Name: Isolement de CD146 + Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Découvrez l'isolement de cellules stromales mésenchymateuses CD146+ résidentes pulmonaires chez le rat par digestion enzymatique, séparation par gradient de densité et tri magnétique. Cette méthode rapide et reproductible permet d'étudier la réparation tissulaire et la modulation immunitaire.

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JJPC est soutenu par une bourse postdoctorale des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). MAM reçoit une bourse d’excellence de la Fondation académique nationale allemande - Studienstiftung des Deutschen Volkes et est soutenu par une bourse de l’EFCNI (Fondation européenne pour la prise en charge du nouveau-né). BT est soutenu par les IRSC, l’Association pulmonaire du Canada, le Réseau de cellules souches et l’Institut de recherche du Centre hospitalier pour enfants de l’est de l’Ontario.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l&#39;Université d&#39;Ottawa (protocole d&#39;éthique animale IRHO-1696). soins aux animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles. 1. Isolement des cellules mésenchymateuses du poumon stromales <ol><li> Préparer le mélange d&#39;enzymes dans un tube de 50 ml: peser 30 U protéase neutre, 2500 U collagénase I et 500 U DNAse I. Ces montants suffisent pour les poumons d&#39;une souris adulte ou chiot de rat. Préparer le jour de l&#39;isolement et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> chiots sacrifice de rat à 13 jours par une injection intra-péritonéale de pentobarbital sodique (0,2 ml, 65 mg / ml). Utilisez le pincement de l&#39;orteil réflexe d&#39;établir une perte de conscience. La mort de l&#39;animal est assurée par l&#39;ouverture de la poitrine, comme il est indiqué ci-dessous. </li><li> Désinfectez la peau par pulvérisation de l&#39;animal avec 70% d&#39;éthanol et ouvrir avec précaution la cage thoracique à l&#39;aide des ciseaux chirurgicaux, à partir de la membrane et la coupe vers le côté rostral, étant très attention à ne pasendommager les poumons. Étaler la cage thoracique ouverte à l&#39;aide des pinces hémostatiques, ou encore couper la cage thoracique pour fournir un accès au niveau du thorax. </li><li> Exsangue l&#39;animal en retirant le cœur. Pour retirer le coeur, saisir le thymus et le cœur avec de petites pinces et couper ceux-ci avec des ciseaux chirurgicaux. Immédiatement après, absorber le sang avec une gaze jusqu&#39;à ce que plus de sang qui sort de l&#39;aorte et l&#39;artère pulmonaire coupée. </li><li> Retirez les poumons du thorax comme suit: maintenir la trachée avec une petite pince, puis couper la trachée avec des ciseaux chirurgicaux sur le côté rostral. Tout en tirant doucement l&#39;ensemble du poumon sur le thorax, avec arrachement tout tissu conjonctif sur la face dorsale le long de la cage thoracique afin de libérer les poumons. </li><li> Rompre les poumons de l&#39;aorte et de l&#39;oesophage en coupant le long de la membrane avec des ciseaux chirurgicaux. Maintenant que les poumons sont complètement libres du thorax enlever tout sang restant doucement avec une gaze. </li><li> Retirez la trachée et des bronches avec surciseaux giques et transférer soigneusement les lobes pulmonaires dans un tube de 50 ml contenant froid 35 ml de 30% de citrate-phosphate-dextrose adenine (CPDA-1) anticoagulant (26,30 g de citrate trisodique dihydraté, de l&#39;acide ascorbique 3,27 g monohydraté, 2,22 g de phosphate monosodique de dihydrogène, 31,80 g de D-glucose, 0,275 g d&#39;adénine à 1 l H 2 O purifié, filtre la solution stérile en utilisant un filtre de 0,22 um avant utilisation de membrane) dans un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer le sang et les débris. </li><li> Après un rinçage de 5 minutes dans 30% CPDA-1 / PBS, transférer le poumon à un nouveau tube de 50 ml contenant 35 ml de phosphate stérile de solution saline tamponnée (PBS) (RT), inverser doucement pour enlever le citrate. Transférer dans un tube contenant 35 ml de PBS + Sodium pyruvate de Dulbecco + glucose (DPBS ++) (RT). Chaque étape de rinçage devrait prendre environ 5 min. Remarque: DPBS ++ peut être commandé dans le commerce ou constitué comme suit 21: chlorure de calcium dihydraté 132,4 mg, du chlorure de magnésium hexahydraté 100 mg, du chlorure de potassium (anhydre) 200 mg, le phosphate de potassium monobasique (anhydre) 200 mg de chlorure de sodium (anhydre) 8000 mg, de phosphate de sodium dibasique (anhydre) 1,144.5 mg, D-glucose 1000 mg, de pyruvate de sodium 36 mg dans 1 L H purifié 2 O, à pH 7,3. filtrer de manière stérile la solution en utilisant un filtre à membrane de 0,22 pm avant utilisation. </li><li> Dissoudre le mélange enzymatique en ajoutant 10 ml de DPBS ++ (préchauffée à 37 ° C) et retournant doucement jusqu&#39;à dissolution. </li><li> Transférer les poumons à un nouveau tube de 50 ml et hachez le poumon sur la paroi du tube à l&#39;aide d&#39;un scalpel jusqu&#39;à ce que finement haché. Ajouter le mélange de l&#39;enzyme aux tissus (10 ml de mélange enzyme / par souris adulte / rat chiot poumon), fermer hermétiquement le tube et incuber à 38 ° C sous agitation douce (soit dans un mélangeur thermique, un bain d&#39;eau agité, ou une eau salle de bain avec une agitation manuelle régulière). La durée dépend du type de tissu: tissu foetal 60 min, juvénile / adulte tissu de 90 à 120 min, un tissu adulte fibrotique 120-150 min. </li><li> Arrêter la digestion par chélation des cations bivalents wième 200 ul d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. filtrant stérile la solution en utilisant un filtre à membrane de 0,22 pm avant utilisation). </li><li> Ajouter sérum bovin 20 ml 5% fœtal (FBS) / PBS et passer la totalité de la suspension à 100 um filtre cellulaire dans un nouveau tube de 50 ml. Rincer le tube et le tamis cellulaire avec 10 ml de 5% de FBS / PBS, ce qui porte le volume total à 40 ml. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 500 g, RT. </li><li> Eliminer le surnageant (culot doit être clairement visible), remettre en suspension dans 40 ml 5% de FBS / PBS et répéter centrifugation étape 1.13. </li><li> Remettre en suspension dans 4 ml de 5% de FBS / PBS (RT) et la couche soigneusement sur ​​3 ml de milieu de gradient de densité (1,073 g / cm 3) dans un tube de 15 ml 14. Pour obtenir une bonne interphase, il est crucial que la superposition de la suspension cellulaire unique est à un angle&gt; 45 ° à très basse vitesse. </li><li> Centrifugeuse 20 min à 900 xg, moyenne (5/10) accélération, aucune décélération, 19 ° C. </li><li> Recueillir les cellules présentes dans l&#39;enterphase et les remettre en suspension dans 10 ml de PBS stérile. </li><li> Centrifugeuse pendant 5 min à 500 g, 21 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml pré réchauffé milieu complété de culture L-MSC (médias essentiel minimum d&#39;Eagle, la modification alpha (aMEM), additionné de 2 mmol L-glutamine par 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS et 1% en volume / volume de pénicilline / streptomycine / amphotéricine B. </li><li> étape de centrifugation Répétez 1.18. Par la suite, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de milieu préchauffé culture frais. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé et la plaque à une densité élevée, puisque la majorité des cellules à ce stade ne sont pas adhérentes plastique. La densité de placage exacte dépend de l&#39;espèce animale et l&#39;âge, par exemple, les cellules d&#39;un poumon de souris adulte sont ensemencées à 10 5 cellules / cm 2, alors que les cellules de poumon de raton sont suffisamment dense à une densité de semis de 1-2 x 10 4 cellules / cm 2 </sup&gt;. Utiliser 0,2 ml L-MSC milieu de culture / cm 2. </li><li> Culture L-MSC dans une humidifié à 5% O 2, 5% de CO 2 atmosphère à 37 ° C. </li><li> Changer