Name: Traiter Souris SCA1 avec hydrosolubles composés à non-Spécifiquement Boost Fonction mitochondriale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Découvrez un protocole pour évaluer l'efficacité de composés hydrosolubles ciblant les mitochondries dans le traitement de l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 chez la souris.

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Nous tenons à remercier le Dr Harry Orr de l’Université du Minnesota pour son généreux don de souris transgéniques. Nous tenons également à remercier les anciens élèves du Skidmore College suivants pour leur travail dans la réalisation des expériences précédentes : Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson et Cheyanne Slocum. De plus, nous tenons à remercier le Skidmore College d’avoir financé le développement de ces méthodes.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
<li>Serra, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+profiling+links+SCA1+pathophysiology+to+glutamate+signaling+in+Purkinje+cells+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).</li>
<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+progressive+motor+deficits+in+mice+transgenic+for+the+human+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation.</a> J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).</li>
<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Si ces méthodes sont utilisées, comme décrit, ils sont capables de détecter et d&#39;atténuer l&#39;oxydation dysfonctionnement mitochondrial à médiation par la phosphorylation dans des modèles murins de maladies neuro-dégénératives du cervelet. Les tests biochimiques et comportementaux combinés sont des méthodes multiples pour déterminer l&#39;étendue de la contribution mitochondrial à cérébelleux pathologie de la maladie neurodégénérative. En traitant des souris avec de l&#39;acide succinique pour stimuler le métaboli...

