la sonde Sneo étiquetés comme dans la section 1.1.5. </li><li> Re-run 5 pi de Sneo étiquetés sonde avec Sneo sonde non marqué pour confirmer l&#39; augmentation de la taille et la perte d&#39;intensité du signal (voir la figure 2). </li><li> Quantifier la quantité de sonde Sneo marquée par mesure de l&#39; absorbance à 260 nm et diluer la sonde Sneo à 10 ng / ul aliquotes dans nucléase libre H 2 O. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des étalements chromosomiques <ol><li> Générer des clones stables exprimant le squelette du vecteur (control) ou rétrotransposition L1 compétent en utilisant des méthodes classiques de sélection. 12,16 Bien que les reporters non épisomiques ont été utilisés pour mettre en corrélation les résultats avec les études de transcription, des vecteurs épisomiques peuvent également être utilisés. Cultiver des cellules exprimant de manière stable le contrôle ou L1 vecteur (1 x 10 6 cellules par 10 cm plaque, avec des ajustements de la taille de la plaque réalisés selon les besoins) dans les milieux de croissance complet. Pour les cellules HepG2, en utilisant du RPMI-1600, 10% de SVF et 200 ug / ml d&#39;hygromycine. Cultiver les cultures à 70% de confluence à 37 ° C et 5% de CO 2. NOTE: Le choix du milieu de croissance est dépendante du type de cellule. Etant donné que les plasmides utilisés ici comportent des cassettes de sélection à la fois pour l&#39;hygromycine et la néomycine, la sélection stable de clones pourrait également être fait avec de la néomycine après sélection sur hygromycine, mais la quantité de néomycine doit être optimisé pour établir des seuils de tolérance pour chaque type de cellule. </li><li> Ajouter colcémide (0,4 pg / ml) au milieu de culture et incuber pendant 90 min pour arrêter les cellules à métaphase. Si l&#39;on utilise différents types de cellules, déterminer la concentration optimale de la colcémide et le temps d&#39;exposition (60, 90 et 120 min) pour optimiser arrêt de la métaphase de manière empirique. </li><li> Laver les cellules 2 fois avec 10 ml de PBS 1x Dulbecco (DPBS), trypsiniser en y ajoutant 5/3 ml d&#39;une solution à 0,25% de trypsine aux cellules et incuber pendant 5 minutes pour détacher les cellules. Inactiver trypsine avec une quantité égale de milieux contenant 10% de FBS. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 2 min à 1000 x g à 4 ° C, aspirer le milieu à partir du culot cellulaire et laver les cellules avec du DPBS. Aspirer tous les DPBS, laissant 200 pi de DPBS pour remettre en suspension les cellules. cellules Veiller sont bien mélangés et que tous les bouquets sont dispersés. Utilisez le scintillement ou pipetage doux pour mélanger et disperser des touffes et éviter tourbillonnement. </li><li> Ajouter 5 ml de solution hypotonique (ie, 75 mM KCl) qui est pré-chauffé à 37 ° C goutte à goutte tout en faisant tourner le tube de 15 ml horizontalement et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Voir le tableau des matériaux et Reagents pour obtenir des informations sur la façon d&#39;obtenir et de faire une solution hypotonique. </li><li> Centrifuger les cellules à 120 g pendant 5 min à 4 ° C et répétez les étapes 02.04 à 02.05 3x laissant environ 200 pi de solution hypotonique pour remettre en suspension les cellules après chaque lavage. Faire en sorte que, à la fin des 3 lavages, le culot est visiblement blanc et gonflé. </li><li> Re-suspendre le culot dans 200 ul de solution Carnoy fixatif et faire 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 dilutions en solution Carnoy fixatif. Déposer 10 ul de chaque dilution sur une lame propre et sec à partir d&#39;environ 1 cm au-dessus et d&#39;exposer immédiatement le côté libre diffusion à la vapeur chaude de l&#39;eau bouillante pendant 30 secondes. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour des informations sur la façon de rendre la solution Carnoy fixatif. </li><li> Sécher les écarts à la température ambiante, tache avec 0,1 pg / ml de Hoechst-33342 par immersion pendant 15-20 min en Coplin Jar et laver 3x avec du DPBS. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon de rendre la solution Hoechst-33342. </li> &lt;li&gt; Voir se propage sur la fluorescence / contraste de phase microscope au grossissement 40X. Après l&#39; optimisation de la préparation de la propagation, les écarts ne doivent pas être colorées avec Hoechst-33342. Voir se propage sur le contraste de phase microscope au grossissement 10X pour déterminer la qualité et la propagation de séparation tel que décrit dans la section des résultats (voir Figure 3). </li><li> Sélectionnez et encerclez bons spreads avec un Marqueur de diamant sur ​​le côté opposé de la glissière (c. -à- diffuser sans côté). </li><li> Magasin se propage à -20 ° C pendant jusqu&#39;à un mois. Eviter l&#39;exposition à l&#39;humidité. </li></ol> 3. Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) <ol><li> Stabiliser et déshydratant spreads NOTE: Equilibrer métaphase chromosome se propage à la température ambiante si elle est conservée à -20 ° C. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon d&#39;obtenir et de faire des réactifs. <ol><li> Incuber métaphase chromosome se propage avec 200 pi RNase A pour1 heure à 37 ° C. </li><li> Laver les lames dans du tampon SSC 2x deux fois pendant 5 min à chaque fois suivi d&#39;un rinçage avec une solution 10 mM de HCl. </li><li> Incuber spreads avec 1% de pepsine pendant 10 min à 37 ° C, rincer avec de l&#39; H 2 O désionisée et laver deux fois avec un tampon de 2x-SSC pendant 5 minutes chacun. </li><li> Incuber spreads avec 4% de paraformaldehyde pendant 10 minutes et laver dans un tampon SSC 2x deux fois pendant 5 min chacun. </li><li> Déshydrater se propager par incubation pendant 2 min dans une série d&#39;éthanol: 70%, 80% et 95% d&#39;éthanol. </li><li> diapositives Air sec. </li></ol></li><li> Hybridation Spreads avec L1 sondes rétrotransposition marqué au (ie, Sneo) ATTENTION: Pour les sondes directes marqué, tenir à l&#39;écart de la lumière à tout moment. Voir Tableau des Matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon d&#39;obtenir et de faire des réactifs. <ol><li> Ajouter 30 ng d&#39;Sneo à un tampon d&#39;hybridation, de la chaleur à 72 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir pendant 2 minutes à la température ambiante. </li><li> Ajouter 30 pl de solution de sonde Sneo à each propagation, couvrir avec lamelle et sceller les bords avec du ciment en caoutchouc. Assurez-vous qu&#39;aucune formation de bulles. </li><li> Chauffer la lame à 72 ° C pendant 5 minutes sur un bloc de chaleur, baisse progressive de la température à 37 ° C, et incuber pendant une nuit dans une chambre humidifiée obscurité à 37 ° C. </li></ol></li><li> Lavage et Affichage (ou adjonction d&#39;anticorps secondaire) ATTENTION: Pour les sondes directes marqué, tenir à l&#39;écart de la lumière à tout moment. NOTE: Voir le tableau des matériaux et réactifs pour obtenir des informations sur la façon de se préparer. Utilisation d&#39;un volume suffisant pour couvrir la totalité de la propagation des chromosomes est recommandé. Rappelez-vous que le volume excédentaire sera perdue lorsque la lamelle est ajouté. <ol><li> Immerger les lames dans un tampon SSC 2x pour enlever des lamelles. </li><li> Laver les lames par immersion dans un tampon de SSC 2x à 45 ° C pendant 5 min. </li><li> Laver les lames par immersion dans un tampon de lavage à 45 ° C pendant 5 minutes, 2x. </li><li> Laver les lames par immersion dans du tampon SSC 0,1x à 45 ° C pendant 10 min. </li><li>Laver les lames par immersion dans un tampon SSC 2x à 45 ° C pendant 10 min. REMARQUE: Placez un pot Coplin contenant du tampon recommandé dans un bain d&#39;eau, régler la température à 45 ° C. </li><li> Refroidir les lames à température ambiante et équilibrer les lames