Préparation de cultures Rat oligodendrocytes progénitrices et la quantification des oligodendrogenèse par analyse de fluorescence à double infrarouge

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des cellules progénitrices d’oligodendrocytes de rat et de quantifier l’oligodendrogenèse en réponse à des facteurs expérimentaux. L’oligodendrogenèse efficace est l’objectif thérapeutique dans de nombreux domaines de recherche, notamment les lésions de la moelle épinière, l’hypoxie néonatale et les maladies démyélinisantes telles que la myélite transverse et la sclérose en plaques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine un protocole pour l’isolement d’un grand nombre d’OPC avec une méthode rapide et fiable pour déterminer l’oligodendrogenèse dans plusieurs conditions expérimentales simultanément.

Pour commencer cette procédure, stérilisez tout le matériel de dissection à l’aide d’un stérilisateur à billes chauffées. Ensuite, ajoutez 15 à 20 millilitres de PBS dans un tube conique de 50 millilitres. Placez le tube conique sur de la glace et utilisez-le pour maintenir le tissu du cortex coupé en dés pendant la dissection.

Ensuite, ajoutez du PBS froid dans une boîte de Pétri de 10 centimètres qui sera utilisée pour la dissection au microscope optique. Après avoir sacrifié les rats, coupez la peau derrière les oreilles le long de la ligne médiane à l’aide de petits ciseaux. Et décollez les rabats de peau.

Ensuite, coupez le crâne le long de la ligne médiane du tronc cérébral aux yeux. Et attention à ne pas couper trop profondément afin de préserver la structure du cortex sous-jacent. Après cela, faites deux incisions latérales inférieures au cervelet en insérant de petits ciseaux chirurgicaux dans le foramen magnum.

Faites une incision supplémentaire entre les yeux en avant des bulbes olfactifs. Pelez soigneusement chaque moitié du crâne. Retirez tout le cerveau et placez-le dans une boîte de Pétri de 10 centimètres remplie de PBS froid.

Sous un microscope optique de dissection, retirez les bulbes olfactifs et le cervelet à l’aide d’une pince chirurgicale fine. Retournez le cerveau de manière à ce que la surface ventrale soit visible. Ensuite, à l’aide d’une pince fine et droite, effectuez une dissection contondante en plaçant les pointes fermées de la pince entre le cortex et l’hypothalamus à une profondeur d’environ les deux tiers du cerveau.

Ouvrez les pinces une fois qu’elles sont en place, puis répétez la procédure pour l’autre hémisphère. Après cela, taquinez le cortex des régions de l’hypothalamus et du mésencéphale. Retirez l’hypothalamus, le thalamus et le mésencéphale en tenant le mésencéphale à sa surface postérieure et en le décollant vers l’extrémité antérieure du cerveau.

Par la suite, sectionnez les connexions antérieures. À l’aide d’une pince à dissection fine et courbée, retirez l’hippocampe et coupez sa connexion avec le cortex. Ensuite, retirez le striatum restant en le grattant du cortex sous-jacent dans un mouvement diagonal vers l’extérieur.

Dégagez les vaisseaux sanguins et les méninges de la surface ventrale du cortex. Ensuite, retournez le cerveau pour que la surface dorsale soit visible. Pelez les méninges du cortex sous-jacent où se trouve le bulbe olfactif.

Répétez les procédures pour un total de trois à quatre rateaux. Et placez tous les cortex disséqués dans une boîte de Pétri. Hachez-les avec une lame de rasoir stérilisée jusqu’à l’obtention de morceaux d’un millimètre sur un millimètre.

Récupérez ensuite les mouchoirs en rinçant le plat avec du PBS avant de le remettre sur de la glace. Maintenant, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre fixée à un contrôleur de pipette, dissociez mécaniquement le tissu en pipetant dix à quinze fois ou jusqu’à ce que les morceaux de tissu soient réduits en taille et que la solution soit devenue trouble. Ensuite, remettez l’échantillon dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes avec une rotation continue.

Après cela, ajoutez 10 millilitres de PBS à chaque échantillon et filtrez l’homogénat à travers un filtre à pores de 40 micromètres placé sur un tube de 50 millilitres. Ensuite, rincez le filtre avec un à deux millilitres supplémentaires de PBS. Regroupez tous les échantillons d’homogénat dans un tube conique de 50 millilitres et obtenez un nombre global de cellules.

Après avoir effectué le comptage cellulaire, divisez l’homogénat uniformément dans les tubes coniques de 15 millilitres et centrifugez-les pendant 10 à 12 minutes à 300 g. Amorcez chaque colonne LS en ajoutant cinq millilitres de tampon de colonne. Et collectez le débit à travers un tube conique de 15 millilitres.