le milieu 24 heures après l&#39;ensemencement initial, et ensuite tous les 3 jours après le rinçage une fois avec PBS. Les cellules doivent être mises en culture jusqu&#39;à confluence de 80 à 90%, ce qui prend en moyenne 3-5 jours en fonction de l&#39;animal d&#39;origine. confluent supérieur va favoriser la différenciation dans les fibroblastes. </li></ol> 2. Sélection des cellules CD146 + Lung mésenchymateuses stromales <ol><li> Revêtement de billes magnétiques avec anticorps secondaire <ol><li> Enrober les billes magnétiques avec un anticorps secondaire biotinylé, selon un rapport de 10 pg d&#39;anticorps secondaire / 100 ul de perles magnétiques dans un fond rond stérile 2 ml cryovial dans des conditions stériles. En utilisant un anticorps secondaire de 10 ul par attendues 0,5 x 10 6 cellules, et en utilisant un minimum de 100 ul de billes magnétiques et 10 pg d&#39;anticorps. Remarque: Le rapport d&#39;unetibodies utilisés par volume de perles peuvent différer entre les fabricants, s&#39;il vous plaît consulter les instructions du fabricant pour les perles de choix. Pour ce protocole, s&#39;il vous plaît se référer au tableau 1 pour les perles et les anticorps qui ont été utilisés dans l&#39;optimisation de ce protocole. </li><li> Incuber dans un mélangeur rotatif d&#39;échantillon pendant 30 minutes à 30 tours / min (rpm) à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les billes dans 1,5 ml stérile 0,1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) / PBS et transférer dans un tube de 3 ml ronde inférieure (cytométrie en flux tube). Rincer le tube cryogénique avec un supplément de 1,5 ml 0,1% de BSA / PBS et transférer sur le tube de 3 ml. </li><li> Placer le tube sur un aimant approprié et attendre 2 min jusqu&#39;à ce que tous les cordons sont fixés à la paroi arrière du tube et la solution reste limpide. Retirer le ruissellement et répétez lavage avec 3 ml de 0,1% BSA / PBS deux fois. </li><li> Remettre en suspension les perles dans 3 ml de 0,1% BSA / PBS et conserver à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière. Utiliser dans les 5 jours. </li></ol></li><li> Etiquetage CD146 + L-MSC<ol><li> Récolter les cellules mésenchymateuses après rinçage avec du PBS en utilisant une solution de trypsine non-doux. Remarque: Les volumes dépendent de la taille de flacon de culture (0,2 ml / cm 2 ou milieu PBS). <ol><li> Éliminer le milieu de culture et rincer les cellules trois fois avec du PBS stérile. </li><li> Ajouter le volume approprié de solution non-trypsine douce (voir tableau 1). Incuber à 37 ° C dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que les cellules sont détachés, soit environ 10 min pour l&#39;utilisation de la solution dans le tableau 1. </li><li> Inactiver l&#39;enzyme par addition de milieu de culture L-MSC, et centrifuger pendant 5 min à 500 x g. </li></ol></li><li> Retirer le surnageant, remettre les cellules dans 0,1% de BSA / PBS et on compte les cellules avec un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé. Remarque: Le volume de 0,1% de BSA / PBS dépend de la taille du flacon de culture: viser 5 ou 10 ml de 0,1% de BSA / PBS. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.2.2 et remettre le montant dédié de cellules dans 3 ml de 0,1% BSA / PBS (blocs de l&#39;ONUsites de liaison spécifiques et maintient les cellules vivantes). Gardez les cellules sur de la glace. </li><li> Préparer un 3 ml rondes tube inférieur avec l&#39;anticorps anti-CD146 primaire, et garder sur la glace. Remarque: La concentration de l&#39;anticorps primaire, qui est ajouté au montant dédié de cellules dépend de l&#39;anticorps utilisé. Pour un anticorps CD146 anti-rat suggéré voir le tableau 1. </li><li> Ajouter le volume total de cellules provenant de l&#39;étape 2.2.3 au tube avec l&#39;anticorps primaire. Fermer hermétiquement et incuber 30 min sur un mélangeur d&#39;échantillon tournant à 15 tours par minute, 4 ° C. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g, 4 ° C, éliminer le surnageant et remettre en suspension culot cellulaire dans 3 ml de 0,1% de BSA / PBS. étape de centrifugeuse répétition. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans la solution 3 ml contenant des billes recouvertes d&#39;anticorps secondaires qui a été préparé selon les instructions de la section 2.1 et incuber 30 min sur un mélangeur d&#39;échantillon tournant à 15 tours par minute, 4 ° C. </li></ol></li><li> Sélection CD146 + L-MSC<ol><li> Placer le tube contenant le CD146 + L-MSC marqué sur l&#39;aimant. Les cellules positives seront tirés à l&#39;arrière du tube. Sans bouger le tube ou en touchant les billes, la récolte du surnageant des cellules négatives lentement avec une pipette Pasteur stérile (ceux-ci peuvent être soit recueillis ou rejetées sur la base de la conception expérimentale). </li><li> Retirer le tube de l&#39;aimant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml 3% de BSA / PBS. Répétez la procédure de sélection décrite à l&#39;étape 2.3.1. quatre fois (étapes Σ 5 de sélection). </li><li> Reprendre le CD146 + L-MSC en milieu préchauffé culture L-MSC et revenir à l&#39;aimant. </li><li> Retirer le surnageant, remettre en suspension dans L-MSC milieu de culture et la plaque dans un flacon de culture de taille appropriée (0,2 ml / cm 2). En règle générale, les cellules de la plaque dans le même flacon de culture de taille à partir de laquelle les cellules ont été soulevés avant le bourrelet sélection. Le nombre de CD146 + L-MSC, et donc la densité de placage, seradépendre de l&#39;âge, espèce et souche de l&#39;animal d&#39;origine. Toujours viser une densité de placage de ~ 5000 cellules / cm 2. Remarque: Les perles des perturbations de la croissance cellulaire et disparaîtront progressivement que les cellules prolifèrent. </li></ol></li></ol> 3. Les cellules de congélation <ol><li> Utiliser le support gel suivante: une solution de pentastarch à 60% (10% pentastarch à 0,9% de NaCl), 20% de FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% de NaCl (0,9%), 5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) 22. Remarque: Si tous les ingrédients sont disponibles, une solution contenant 5% de DMSO, 30% de FBS et 65% aMEM est une bonne alternative. </li><li> Resuspendre les cellules à 0,5 x 10 6 cellules / ml, l&#39;aliquote en cryotubes de 1 ml chacun et gèlent O / N à -80 ° C en utilisant un récipient de congélation. </li><li> Transférer dans un réservoir de stockage de liquide de l&#39;azote, le lendemain. </li></ol> 4. Les cellules de décongélation <ol><li> Décongeler un flacon de cellules dans un bain-marie à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans 10 mlmilieu de culture préchauffé et centrifuger pendant 5 min à 500 g, 21 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de culture. Cellules de semences dans une culture de cellules de bouchon à évent traités flacons à 5.000 cellules / cm 2 à 0,2 ml / media cm2 (par exemple, 15 ml pour 2 flacon de 75 cm). </li><li> Culture des cellules dans 5% de O 2, 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que 80-90% de confluence pour la récolte et / ou l&#39;utilisation expérimentale. Over-confluence va induire la différenciation. Lorsque les semis, à 5000 cellules / cm 2, L-MSC atteindra 80-90% de confluence dans les 3-4 jours de culture. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;isolement et la culture de la primaire L-MSC présente une occasion de mieux comprendre leur fonction et de leur interaction avec d&#39;autres populations de cellules à un niveau cellulaire, et leur rôle dans le développement des poumons, de la santé et de la maladie. Ceci est particulièrement important que l&#39;absence d&#39;un marqueur unique spécifique de ces cellules, il est presque impossible d&#39;étudier ces cellules in situ. Comme pour toutes les populations de cellules primaires, il faut garder à...

cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de plus en plus reconnus pour leur potentiel thérapeutique dans un large éventail de maladies, y compris les maladies pulmonaires. Outre l&#39;utilisation de l&#39;os MSC de cordon ombilical pour la thérapie cellulaire exogène osseuse et, il est également un intérêt croissant pour la réparation et le potentiel de régénération des cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents. Au cours du développement, y compris dans le poumon, le mésenchyme est une source importante d&#39;indices de développement, et MSC résidents sont un candidat susceptible d&#39;être au centre de cette. De plus, la preuve est en train d&#39;émerger que les CSM résidents sont perturbés dans les maladies adultes, y compris le cancer et la fibrose 1,2 3. Le principal obstacle pour l&#39;étude de ces cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents est l&#39;absence d&#39;un marqueur clair pour l&#39;isolement et l&#39;identification de ces cellules 4. Cellules souches antigène-1 (Sca-1) a été identifié chez la souris en tant que marqueur pour une variété de cellules souches de tissu, et peut être utilisée pour l&#39;isolement de cellules souches mésenchymateuses L-5, mais il a malheureusementpas connu orthologues chez d&#39;autres espèces 6. Les chercheurs ont fait état d&#39;une variété de différentes méthodes d&#39;isolement pour l&#39;isolement de la L-MSC soit de tissu pulmonaire ou fluide. Celles-ci varient de cellules activées par fluorescence (FACS) méthodes basées sur la sélection de CD31 - / CD45 - / CD90 + des cellules 7, CD31 - / CD45 - / épithéliale molécule d&#39;adhésion cellulaire (EpCAM) - / Sca-1 + Cellules 8, multirésistance transporteur ATP binding cassette G (ABCG2) cellules positives 9 ou colorant Hoechst 33342 efflux 10, à l&#39;adhésion et la migration en plastique 11,12 sur tissu haché 13. Les avantages du procédé de ce document sont présentés plusieurs fois. En utilisant une digestion enzymatique doux et gradient de densité 14, on obtient toutes les cellules de la plage de densité qui incluent MSC, mais excluent les cellules épithéliales ou endothéliales. L&#39;étape suivante en plastique d&#39;adhérence assure que seul le mesenchcellules ymal adhérer et de rester dans la culture, ce qui élimine les leucocytes. Mais plus important encore, l&#39;étape de sélection CD146 + permet l&#39;élimination des fibroblastes, car ces cellules n&#39;expriment CD146. Expression de la molécule d&#39;adhésion des cellules CD146 est positivement corrélée avec multipotence, et est donc un bon marqueur pour éliminer les fibroblastes à partir d&#39;une population de cellules mésenchymateuses 15-19. Ceci est un avantage par rapport à l&#39;aide de CD90 en tant que marqueur de sélection, tel qu&#39;il est exprimé non seulement dans le MSC, mais aussi dans lipofibroblasts 5,20. Dans ce protocole, nous avons explicitement choisi une sélection de billes magnétiques, car il est plus doux sur les cellules, et l&#39;ensemble de la procédure peut se faire dans des conditions stériles. Un autre avantage important de ce procédé d&#39;isolement, par opposition à la méthode de l&#39;excroissance, est qu&#39;il est relativement rapide, 6-10 jours par opposition à un mois ou plus pour le procédé de l&#39;excroissance. Trois à cinq jours après l&#39;isolement initial la population mésenchymateuses est prêt pour CD146 + sele<html> ction; après trois à cinq jours, les cellules CD146 + sont prêts à être utilisés pour des expériences ou peuvent être congelés pour une utilisation ultérieure. Diminution du temps de culture améliore la qualité des cellules comme les fibroblastes MSC vers transdifférencier prolongée dans la culture 19 ex vivo. Enfin, en raison de la nature du protocole, il est possible d&#39;appliquer ce procédé à d&#39;autres espèces en choisissant simplement anticorps appropriés, ou même à d&#39;autres systèmes d&#39;organes en réglant le choix des enzymes de digestion et le temps d&#39;incubation. Un protocole détaillé de ce procédé d&#39;isolement est donnée ci-dessous, et une vue d&#39;ensemble schématique de l&#39;isolement et de la sélection ultérieure de la sous-population CD146 + est fourni à la figure 1A et 1B, respectivement. En outre, les détails sont inclus pour des passages, la congélation et la décongélation de ces cellules. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Vue d&#39;ensemble schématique de l&#39;isolement des cellules pulmonaires mésenchymateuses (A) et CD146 + subséquente sélection de cellule (B) min = minutes. EDTA = acide éthylène diamine; 2 e Ab = anticorps secondaire; a-CD146 Ab = anticorps anti-CD146 primaire; ve = cellules CD146 négatives des cellules; + ve cellules positives cellules = CD146. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Protéase neutre</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Préparer le jour de l’isolement et conserver à 4 &deg ; C jusqu’à l’utilisation</td></tr> de <tr><td>la collagénase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Préparer le jour de l’isolement et conserver à 4 &deg ; C jusqu’à l’utilisation</td></tr><tr><td>de DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Préparer le jour de l’isolement et stocker à 4 &deg ; C jusqu’à l’utilisation</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique (euthanyl)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin,</td> <td>Irlande-Utiliser</td> <td>0,2 ml pour les ratons entre 20 et 30 g ; les animaux plus gros peuvent avoir besoin de plus.