dans le tampon de détection. </li><li> Pour des sondes marquées directes, passez à l&#39;étape 3.4.10. </li><li> Pour des sondes marquées indirectes, bloc dans un tampon de blocage pendant 20-30 min et laver 3x dans DPBS. </li><li> Incuber avec 50 pi d&#39;anticorps secondaire (par exemple, 5 ug / ml de streptavidine-FITC, ou αCY3 dans un tampon de blocage) pendant 1 h. </li><li> Laver les lames dans 2x SSC pendant 5 minutes deux fois. </li><li> Counterstain avec Hoechst-33342 solution (0,1 pg / ml) pendant 10 min. NOTE: cette coloration est fait pour colorer les chromosomes pour la co-localisation avec sonde. </li><li> Laver à DPBS 3x, ajouter une goutte de milieu de montage, placer une lamelle et sceller les bords avec du vernis à ongles. </li><li> Analyser L1 retrotransposition en utilisant un microscope à fluorescence à 40X magnification. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts potentiels.

Des méthodologies telles que le séquençage du génome entier, PCR inverse et dans le sud - blot ont été utilisées pour étudier L1 retrotransposition. Bien que ces méthodes sont extrêmement utiles pour localiser où insertions L1 se produisent dans les génomes, un défi de confusion pour chacun d&#39;eux est la nécessité pour la programmation in-silico pour réassembler des séquences. La méthodologie FISH décrite ici est conçue pour compléter ces méthodes, en particulier dans le cas des études néce...

Human long Interspersed nucléaire Element-1 (Line-1 ou L1) est un élément mobile autonome qui se propage dans le génome par un &quot;copier-coller&quot; mécanisme de retrotransposition. A L1 humain typique est environ 6 kb et consiste en un 5&#39;UTR (région non traduite) qui sert de promoteur, deux cadres de lecture ouverts (ORF): L1 et L1 -ORF1 -ORF2, et un 3&#39;UTR avec un polyA . queue L1 protéine -ORF1 a trois domaines distincts: un domaine bobine-bobine, ARN reconnaissance Motif et domaine C-terminal, alors que la protéine L1 -ORF2 a endonucléase, la transcriptase inverse et cystéine riches domaines 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 présente des activités chaperonnes d&#39;acide nucléique, tandis que L1 -ORF2 fournit des activités enzymatiques, avec les protéines nécessaires à la rétrotransposition 1,2,6. Un cycle de L1 retrotransposition commence par la transcription de la 5&#39;UTR de L1 </em&gt; ARNm bicistronique par l&#39;ARN polymérase II, translocation dans le cytoplasme, et la traduction. Dans le cytoplasme, L1 -ORF1 présente soit cis de liaison d&#39; où elle conditionne son propre ARN ou trans liaison d&#39; où elle emballe les autres ARN (c. -à- SINE / SVA / pseudogènes) pour former une particule de ribonucléoprotéine (RNP) avec L1 -ORF2p 7, 8. RNP translocation dans le noyau où l&#39;activité d&#39;endonucléase de L1 -ORF2p pseudos ADN génomique (ADNg) pour exposer un groupe OH - groupe 9, qui est à son tour utilisé par la transcriptase inverse pour amorcer et inverse l&#39; ARN synthétisent l&#39;ADN de l&#39; extrémité 3 &#39;. Lors de la synthèse inverse, le second brin d&#39;ADN est entaillé 7-20 pb à partir du site nick d&#39; origine pour créer des pauses décalées qui sont remplis pour former les signatures insertion L1 séquences (par exemple, TTTTAA) appelés duplications site cible (DNT) 9,10. Ce processus est connu comme cible principale transcription inverse (TPRT) et conduit à Insertisur des copies complètes ou tronquées de L1 / DNT avec d&#39; autres ADN aux deux extrémités de la séquence insérée L1 rétrotransposition a également été démontré. médié par TPRT analogue à la fin de jonction non homologue dans certains types de cellules 11. Le vecteur L1 rétrotransposition utilisé dans nos études est non épisomiques et se compose de tagged L1 -ORF1 &amp; 2p commandés par des promoteurs CMV L1-5&#39;UTR combinés (figure 1) 12. Les versions antérieures de cette construction ont été décrits dans des études utilisant