Les mitochondries sont les principaux producteurs de l&#39;adénosine triphosphate (ATP), un coenzyme essentiel pour l&#39;énergie cellulaire, avec la majorité de l&#39;ATP mitochondrial produit par phosphorylation oxydative (OXPHOS) en utilisant la chaîne de transport d&#39;électrons. Le cerveau, compte tenu de ses besoins métaboliques élevés et de sa dépendance à l&#39;égard de la phosphorylation oxydative pour alimenter l&#39;activité neuronale, est très sensible à un dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, un dysfonctionnement mitochondrial est déclenchée au cours du processus de vieillissement, 1 et est impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives , 2, 3, 4. Par conséquent, il en résulte que les mitochondries sont des cibles thérapeutiques intéressantes pour la neurodégénérescence. Dans ce protocole, nous avons adopté l&#39;utilisation de ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) comme une maladie neurodégénérative modèle pour l&#39;étude des mitochondriesl dysfonctionnement et le développement de thérapies ciblées mitochondriales. SCA1 est causée par une mutation polyglutamine (polyQ) d&#39;extension de répétition dans le produit du gène ataxine-1 qui provoque une dégénérescence progressive des neurones de Purkinje du cervelet et les neurones d&#39;autres régions du cerveau. La lignée de souris transgénique utilisé ici (désignée comme la souris SCA1), qui exprime un polyQ mutant ataxine-1 transgène sous le contrôle d&#39;un promoteur spécifique de Purkinje cellules, permet l&#39;analyse ciblée de l&#39;élément de Purkinje cellules de SCA1 5. Les souris subissent SCA1 progressive dégénérescence des cellules de Purkinje et développent une démarche ataxique 6. dysfonction mitochondriale et complexe mitochondrial ciblé l&#39;efficacité du traitement peuvent être évalués avec une batterie de tests moléculaires et comportementales. Dysfonction mitochondriale complexe est mesurée ex vivo par des tests de respiration qui détectent la consommation altérée d&#39;oxygène dans les tissus cérébelleusela présence de substrats et inhibiteurs 7 de la chaîne de transport d&#39;électrons. Des dosages de respiration ont déjà été utilisés avec des tissus perméabilisées, les isolats mitochondriaux et les tissus ensemble 7, 8, 9. Ils permettent une évaluation directe de la fonction mitochondriale contrairement aux méthodes de collecte de données morphologiques telles que la microscopie électronique à transmission ou immunofluorescence. L&#39;utilisation de tissu entier plutôt que des mitochondries isolées empêche une sélection biaisée des mitochondries saines qui peuvent survenir au cours du processus d&#39;isolement 7. Lorsque adaptée au protocole comme indiqué, le dosage de la respiration est une méthode utile pour détecter un dysfonctionnement mitochondrial dans les états pathologiques neurodégénératifs cérébelleux. Des activateurs non spécifiques du métabolisme peuvent être utilisées pour déduire la dysfonction mitochondriale dans les modèles de souris transgéniques de diseas neurodégénérativese et de l&#39;aide à la mise au point de nouvelles thérapies. La quercétine, et de la créatine Coenzyme Q10 ont tous été montré pour améliorer la pathologie de la maladie neuro - dégénérative chez les patients et dans des modèles animaux de maladies neuro - dégénératives 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Nous présentons ici un activateur métabolique roman, l&#39;acide succinique, pour stimuler le métabolisme et stimuler la fonction mitochondriale dans les maladies neurodégénératives. Faire en sorte que l&#39;activateur est de traverser la barrière hémato - encéphalique, la HPLC a été utilisée pour détecter la délivrance d&#39; un tissu neural chez les souris traitées 17. Pour évaluer les effets thérapeutiques des composés solubles dans l&#39;eau métaboliquement ciblés tels que l&#39;acide succinique, une batterie de paradigmes comportementaux et des études immuno-pathologiques peuvent être utilisés. due aux déficits de la coordination motrice trouvées dans les maladies neuro - dégénératives cérébelleuse, le dosage de la piste de l&#39; empreinte, un dosage de faisceau et l&#39; accélération de dosage de tige de rotation sont utilisés pour détecter le comportement de secours de la pathologie 6, 18, 19. Ces mesures sont complétées par une évaluation de immunopathologique cytoarchitecture cérébelleuse , en évaluant l&#39; épaisseur de la couche moléculaire (définie comme étant la cellule de Purkinje dendritique longueur de l&#39; arbre) et les comptages de Purkinje soma des cellules dans un tissu de lobule défini cérébelleuse 6, 20, 21. Nous présentons ici des méthodes neuropathologiques et comportementales multiples pour la détection et le traitement de la dysfonction mitochondriale avec des composés solubles dans l&#39;eau métaboliquement ciblée. Nous utilisons une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale pour analyser un dysfonctionnement mitochondrial dans la tran SCA1souris sgenic. En outre, nous montrons que les symptômes de la maladie et de la pathologie sont améliorées par l&#39;acide mitochondriale rappel succinique soluble dans l&#39;eau, ce qui implique en outre la dysfonction mitochondriale dans progression de la maladie SCA1.

<table><tbody><tr><td>Adénosine diphosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phénylindole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>Malate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Lactobionate de potassium</td><td>Sucres Bio</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>Roténone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Acide Succinique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime ;,N&prime ; -Tétraméthyl-p-phénylènediamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ anticorps (anti-ataxine-1 )</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID : 7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorps secondaire anti-souris</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorps secondaire anti-lapin</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Calbindin (chèvre)</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris transgéniques de contrôle</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID : 9217978</td></tr><tr><td>souris SCA1</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID : 9217978</td></tr><tr><td>Souris de type sauvage</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L microtome</td><td>ERMA</td><td></td><td>Microtome Sledge</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de glycérol-gélatine</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 Oxytherm Électrode Control Unit</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P.T.F.E. papier</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion Rotarod</td><td>PPP& G</td><td></td><td>contacter l’auteur correspondant pour plus d’informations</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Cell counter plugin (pour ImageJ)</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (logiciel rotarod)</td><td>PPP& G</td><td></td><td>contacter l’auteur correspondant pour plus d’informations</td></tr><tr><td>Phidget21.dll (requis pour le logiciel rotarod)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

traiter souris sca1 avec hydrosolubles composés à non-spécifiquement boost fonction mitochondriale