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Très crucial pour utiliser ce type de D-PBS, car le calcium et le magnésium présents dans ce D-PBS facilitent facilitent la digestion enzymatique</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Média à gradient de densité. Pour obtenir un bon interphase, il est crucial que la stratification de la suspension unicellulaire se produise à une >45&deg ; angle à très basse vitesse, et que la centrifugation ultérieure se fait à 19 °C.</td></tr><tr><td>et alpha ; MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiotique-Antimycotique</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Pénicilline/Streptomycine/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Perles magnétiques</td></tr><tr><td>biotinylées polyclonales lapin-anti-souris</td><td>IgG Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Anticorps secondaire biotinylé qui correspond à l’anticorps anti-rat CD146 décrit ci-dessous</td></tr><tr><td>DynaMag5-magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magnet qui est recommandé pour une utilisation avec Dynabeads. REMARQUE : l’aimant doit être choisi en fonction de la s des perles magnétiques de votre choix.</td></tr><tr><td>TrypLE express&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Alternative douce sans trypsine, utiliser 1 ml de TrypLE express/25 cm2 surface. Après détachement, 10 ml de milieu de culture L-MSC sont suffisants pour inactiver 3 ml d’anticorps</td></tr><tr><td>anti-rat CD146</td><td>TrypLE Lifespan Biosciences Inc.</td><td>C35841</td><td>12.5 &mu ; l par 0,5 x 106 cellules</td></tr><tr><td>Pentaspan (solution de pentaamidon)</td><td>Bristol-Myers Squibb</td> <td>Canada-Peut</td> <td>être obtenu auprès des services locaux de don de sang ou des services d’hématologie. Alternativement, on pourrait utiliser la solution de pentaamidon PSI à 20 % (Preservation Solutions, PST001) diluée 1:1 avec 0,9 % de NaCl.</td></tr><tr><td>Conteneur de congélation Mr. Frosty</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Améliore la viabilité lors de la congélation des L-MSC pendant la nuit à -80 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

isolement de cd146<sup&gt; +</sup&gt; cellules resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de rat poumons

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de plus en plus reconnus pour leur potentiel thérapeutique dans un large éventail de maladies, y compris les maladies pulmonaires. Outre l&#39;utilisation de l&#39;os MSC de cordon ombilical pour la thérapie cellulaire exogène osseuse et, il est également un intérêt croissant pour la réparation et le potentiel de régénération des cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents. En outre, ils ont probablement un rôle dans le développement normal des organes, et elles ont été attribué un rôle dans les maladies, en particulier ceux qui ont une nature fibreuse. Le principal obstacle pour l&#39;étude de ces cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents est l&#39;absence d&#39;un marqueur clair pour l&#39;isolement et l&#39;identification de ces cellules. La technique d&#39;isolement décrites ici applique plusieurs caractéristiques de cellules souches mésenchymateuses de résidents du poumon (L-MSC). Sur le sacrifice des rats, les poumons sont retirés et rincés plusieurs fois pour enlever le sang. Suite à la dissociation mécanique de scalpel, les poumons sont digérés pendant 2 à 3 heures en utilisant un mélange de collagénase de type I, de type protéase neutre et de la DNase I. Le obtained suspension cellulaire unique est ensuite lavée et posés sur milieu à gradient de densité (densité 1,073 g / ml). Après centrifugation, les cellules de l&#39;interphase sont lavées et étalées dans des flacons de culture traitée. Les cellules sont cultivées pendant 4-7 jours dans physiologique 5% O 2, 5% CO 2 conditions. Pour épuiser fibroblastes (CD146 -) et d&#39;assurer une population de seulement L-MSC (CD146 +), la sélection positive pour CD146 + cellules est effectuée par la sélection des billes magnétiques. En résumé, cette procédure produit fiable une population de primaire L-MSC pour complément d&#39;étude in vitro et la manipulation. En raison de la nature du protocole, il peut facilement être converti en d&#39;autres modèles animaux expérimentaux.

Deux des caractéristiques physiques les plus fiables de MSC, la densité et l&#39;adhésion en plastique, sont utilisés dans la première partie de ce protocole pour obtenir la fraction de cellules mésenchymateuses du poumon qui contient L-MSC. Bien que l&#39;interphase à gradient de densité comprend des monocytes et des macrophages, en plus des cellules mésenchymateuses du poumon, l&#39;adhérence plastique suivie par 3-5 jours de culture garantit que seules les cellules mésenchymateuses du...