des levures et des cultures de cellules humaines 13,14,15. Deux promoteurs CMV distincts situés aux extrémités 5 &#39;et 3&#39; du vecteur, à l&#39;extrémité 3 &#39;placé dans une orientation inverse pour diriger l&#39;expression de la néomycine après épissage et d&#39;intégration. La cassette d&#39;indicateur de rétrotransposition à l&#39; extrémité 3 &#39; se compose d&#39;un gène inséré anti - sens à la néomycine L1 -ORFs et rendu inactif par séparation en deux moitiés par une bouledans l&#39; intron avec le donateur épissage (SD) et accepteur épissage (SA) sites (figure 1). Lors de l&#39; intégration dans un chromosome, L1 est transcrit à partir du promoteur commun pour produire un ARNm qui est constitué d&#39;un ARNm bicistronique et de l&#39; ARNm néomycine inactif. Au cours du traitement de l&#39;ARN, l&#39;intron de globine est épissé du gène de la néomycine pour restaurer un gène de néomycine complètement fonctionnel. L&#39;ARNm hybride est emballé dans un RNP en cis et translocation dans le noyau où il est intégré dans le génome comme étant soit pleine longueur ou tronquées insertions en utilisant TPRT. Nous décrivons ici une méthode qui utilise l&#39; hybridation fluorescente in situ (FISH) avec des sondes spécifiquement dirigés au gène de la néomycine épissé (Sneo) pour suivre les habitudes de -retrotransposiition L1 et les taux d&#39;insertion au niveau du noyau unique. L&#39;efficacité et la spécificité de la détection a été confirmée en utilisant retrotransposition compétent et constructions incompétents et sondes pour detect Sneo ou la néomycine et globine intron jonction 16. Cette méthodologie représente pour certaines des lacunes des tests de rétrotransposition à base de culture cellulaire, tels que des insertions multiples, la résistance des colonies et l&#39;expansion du clone favorable.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Sondes de marquage</td></tr><tr><td>Go Tag ADN polymérase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x tampon incolore</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Ajuster la concentration de dATP, dGTP, dCTP à 2&nbsp ; mM et dTTP à 1,5&nbsp ; mM dans de l’eau sans nucléases.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotine (0,5 mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0,5 € ; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0,5&nbsp ; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Labellisation Kit d’étiquetage</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>N’importe quel réactif de nettoyage PCR peut être utilisé à la place de NucleoSpin PCR Clean Up Kit</td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle machine Thermocycler peut être utilisée pour amplifier le produit d’étiquetage.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Preparation chromosome spreads</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>15212-012</td><td>Ajouter le colcémidé directement dans le milieu de croissance jusqu’à une concentration finale de 0,4 et micro ; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp ; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Dilué 1&nbsp ; M KCl solution à 75&nbsp ; Solution mM pour faire une solution hypotonique</td></tr> Solution <tr><td>fixatrice</td><td></td><td></td> Carnoy <td>Mélangez 3 volumes de méthanol et 1 volume d’acide acétique pour faire une solution fixatrice Carnoy. Make Fresh à chaque fois.</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissoudre Hoechst-33342 dans le PBS jusqu’à une concentration finale de 1&nbsp ; mg/ml.</td></tr><tr><td>Marqueur à pointe de diamant</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Lames givrées</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>R001100</td><td>Pour détechiser les cellules, incubez la cellule dans de la trypsine pendant 5 min et inactive avec un volume égal de milieu complet.