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

Le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle important dans le processus de vieillissement et dans les maladies neurodégénératives, y compris plusieurs ataxie spinocérébelleuse héréditaires et d&#39;autres troubles du mouvement marqué par une dégénérescence progressive du cervelet. L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;évaluer la dysfonction mitochondriale dans ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et évaluer l&#39;efficacité du ciblage pharmacologique de la respiration métabolique via le composé acide succinique soluble dans l&#39;eau pour ralentir la progression de la maladie. Cette méthode est applicable à d&#39;autres maladies cérébelleux et peut être adaptée à un grand nombre de thérapies solubles dans l&#39;eau. Une analyse ex vivo de la respiration mitochondriale est utilisée pour détecter et quantifier les changements liés à la maladie de la fonction mitochondriale. Avec des preuves génétiques (données non publiées) et des preuves protéomique de la dysfonction mitochondriale dans le modèle SCA1 de la souris, nous évaluons l&#39;efficacité du traitement avec le rappel métabolique s soluble dans l&#39;eaul&#39;acide uccinic en dissolvant ce composé directement dans l&#39;eau potable à la maison de la cage. La capacité du médicament à traverser la barrière sang-cerveau peut être déduit en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L&#39;efficacité de ces composés peut ensuite être testé à l&#39;aide de multiples paradigmes comportementaux, y compris le Rotarod accélération, test de poutre d&#39;équilibre et de l&#39;analyse de l&#39;empreinte. l&#39;intégrité cytoarchitecturales du cervelet peut être évaluée en utilisant des tests d&#39;immunofluorescence qui détectent Purkinje noyaux cellulaires et les dendrites des cellules de Purkinje et soma. Ces méthodes sont des techniques fiables pour la détermination de la dysfonction mitochondriale et l&#39;efficacité du traitement avec des composés solubles dans l&#39;eau dans les maladies neurodégénératives cérébelleuse.

Par le ciblage pharmacologique des mitochondries cérébelleux avec de l'acide succinique, nous sommes en mesure d'empêcher un dysfonctionnement mitochondrial dans un modèle de souris de la maladie neuro-dégénérative SCA1 de cérébelleuse. Le donneur d'électrons canonique de la succinate déshydrogénase, acide succinique, a été dissous dans de l' eau potable à la maison de la cage de souris SCA1 pendant un mois, l'évaluation comportementale début au cours de la deuxième semaine de traitement...

Nous présentons un protocole biochimique et comportemental pour évaluer l’efficacité de composés hydrosolubles ciblant les mitochondries pour le traitement de l’ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et d’autres maladies neurodégénératives cérébelleuses.

Traiter Souris SCA1 avec hydrosolubles composés à non-Spécifiquement Boost Fonction mitochondriale