Ce protocole décrit une technique d&#39;isolation pour obtenir des cellules mésenchymateuses du stroma de séjour du poumon primaires de rats, par l&#39;utilisation d&#39;une digestion enzymatique, séparation par gradient de densité, l&#39;adhérence plastique et CD146 + sélection de billes magnétiques.

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

L'objectif général de cette procédure est de caractériser in vitro les cellules souches mésenchymateuses ou MSCs résidentes positives pour le CD146, isolées du poumon de rat, en utilisant une combinaison de digestion enzymatique, de séparation par gradient de densité, d'adhérence au plastique et de tri par billes magnétiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies pulmonaires, notamment sur la manière dont les MSCs pulmonaires sont impliquées dans les pathologies et sur leur contribution à la modulation immunitaire et à la réparation tissulaire. Les principaux avantages de cette technique sont sa rapidité, sa reproductibilité et sa facilité d'application à différentes espèces d'animaux expérimentaux ou à divers tissus.Les premières étapes de la procédure seront démontrées par Arul Vadivel, un chargé de recherche de mon laboratoire. Pour retirer le poumon de la cavité thoracique, saisissez la trachée avec une petite pince et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour sectionner la trachée du côté rostral. Ensuite, tout en tirant doucement l'ensemble pulmonaire hors de la cavité thoracique, sectionez tout tissu conjonctif présent du côté dorsal le long de la cage thoracique.Couper le long du diaphragme pour détacher les poumons de l'aorte et de l'œsophage, puis utiliser de la gaze pour retirer délicatement tout sang résiduel du tissu pulmonaire. À l'aide de ciseaux, enlever la trachée et les bronches, puis placer soigneusement les lobes pulmonaires dans un tube de 50 millilitres contenant 35 millilitres d'anticoagulant CPDA froid et de PBS afin d'éliminer le sang et les débris. Après cinq minutes, transférer les poumons dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 35 millilitres de PBS stérile à température ambiante.Puis inverser délicatement pour éliminer le citrate. Après cinq minutes, rincer les poumons dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 35 millilitres de PBS de Dulbecco stérile à température ambiante, supplémenté en pyruvate de sodium et en glucose, et inverser délicatement. Ensuite, transférer les poumons dans un autre tube de 50 millilitres et utiliser un scalpel pour hacher finement le tissu contre la paroi du tube.Il est très important de découper le tissu en très petits morceaux afin d'assurer un rendement cellulaire maximal. Et de travailler rapidement pour garantir une viabilité cellulaire optimale. Lorsque tout le tissu a été haché, ajoutez l'enzyme fraîchement préparée dans le tube et refermez hermétiquement le couvercle.Incubez ensuite les morceaux de tissu à 38 degrés Celsius avec agitation douce pendant la période de digestion appropriée. À la fin de l'incubation, arrêtez la digestion en ajoutant 200 microlitres d'EDTA stérile filtré. Ajoutez 20 millilitres de PBS supplémenté en FBS à la suspension tissulaire et faites passer toute la suspension à travers un tamis cellulaire de 100 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres.Ensuite, rincez le tube de digestion et le filtre à cellules avec 10 millilitres de FBS/PBS et récupérez le lavage à l’aide d’un échantillon filtré. Après avoir centrifugé les cellules deux fois, resuspendez le second culot dans quatre millilitres de FBS/PBS à température ambiante. Puis, déposez lentement les cellules en couches sur trois millilitres de milieu de gradient de densité selon un angle supérieur à 45 degrés.En tapotant selon un angle supérieur à 45 degrés entre la suspension cellulaire et le milieu de gradient de densité, on évite que les forces de cisaillement mélangent les cellules avec le milieu de gradient, ce qui permet la formation des couches ; si un mélange se produit, il n’y aura pas de gradient de densité. Séparer les cellules par centrifugation et recueillir l’interphase. Laver ensuite les MSC pulmonaires dans 10 millilitres de PBS stérile et resuspendre le culot dans un milieu de culture complet pour les MSC pulmonaires préalablement réchauffé, puis ensemencer.Pour isoler la population de cellules positives pour le CD146, commencez par recouvrir des billes magnétiques avec 10 microgrammes d'anticorps secondaire biotinylé par 100 microlitres de billes magnétiques, dans un flacon cryogénique stérile