</td></tr><tr><td>Lames de couverture</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>N’importe quel bloc chauffant peut être utilisé à cet effet, bien que des blocs montés pour les lames chauffantes soient recommandés.</td></tr><tr><td>Bécher (600&nbsp ; ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Remplissez le bécher d’eau, faites chauffer à ébullition, utilisez la vapeur chaude pour faire éclater les chromosomes.</td></tr><tr><td>Microscope Nikon</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>N’importe quel microscope peut être utilisé pour examiner la qualité de la diffusion.</td></tr><tr><td colspan="4">Réactifs et matériaux pour FISH</td></tr><tr><td>Trisodium</td><td>citrate Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chroride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfate</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Saumon Spermatozoïde ADN</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>Sigma</td><td>459844</td> Méthanol Sigma 322415 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Dissoudre Hoechst-33342 dans le PBS à une concentration finale de 1&nbsp ; mg/ml.</td></tr><tr><td>Ciment de caoutchouc/Scellant Cytobond&nbsp ;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Seven Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Dark Chambre humidifiée</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Dry Digital Heat Block</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td>à fluorescence</tr><tr><td>20x Citrate salin-sodium (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Mélanger 175 g de NaCl et 88,2 g de citrate trisodique avec 800 ml de H2O. Agiter en ajustant le pH 7. Une fois que tous les sels se dissolvent, ajustez le volume à 1 L et filtrez à travers 0,22 & micro ; m Papier filtre. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>1&nbsp ; mg/ml de Rnase A</td><td></td><td></td><td>Diluer 20x tampon SSC pour 2x tampon SSC. Dissoudre la RNase A dans 2 tampons SSC jusqu’à une concentration finale de 1 mg/ml. Préparez une solution fraîche à chaque fois.</td></tr><tr><td>Pepsine</td><td></td><td></td> à 1 % <td>Dissoudre la pepsine (P/V) dans 10 mM de HCl jusqu’à une concentration finale de solution à 1 %. Faites du frais à chaque fois.</td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde (4 % de PFA)</td><td></td><td></td><td>Peser 4,0 g de PFA dans la hotte, ajouter 50 ml de 1xPBS, chauffer à 60&nbsp ; &deg ; C en remuant et ajustez le pH avec des gouttes de NaOH jusqu’à ce que tout le PFA se dissolve et que la solution devienne claire. Réglez le volume à 100&nbsp ; ml, filtrer par 0,22 et micro ; m Papier filtre et stocker 5 ml d’aliquotes à -20&nbsp ; &deg ;C. Aliquote de dégel de la PFA à 37 &deg ; C pendant 10-15 min pour les utilisations ultérieures. Ajustez la taille du filtre en fonction de la quantité de paraformaldéhyde.</td></tr><tr><td>Combinez</td><td></td><td></td><td>100 ml de Formamide (20 %) avec 2,5 ml de 20x SSC, ajustez à pH 7 avec 1,0 M HCl et portez le volume à 500 ml avec du grade moléculaire H2O.</td></tr><tr><td>Combinez</td><td></td><td></td><td>50 % de formamide, 10 % de sulfate de dextran, 0,1 % de SDS et 300 ng/ml d’ADN de spermatozoïde de saumon dans 2 tampons SSC. La quantité de formamide détermine le degré de focalisation des chromatides ; Titrez la quantité.</td></tr><tr><td>Diluez</td><td></td><td></td><td>20x le tampon SSC à 4x et ajoutez 0,2 % de Tween-20 pour obtenir un tampon de détection.</td></tr><tr><td>Combinez</td><td></td><td></td><td>5 % d’albumine sérique bovine (BSA) avec 0,2 % de Tween-20 dans 4 tampons SSC.</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>de déshydratation</td><td>Préparez des solutions d’éthanol à 70 %, 80 % et 95 %.</td></tr></tbody></table>

analyse de line-1 rétrotransposition au nucleus simple level

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