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

L’objectif global de cette expérience est d’observer et de quantifier les effets thérapeutiques des activateurs mitochondriaux solubles dans l’eau sur le comportement et les tissus cérébelleux chez les souris atteintes d’ataxie cérébelleuse spinale de type 1. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’ataxie cérébelleuse spinale, telles que les déficits mitochondriaux contribuent-ils à la pathologie de la maladie et la maladie pourrait-elle être entravée par un activateur mitochondrial soluble dans l’eau. Le principal avantage de cette technique est que l’acide succinique est un composé hydrosoluble peu coûteux approuvé par la FDA qui peut être délivré directement dans le cerveau via l’eau de boisson.Les implications de cette technique peuvent s’étendre à une thérapie d’autres maladies neurodégénératives, car des déficits en complexes de phosphorylation oxydative mitochondriale sont trouvés dans plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer et la maladie de Huntington. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à mettre en place les paradigmes comportementaux qui devront peut-être être ajustés afin d’obtenir des résultats cohérents. La démonstration visuelle de cette méthode est bénéfique car les étapes comportementales peuvent être difficiles à reproduire à partir d’une section de méthode écrite, mais sont faciles à reproduire à l’aide d’un enregistrement visuel.Pour commencer cette procédure, réglez la piste à un léger angle vers le haut vers la loge d’attache, bordée de litière et de nourriture de récompense. Alignez ensuite une feuille de papier blanc sur la piste. Laissez la souris s’acclimater à la boîte d’accueil pendant cinq minutes.Ensuite, choisissez un seul sujet et peignez les pattes arrière gauche et droite avec de la peinture à base d’eau non toxique bleue et rouge respectivement. Ensuite, placez le sujet au début de la piste et laissez-le marcher jusqu’à la boîte d’accueil. Une fois que le sujet a atteint la boîte d’accueil, fermez la trappe et laissez-le rester dans la boîte d’accueil pendant une minute avant de retourner dans la cage d’accueil respective.Nettoyez ensuite la piste et la boîte d’accueil avec de l’éthanol à 30 % et remplacez la litière, la nourriture de récompense et le papier de piste pour le prochain essai. En même temps, récupérez le papier de piste après l’expérience et inspectez l’essai. Un essai d’empreinte réussi est défini comme un minimum de cinq empreintes séquentielles dans lesquelles le sujet se dirige vers la boîte dorée sans se retourner ni s’arrêter.Configurez maintenant l’appareil de faisceau selon les spécifications de la croix de barre avec six poutres différentes. À une extrémité de la poutre se trouvait une boîte sombre avec de la nourriture de récompense. Pour entraîner les sujets sur le faisceau, assemblez l’appareil avec le faisceau trois.Placez délicatement le sujet à l’extrémité de la poutre opposée à la boîte d’accueil. Et permettez-lui de traverser le faisceau. Permettez à chaque sujet jusqu’à trois essais de deux minutes pour réussir votre course.Ce qui est défini comme traverser le faisceau et entrer dans la boîte d’accueil en deux minutes. Le quatrième jour de l’entraînement à la poutre, assemblez l’appareil avec la poutre un. Et configurez la boîte de maison.Placez une caméra vidéo devant l’appareil et vérifiez que l’appareil peut être clairement capturé sur vidéo. Laissez la souris parcourir le faisceau, en enregistrant sur vidéo chaque essai et en enregistrant le nombre d’essais réussis par sujet et par faisceau. Dans cette étape, acclimatez les sujets à leur réservoir de couloir pendant 10 minutes avant le début de l’essai.Pendant cette période d’acclimatation, préparez l’appareil rotatif en nettoyant chaque voie de l’appareil avec 30 % d’éthanol. Ensuite, ouvrez le logiciel rotarod. Réglez les paramètres de démarrage sur quatre tr/min, les paramètres d’accélération sur cinq minutes et les réglages de vitesse finale sur 40 tr/min pour fournir une accélération constante de quatre à 40 tr/min sur une période de cinq minutes.Après la période d’acclimatation, placez les sujets sur le rotarod dans leurs couloirs respectifs pendant que la tige tourne à quatre tr/min. Une fois que tous les sujets sont dans leurs couloirs respectifs, commencez le premier essai. Enregistrez la latence à diminuer à l’aide du logiciel de l’instrument.Une minuterie secondaire peut être utilisée comme sauvegarde. Une fois l’essai terminé, laissez chaque sujet se reposer dans ses réservoirs respectifs pendant 10 minutes avant le prochain essai pour éviter la fatigue. Dans cette procédure, fixez le tube du boîtier de contrôle de la température d’un microtome de traîneau de la scène à un robinet d’évier.Utilisez le boîtier de contrôle de la température pour refroidir l’étage du microtome à 28 