de deux millilitres à fond rond, en conditions stériles. Incubez les billes et l'anticorps sur un mélangeur rotatif pendant 30 minutes à température ambiante et 30 tr/min. Resuspendez ensuite les billes conjuguées à l'anticorps dans 1,5 millilitre de PBS enrichi en BSA et transférez les billes dans un tube de cytométrie en flux de trois millilitres à fond rond.Rincez le flacon cryogénique avec 1,5 millilitre supplémentaire de BSA/PBS et aspirez le lavage avec les billes. Placez le tube sur un aimant adapté pendant deux minutes, jusqu’à ce que toutes les billes soient fixées à la paroi arrière du tube et que la solution devienne claire. Ensuite, retirez le surnageant et lavez les billes deux fois supplémentaires avec 3 millilitres de BSA/PBS.Rincez les CSM trois fois avec du PBS non supplémenté. Après le dernier lavage, traitez les cellules avec une solution douce non trypsine pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque toutes les cellules se sont détachées, ajoutez du milieu de culture de CSM pulmonaires frais et centrifugez les cellules.Resuspendez le culot dans du PBS contenant du BSA et comptez les cellules. Transférez ensuite les cellules dans un tube de trois millilitres contenant l'anticorps primaire CD146, fermez le tube et incubez les cellules sur un mélangeur rotatif à 15 tr/min et à quatre degrés Celsius. À la fin de l'incubation, lavez les cellules deux fois dans trois millilitres de PBS contenant du BSA, en resuspendant le second culot dans trois millilitres de billes conjuguées à l'anticorps secondaire.Après 30 minutes sur le mélangeur rotatif à quatre degrés Celsius, placez le tube sur l'aimant et utilisez une pipette Pasteur stérile pour éliminer lentement et soigneusement les cellules négatives. Ensuite, retirez le tube de l'aimant, resuspendez les cellules dans trois millilitres de PBS supplémenté en BSA et répétez le processus de sélection quatre fois supplémentaires. Après la dernière élimination des cellules négatives, lavez les MSC pulmonaires CD146 positifs dans le milieu de culture préchauffé.Enfin, resuspendre les cellules conjuguées aux billes dans un milieu frais de culture de cellules stromales mésenchymateuses pulmonaires et placer 5 000 cellules par centimètre carré dans un flacon de culture de taille appropriée. L’adhérence au plastique suivie de trois à cinq jours de culture enrichit la population interphasique issue de la séparation par gradient de densité en cellules MSC pulmonaires positives pour CD90, CD73 et CD146.De plus, ces cellules sont capables d'une efficacité de formation d'unités formant des colonies d'environ 30 %, bien plus élevée que celle généralement rapportée pour la moelle osseuse ou d'autres sous-ensembles de MSC capables de se différencier selon les trois lignées classiques des MSC. La sélection positive de la sous-population CD146 positive aboutit apparemment à une population cellulaire fortement enrichie en MSC pulmonaires, comme en témoigne un pourcentage plus élevé de cellules exprimant des marqueurs de surface associés aux MSC. Ces cellules démontrent également un potentiel de formation de colonies nettement plus élevé et une réponse de différenciation plus marquée, particulièrement dans la lignée chondrogénique, par rapport à la population totale de cellules mésenchymateuses obtenue avant la sélection CD146.À noter, ces MSC pulmonaires forment très peu de véritables adipocytes, présentant en revanche un grand nombre de cellules de forme fusiforme remplies de petites vésicules lipidiques, ce qui reflète probablement la lignée des lipofibroblastes, essentielle au développement pulmonaire et au soutien des cellules de type alvéolaire II. Une fois maîtrisée, cette technique permet d'obtenir des MSC pulmonaires CD146 positifs en six à dix jours, bien que le rendement dépende de l'âge et de l'espèce de l'animal. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de travailler rapidement afin de préserver la viabilité des cellules.Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la réaction mixte de lymphocytes ou les évaluations de cicatrisation des plaies, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'efficacité des CSM dans l'inhibition de la prolifération des lymphocytes T et le soutien de la cicatrisation des plaies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les CSM pulmonaires positifs pour CD146 en utilisant la digestion enzymatique, la séparation par gradient de densité, l'adhérence au plastique et le tri par billes magnétiques.

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