L’élément nucléaire intercalé long 1 (Line-1 ou L1) représente environ 17 % de l’ADN présent dans le génome humain. Alors que la majorité des L1sont inactifs en raison des troncatures de 5', ~80 à 100 de ces éléments restent compétents en rétrotransposition et se propagent à différents endroits du génome via des intermédiaires d’ARN. Alors que l’on pense que les anciennes L1 ciblent les régions riches en AT du génome, les cibles chromosomiques des L1 plus récentes et plus actives restent mal définies. Nous décrivons ici la méthodologie d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) qui peut être utilisée pour suivre les modèles d’insertion de L1 et les taux d’incorporation ectopique de L1 au niveau du noyau unique. Dans ces expériences, des sondes de néomycine marquées à la fluorescéine isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) ont été utilisées pour suivre la rétrotransposition in vitro de L1 dans des cellules HepG2 exprimant de manière stable L1 ectopique. Cette méthodologie permet d’éviter les erreurs dans l’estimation des taux de rétrotransposition posés par la toxicité et de tenir compte de l’apparition d’insertions multiples dans un seul noyau.

Un diagramme schématique du vecteur rétrotransposition L1 est présenté dans la figure 1. Le vecteur est constitué d&#39;un gène de la néomycine dans l&#39; orientation antisens par rapport à L1 ORFs qui est interrompu par un intron de globine dans l&#39; orientation sens et pris en sandwich par les sites SD et SA. Quand intégré de façon stable dans un chromosome, L1 ARNm est transcrit à partir du promoteur CMV et le combiné L1-5&#39;UTR <strong...

Ici , nous utilisons la méthodologie FISH pour suivre LINE-1 retrotransposition au niveau des noyaux unique étalements de chromosomes de lignées cellulaires HepG2 exprimant de façon stable LINE-1 synthétique.

Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et d'analyser les taux et les profils de rétrotransposition L-1 au niveau du noyau individuel à l'aide de l'hybridation in situ en fluorescence, ou FISH. Le principal avantage de cette méthodologie réside dans le fait qu'elle permet à l'expérimentateur d'éviter la surestimation ou la sous-estimation des taux et des profils de rétrotransposition, et qu'elle permet, lorsqu'elle est complétée par d'autres méthodologies, l'étude de la rétrotransposition L-1 au niveau des noyaux individuels. Cette procédure est réalisée aujourd'hui par le Dr Pasano Bojang, chercheur senior dans le laboratoire.Pour commencer, après avoir préparé un gel d'agarose à 0,7 % à 1 % dans un tampon TAE selon le protocole indiqué dans le texte, marquer la sonde SNeo avec du CY3 ou du FITC et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure selon le protocole du fabricant. Mélanger la solution de sonde SNeo marquée avec du tampon de charge d'ADN 1X et charger dans les puits du gel d'agarose. Puis faire migrer le gel à 75 à 100 volts pendant 15 à 20 minutes.À l'aide d'un illuminateur UV, visualisez la bande de la sonde. Puis, avec une lame propre, découpez la sonde SNeo marquée du gel. Ensuite, utilisez un kit de purification PCR selon le protocole du fabricant pour solubiliser et purifier la sonde SNeo.Après purification, réexécuter cinq microlitres de sonde marquée SNeo avec une sonde SNeo non marquée sur un gel d'agarose à 0,7 % afin de confirmer l'augmentation de taille et la perte d'intensité du signal. Pour quantifier la quantité de sonde SNeo marquée, mesurer l'absorbance à 260 nanomètres et diluer la sonde SNeo en aliquots de 10 nanogrammes par microlitre dans de l'eau sans nucléase. Conserver les aliquots à moins 20 degrés Celsius.Après avoir généré des clones stables exprimant L-1 rétrotranspositionnellement compétent ou le squelette du vecteur, cultiver les cellules HepG2 exprimant de façon stable le vecteur contrôle ou L-1. Ajouter 0,4 microgramme par millilitre de colcemid dans le milieu de culture. Et incuber pendant 90 minutes afin d'arrêter les cellules en