degrés Celsius. Réglez ensuite le cadran d’épaisseur de sectionnement sur 50 micromètres. Ensuite, tamponnez une portion de la taille d’un centime de solution OTC sur la scène.Avant que l’OTC ne gèle, utilisez une pince pour positionner l’hémisphère de sorte que la surface de coupe sagittale moyenne soit face vers le bas sur la couche OTC. Orientez rapidement et doucement le tissu de manière à ce que l’extrémité latérale de l’hémisphère pointe vers la lame. Supérieur à la scène.En travaillant par couches, ajoutez de l’OTC supplémentaire autour du tissu et laissez l’OTC geler complètement avant d’ajouter la couche suivante. Ajoutez ensuite une fine couche d’OTC sur le tissu et congelez-le. Ensuite, sectionnez le tissu avec un poids corporel égal réparti sur la lame de coupe.Collectez les sections à l’aide d’un pinceau d’artiste fin. Et placez-les dans une plaque de puits étiquetée de manière appropriée contenant un XPBS. Entre les sections, réinitialisez l’épaisseur de coupe à 50 micromètres si nécessaire.Après la section, remplacez le PBS dans chaque puits de la plaque par une solution d’urée. Et placez l’assiette sur de la glace. Lorsque vous êtes prêt, transférez la plaque dans un bloc chauffant réglé à la température d’ébullition pour faire bouillir les sections dans une solution d’urée afin de démasquer les épitopes pour l’immunomarquage.Entre chaque étape d’ébullition, refroidissez l’assiette contenant les sections de tissu sur de la glace. Après ébullition, lavez les sections trois fois, en remplaçant la solution actuelle par un XPBS et en agitant les sections pendant 10 minutes. Bloquez ensuite les sections avec une solution de sérum d’ânesse en les incubant dans du sérum pendant une heure avec une légère agitation à température ambiante.Les sections peuvent maintenant être teintées. Une fois étiquetés, montez les sections sur des lames recouvertes de gélatine à 2 % avec un support de montage pour réduire le photo-blanchiment. Couvrez et séchez pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Scellez ensuite les lamelles avec du vernis à ongles et conservez-les à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un microscope confocal à balayage, localisez la fissure primaire du cervelet sous la lumière du champ vif. L’étape la plus critique du dosage des acides aminés consiste à localiser avec précision le tissu cérébelleux dans les modules cinq et six A qui flanquent la fissure primaire.L’analyse des modèles de coloration et des lobules incohérents garantira la variabilité de votre résultat. Avec un objectif 10X, scannez et excitez séquentiellement les canaux DAPI, Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 594. En utilisant respectivement un laser à diode de 405 nanomètres, un laser à gaz argon de 488 nanomètres et un laser à diode de 559 nanomètres, en conjonction avec un séparateur de faisceau dichroïque DM 488559 nanomètre.Ensuite, séparez et collectez la lumière émise à l’aide de séparateurs de faisceau SDM 490 et SDM 560 et d’un filtre passe-bande BA 575675 respectivement. L’acide succinique a été dissous dans l’eau potable de la cage domestique de souris SCA1 pendant quatre semaines à partir de l’âge de 17 semaines. Les souris SCA1 commencent à présenter le phénotype de l’ataxie à l’âge de cinq semaines.Des évaluations comportementales ont été effectuées pendant la période de traitement comme suit. Analyse de l’empreinte au cours de la semaine 17. Dosage par faisceau au cours de la semaine 18 et accélération de la rotation au cours de la semaine 19.À l’âge de 20 semaines, des souris ont été sacrifiées et du tissu cérébelleux a été prélevé pour des tests d’anatomopathologie, des tests HPLC et des tests respiratoires. Voici les données représentatives de l’analyse de l’empreinte montrant une porte de type sauvage traitée par véhicule, une porte SCA1 traitée par véhicule et une porte SCA1 traitée à l’acide succinique. Ici, les données d’analyse des faisceaux montrent l’amélioration des performances du faisceau des souris SCA1 avec un traitement à l’acide succinique.Le traitement à l’acide succinique améliore considérablement les performances d’accélération de la rotation des souris SCA1, comme le montre l’augmentation de la latence à la chute. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler d’appliquer la technique de manière cohérente à chaque sujet au cours de plusieurs essais. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la respiration mitochondriale peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la respiration par des complexes de phosphorylation oxydative individuels améliorés après l’administration d’acide succinique.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des tests comportementaux et neuropathologiques. Qui évaluent l’amélioration du comportement cérébelleux et de la cytoarchitecture.

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