Transcriptome profilage des In-Vivo embryons de bovins pré-implantation à l'aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

L’objectif général de cette vidéo est de fournir une procédure technique optimisée à l’aide d’une puce bovine bicolore sur mesure utilisant une faible quantité d’ARN total provenant d’embryons bovins du septième jour. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la perte embryonnaire chez les vaches laitières à haut rendement et des questions sur la qualité embryonnaire par rapport à l’expression génique dans l’embryon en développement avant l’implantation. L’avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier l’expression des gènes à l’aide du niveau du picogramme de l’ARN total extrait d’embryons uniques.

Cette méthode peut donner un aperçu du facteur affectant la survie des embryons préimplantatoires bovins produits in vivo. Cela peut également aider à améliorer les technologies de reproduction telles que les productions d’embryons in vitro. Pour commencer la procédure, préparez des embryons de bovins congelés instantanés dans un tube de microcentrifugation à partir d’un kit d’extraction d’ARN à l’échelle pico basé sur une colonne.

Ajoutez 10 microlitres de tampon de lyse dans le tube et incubez les embryons à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez le tube pendant deux minutes à 800 fois G.Pipette 250 microlitres de tampon de conditionnement dans la membrane filtrante de la colonne de purification, et incubez la colonne pendant cinq minutes à température ambiante. Centrifugez le tube collecteur à 16 000 fois G pendant une minute pour terminer le préconditionnement de la colonne.

Ajoutez 10 microlitres d’éthanol à 70 % au mélange de tampon de lyse et d’embryons et mélangez bien. Ensuite, chargez le mélange sur la colonne de purification. Centrifugez la colonne pendant deux minutes à 100 fois G, puis à 16 000 fois G pendant 30 secondes.

Ajoutez 100 microlitres du premier tampon de lavage dans la colonne et centrifugez à 8 000 fois G pendant une minute. À l’aide d’un kit DNase, mélangez cinq microlitres de solution mère avec 35 microlitres de tampon, et mélangez en inversant doucement le tube fermé. Ensuite, chargez le mélange de DNase sur la membrane de la colonne de purification et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.

Ajoutez 40 microlitres du premier tampon de lavage dans la colonne et centrifugez à 8 000 fois G pendant 15 secondes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du deuxième tampon de lavage et centrifugez pendant une minute. Ajoutez une autre partie du deuxième tampon de lavage dans la colonne et centrifugez pendant deux minutes à 16 000 fois G. Transférez la colonne de purification dans un autre tube de microcentrifugation et chargez 11 microlitres de tampon d’élution sur la membrane de la colonne.

Incuber la colonne pendant une minute à température ambiante. Centrifugez la colonne pendant une minute à 1 000 fois G, puis pendant une autre minute à 16 000 fois G.Vérifiez la qualité et la quantité de l’ARN élué, puis stockez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. À l’aide d’un kit d’amplification, amplifiez 100 picogrammes d’ARN de haute qualité.

Évaluez la gamme de tailles de l’ARNa amplifié à l’aide d’une quantification basée sur la fluorescence. Ensuite, déterminez la concentration d’ARNa par spectrophotométrie. Préparez deux microgrammes d’ARNa amplifié pour le marquage fluorescent à l’aide d’un kit standard.

Installez une boîte à ozone dans une chambre noire et attendez que le niveau d’ozone descende à 0,001 partie par million. Placez un filtre de chambre noire sur la lumière. Ensuite, apportez l’échantillon dans la boîte d’ozone et ajoutez deux microlitres de colorant cyanine cinq et un tampon d’étiquetage.

Avec l’échantillon sous une lumière sûre, ajoutez de l’eau libre de RNase pour obtenir un volume total de 20 microlitres. Mélangez délicatement l’échantillon, puis incubez le tube dans un thermocycleur à 85 degrés Celsius pendant 15 minutes. Refroidissez l’échantillon sur de la glace pendant une minute, puis faites-le tourner.

Nettoyez l’ARNa marqué et amplifié à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN. À l’aide du type de spectromètre approprié, déterminez la concentration d’ARNa marqué et amplifié. Préparez un deuxième échantillon d’ARNa amplifié marqué avec trois colorants de cyanine.

Conservez les échantillons d’ARNa à moins 80 degrés Celsius pendant trois jours maximum. Combinez 825 nanogrammes chacun de Cy3 et d’ARNa marqué 5. Ajoutez à cela le tampon de blocage et le tampon de fragmentation.

Incuber le mélange à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis laisser refroidir sur de la glace pendant une minute. Ajouter un tampon d’hybridation de 55 microlitres, et bien mélanger sans introduire de bulles d’air. Centrifugez le mélange à 11, 300 fois G pendant une minute.

Chargez 100 microlitres d’échantillon sur la lame du réseau et scellez la lame dans la chambre d’hybridation. Hybridez l’échantillon pendant 17 heures à 65 degrés Celsius tout en tournant à 10 rotations par minute. Préparez une solution stabilisatrice et séchante pour piéger la couche d’ozone.

Lavez les matrices en prenant des précautions pour minimiser l’exposition à l’ozone, puis plongez-les dans la solution stabilisante et séchante pendant 30 secondes. Assurez-vous que la surface de l’enceinte est sèche et exempte de poussière. Stockez les matrices dans un endroit sombre.

Allumez le scanner de microréseaux et attendez qu’il soit prêt à numériser. Ensuite, chargez le tableau avec le code-barres à gauche. Effectuez une analyse ponctuelle et enregistrez les données dans un fichier GPR.

Dans un logiciel d’analyse statistique, normalisez et analysez les données. Calculez le seuil de sélection de spot positif et visualisez le graphique des signaux hybrides et de fond. Effectuez une normalisation de Loess dans le tableau, puis une normalisation quantile entre les tableaux.

Exportez les données normalisées dans un fichier de tableur. Utilisez tous les signaux positifs dans un référentiel de données de microréseau pour créer une liste d’identification de gènes uniques sélectionnés. Téléchargez la liste d’identification dans une base de données de classification et d’analyse des protéines, en choisissant bos taurus comme organisme, et effectuez un test de surreprésentation statistique par défaut.

Après amplification en deux tours, les fragments sont de taille très similaire et de bonne qualité. Une amplification réussie par cette méthode devrait produire une augmentation d’au moins mille fois de l’ARNa. Une image de microréseau de haute qualité a une intensité de spot élevée et une faible intensité de fond sur les deux canaux.

Si l’intensité de l’arrière-plan est trop élevée, la résolution du signal sera médiocre. Environ 46 % des taches étaient au-dessus du fond, à partir desquelles 6 765 transcrits d’ARN uniques exprimés dans le blastocyste ont été isolés. Un test de surreprésentation statistique a indiqué que les 10 principaux termes de l’ontologie génétique représentaient des processus de division cellulaire actifs.

Le développement de cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la reproduction animale d’explorer l’expression des gènes embryonnaires et d’évaluer comment divers facteurs affectent l’embryon en développement. Cette technique a également été développée chez d’autres espèces importantes, comme le porc. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR quantitative peuvent être utilisées pour valider les résultats des microréseaux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire l’ARN des embryons ainsi que de la façon d’amplifier et de marquer l’ARN pour effectuer une analyse de microréseau bicolore.