métaphase.Utilisez 10 millilitres de PBS de Dulbecco 1X, ou DPBS, pour laver les cellules deux fois. Ajoutez ensuite une solution de trypsine à 0,25 % et incubez pendant cinq minutes. Un milieu contenant 10 % de SFB a été ajouté pour inactiver la trypsine.Ensuite, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 1 000 G et 4 degrés Celsius pendant deux minutes. Aspirez ensuite le milieu à partir du culot cellulaire et utilisez du DPBS pour laver les cellules. Aspirez tout sauf 200 microlitres de DPBS et utilisez-le pour resuspendre les cellules en agitant doucement ou en pipetant délicatement afin de bien les mélanger et d’éviter tout agrégat.En faisant tourner le tube horizontalement, ajouter de manière goutte à goutte cinq millilitres de solution hypotonique préchauffée et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Centrifuger les cellules à 120 Gs et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, éliminer toute la solution hypotonique sauf 200 microlitres.Laver avec la solution de fixateur trois fois, en laissant environ 200 microlitres de solution de fixateur dans les cellules entre chaque lavage. Après les trois lavages, vérifier que le culot est bien blanc et gonflé. Ensuite, à l’aide de 200 microlitres de solution de fixateur de Carnoy, resuspendre le culot et utiliser le fixateur pour effectuer les dilutions suivantes des cellules resuspendues.Déposer 10 microlitres de chaque dilution sur une lame sèche et propre, à partir d'une hauteur d'environ un centimètre, puis exposer immédiatement la face sans dépôt de la lame à la vapeur d'eau chaude provenant d'une eau bouillante pendant 30 secondes. Après séchage des dépôts à température ambiante, colorer avec un milieu de montage contenant du DAPI et poser une lamelle. À l'issue de l'incubation, laver les lames trois fois avec du DPBS.Pour visualiser les étalages, utilisez un microscope à contraste de fluorescence avec un grossissement de 40X. Après avoir optimisé la préparation des étalages, il n'est pas nécessaire de les colorer. Pour marquer les bons étalages, utilisez un marqueur à pointe de diamant sur le côté opposé de la lame.Pour stabiliser et déshydrater les préparations de chromosomes en métaphase, appliquez 200 microlitres de RNase A sur les échantillons et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez les lames deux fois pendant cinq minutes chacune avec du 2X SSC, puis rincez les échantillons à l'aide de HCl 10 millimolaire. Ajoutez ensuite 1 % de pepsine sur les préparations et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après avoir rincé les lames avec de l’eau déionisée, laver les échantillons deux fois avec du 2X SSC pendant cinq minutes chacun. Ensuite, ajouter du paraformaldéhyde à 4 % sur les préparations et incuber pendant 10 minutes, puis effectuer deux lavages supplémentaires avec du tampon 2X SSC. Après les lavages au SSC, déshydrater les préparations en incubant les échantillons deux minutes chacun dans la série d’éthanol suivante.Ajouter 30 nanogrammes de SNeo au tampon d'hybridation et chauffer à 72 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidir à température ambiante pendant deux minutes. Ensuite, pipeter 30 microlitres de la sonde SNeo sur chaque lame, et utiliser une lamelle pour couvrir l'échantillon. À l'aide de ciment caoutchouté, sceller les bords en veillant à ce qu'aucune bulle ne se forme.Conserver la lame sur un bloc chauffant à 72 degrés Celsius pendant cinq minutes. Abaisser ensuite progressivement la température jusqu'à 37 degrés Celsius. Incuber toute la nuit à l'abri de la lumière dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius.Pour appliquer un anticorps secondaire, commencez par plonger les lames dans du tampon SSC 2X afin d'enlever les lamelles. Ensuite, immergez les lames dans du SSC 2X à 45 degrés Celsius pendant cinq minutes pour les laver, puis transférez les échantillons dans du tampon de lavage et