Une fois que le tampon de colonne a complètement traversé la chambre supérieure, appliquez 1000 microlitres de suspension cellulaire sur chaque colonne et laissez les cellules passer à travers par gravité. Ensuite, retirez chaque colonne et placez-la dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez cinq millilitres de tampon de colonne et plongez le tampon à travers la colonne à un rythme rapide pour déloger les cellules liées et les libérer de la colonne.

Pour plaquer les cellules, diluez-les avec un milieu de prolifération OPC à 60 000 cellules par millilitre. Pipetez 500 microlitres de cellules sur le côté de chaque puits inférieur noir et clair d’une plaque de 24 puits. Mélangez les cellules en secouant la plaque horizontalement, en utilisant un mouvement en huit.

Dans cette procédure, placez une pointe de pipette de 200 microlitres sur une pipette Pasteur en verre pour vous assurer que le puits n’est pas endommagé lors de l’aspiration. Ensuite, aspirez le milieu des puits de culture un groupe de traitement à la fois pour éviter de dessécher les cellules. Après cela, ajoutez lentement 500 microlitres de mélange principal de traitement le long du côté du puits à l’aide d’une pipette d’un millilitre.

Incuber les cultures et effectuer un échange complet de milieux avec des milieux de traitement frais tous les deux à trois jours. À la fin de la période de traitement souhaitée, aspirez le média. Ajoutez lentement 400 microlitres de PFA sur le côté du puits pour fixer les cellules.

Et incubez la plaque pendant 20 minutes à température ambiante. Après 20 minutes, aspirez le PFA et ajoutez lentement 500 microlitres de D-PBS stérile pour laver les cellules. Répétez le lavage deux fois de plus et n’aspirez pas le lavage final.

Maintenant, amenez la plaque à température ambiante, aspirez les puits et ajoutez 250 microlitres de D-PBS contenant 5 % de NGS et 0,1 % de Triton x-100. Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure en secouant doucement l’orbite. Préparez la solution d’incubation primaire en diluant l’anticorps monoclonal anti-MBP de souris et l’anticorps polyclonal anti-olig2 de lapin dans du D-PBS contenant cinq pour cent de NGS.

Ensuite, incubez les anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant une nuit pendant 16 à 18 heures avec une légère agitation orbitale. Pendant le lavage de la plaque, préparez la solution d’incubation secondaire en diluant les anticorps anti-souris 680 et anti-lapin 800 dans du D-PBS contenant cinq pour cent de NGS. Ensuite, aspirez le lavage final et ajoutez 250 microlitres de solution d’incubation secondaire.

Protégez la plaque de la lumière et incubez-la à température ambiante pendant une heure en secouant doucement l’orbite. Ensuite, scannez la plaque à l’aide d’un système d’imagerie capable de détecter des émissions de fluorescence de 700 nanomètres et 800 nanomètres. Comme point de départ, réglez le décalage focal sur trois et les sensibilités sur un point cinq pour le MBP, cinq point zéro pour l’actine et trois point cinq pour olig2.

Ajustez les valeurs de sensibilité si nécessaire pour éviter une surexposition du signal. Dans ce schéma, le test DIFS commence avec des OPC de rat positifs A2B5 fraîchement isolés placés sur des récipients de culture codés PLL. Ces cultures prolifèrent pendant trois jours en présence de 20 nanogrammes par millilitre de PDGFAA, puis sont traitées avec des facteurs expérimentaux dans des milieux frais sans PDGF le jour zéro.

Les milieux de traitement sont entièrement réapprovisionnés le deuxième jour. Et les cellules sont fixées avec 4 % de paraformaldéhyde le quatrième jour. Ici, l’immunocytochimie d’olig2 et de MBP a été réalisée sur les cultures représentatives au jour zéro et au jour quatre en utilisant Dapi comme contre-coloration nucléaire.

Ces cultures présentent une coloration constitutive pour le marqueur cellulaire de la lignée pan-oligodendrocytaire, Olig2, aux jours zéro et quatre. Alors que la coloration pour le marqueur d’oligodendrocytes matures MBP n’était évidente qu’au quatrième jour. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier, de cultiver et de différencier les OPC de rat positifs A2B5 afin de quantifier l’effet des facteurs expérimentaux sur l’oligodendrogenèse.

L’identification des facteurs qui favorisent l’oligodenrogenèse est particulièrement pertinente pour l’étude des maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques. Une fois maîtrisées, les techniques décrites ici peuvent aider à identifier ces facteurs et, en fin de compte, à développer de meilleures thérapies.