effectuez deux lavages à 45 degrés Celsius, chacun de cinq minutes. Ensuite, immergez les lames dans du tampon SSC 0,1X à 45 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, laver les lames dans du tampon SSC 2X à 45 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après refroidissement des lames à température ambiante, pour les sondes marquées directement, utiliser du SSC 2X pour laver les lames deux fois pendant cinq minutes chacune. Équilibrer les lames dans du tampon de détection pendant 10 minutes à température ambiante (RT). Puis ajouter le milieu de montage contenant le DAPI et contre-colorer les échantillons pendant 10 minutes.Montez une lame couvre-objet et utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords. Enfin, analysez la rétrotransposition L-1 à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un grossissement de 40X. Comme illustré ici, la densité des préparations de chromosomes en métaphase a été déterminée en préparant des dilutions et en évaluant chaque préparation en fonction de sa densité, de sa distribution et de la distance des préparations par rapport au noyau.Des préparations à faible densité et à distribution uniforme ont été choisies pour les analyses ultérieures. Ces images représentent des préparations chromosomiques colorées avec le colorant Hoechst DAPI, et la qualité des préparations a été évaluée en fonction de la longueur des chromosomes, de la circularité des préparations et de la distance inter-chromosomique. Si les cellules étaient incubées pendant une courte période dans une solution hypotonique, les préparations chromosomiques devenaient fortement nouées et il était difficile de visualiser les chromosomes individuels.Cependant, une incubation plus longue dans une solution hypotonique a entraîné la rupture des noyaux, la dispersion des chromosomes et/ou la perte de chromosomes. Des incubations prolongées dans la colcémide ont augmenté le nombre de cellules en métaphase, mais ont provoqué une condensation des chromosomes. Comme illustré ici, une incubation de 90 minutes dans la colcémide, 20 minutes dans une solution hypotonique à 37 degrés Celsius, et l'utilisation d'une vapeur chaude pour rompre les cellules se sont révélées être les conditions optimales pour obtenir des préparations de haute qualité.Dans cette expérience, les préparations chromosomiques ont été colorées pour la rétroposition L-1 à l’aide de sondes ciblant SNeo. La sonde a été marquée à la fois avec FITC et CY3, ce qui montre que, dans les deux cas, la rétroposition L-1 n’est observée que dans les cellules exprimant le L-1 de type sauvage. Une fois maîtrisée, cette expérience peut en réalité être réalisée en six à huit heures, particulièrement si les durées d’hybridation sont comprises entre deux et quatre heures et que la technique est correctement appliquée.Lors de la mise en œuvre de la technologie, il est important de bien rincer, d'optimiser les durées d'hybridation et de marquer chimiquement les sondes dNTP afin d'éviter toute contamination. Afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la localisation chromosomique de l'insertion, des techniques complémentaires telles que le séquençage L-1 et le banding G peuvent être réalisées. Après avoir visionné cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la manière de marquer les sondes L-1, d'effectuer les étalements chromosomiques et de mesurer les profils et taux de rétrotransposition L-1 en utilisant la technologie d'hybridation in situ en fluorescence.Cette technologie a ouvert la voie à l'étude des profils de rétrotransposition de L-1 ainsi que des sites d'insertion de L-1. Il est important de se rappeler que lorsqu'on travaille avec des agents toxiques, des réactifs biologiques ainsi qu'avec la lumière ultraviolette, des précautions telles que le port de gants et d'équipements de protection sont essentielles.

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