Design et emballage, et de livraison de titre élevé CRISPR Retro et lentivirus via stéréotaxique Injection

L’objectif global de cette procédure est de permettre aux chercheurs de concevoir et d’emballer des virus qui expriment une protéine fluorescente, CAS9 et des ARNsg, puis de les injecter stéréotaxiquement dans le cerveau de la souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions spécifiques dans le domaine des neurosciences, telles que le rôle des gènes qui sous-tendent les troubles neurologiques et neurodéveloppementaux. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de manipuler des gènes spécifiques sans le processus fastidieux et gourmand en ressources de la création d’animaux génétiquement modifiés.

Avant de préparer les cellules, utilisez un site Web pour générer un brin guide de 20 nucléotides ou ARNsg qui sera utilisé pour concevoir des oligos simple brin. Après avoir commandé des oligos et les avoir utilisés pour créer un plasmide final comme décrit dans le protocole de texte, continuez en pipetant toutes les cellules th-od d’un cryotube dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite 2 millilitres de CO2 préchauffé équilibré IMDM complet.

Ensuite, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 500 fois G.Ensuite, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres d’IMDM complet. Placez les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. 24 heures après le placage, changez le média en aspirant le média existant et en ajoutant 10 millilitres d’IMDM préchauffé.

Divisez les cellules une fois qu’elles sont confluentes. Pour diviser les cellules, aspirez le média et lavez la plaque avec 5 millilitres de PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de trypsine à 0,25 % dans la plaque et incubez à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent de la plaque.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre d’IMDM pour neutraliser la réaction de trypsine et pipetez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, faites tourner les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes. Remettre les cellules en suspension dans un millilitre d’IMDM et diluer 10 microlitres de cellules dans 90 microlitres de PBS.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé et replaquez les cellules avec l’IMDM complet. Le cinquième jour, changez le support deux heures avant la transfection et assurez-vous qu’il y a exactement 10 millilitres de support dans la plaque de 10 centimètres. Ensuite, préparez les réactifs de transfection pour deux couches à l’aide de deux tubes en polystyrène à fond rond de cinq millilitres.

Étiquetez le premier tube comme ADN et le deuxième tube comme 2X HBS. Ajustez ensuite la concentration d’ADN à un microgramme par microlitre dans Tris EDTA à PH 7,4. Pour fabriquer des réactifs de transfection pour les lentivirus et les rétrovirus, ajoutez lentement les composants requis dans le tube étiqueté ADN tout en tapotant continuellement sur le tube pour mélanger.

Après cela, ajoutez un millilitre de 2X HBS dans le tube étiqueté 2X HBS. Ensuite, ajoutez lentement un millilitre du contenu du tube d’ADN dans le tube 2X HBS, une goutte à la fois. Tapotez continuellement le tube 2X HBS et observez le précipité de phosphate de calcium formé après chaque goutte pour assurer la création réussie des complexes de transfection.

Ensuite, incubez le tube dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, ajoutez un millilitre de réactif de transfection en gouttelettes lentes à chaque plaque cellulaire de 10 centimètres et incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Remplacez le support le sixième jour.

Le septième jour, transférez le milieu contenant des particules virales à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres dans un tube conique de 50 millilitres avant de le stocker à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite huit millilitres de milieu FBS à 0,5 % dans chaque plaque cellulaire. Le huitième jour, collectez le milieu cellulaire contenant des particules virales et combinez-le avec la récolte de la veille dans le tube conique de 50 millilitres.

Dans cette étape, centrifugez le surnageant viral à 2000 fois G pendant 10 minutes. Ensuite, purifiez le milieu viral en le filtrant à travers un filtre à seringue à faible liaison protéique de 0,45 micromètre. Ensuite, ajoutez la solution de polyéthylène glycol 6000 5X dans le média.

Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, incubez le mélange viral à quatre degrés Celsius pendant au moins 12 heures. Le neuvième jour, centrifugez le mélange viral à 2500 fois G pendant 45 minutes.

Après 45 minutes, jetez le surnageant et faites-le tourner à nouveau pendant deux minutes. Suivi de l’élimination du surnageant à nouveau. Ensuite, remettez la pastille en suspension en ajoutant 320 microlitres de PBS stérile et incubez sur l’agitateur à température ambiante pendant 30 minutes.

Le lendemain, aliquotez le virus et congelez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer cette procédure, rasez la tête d’une souris anesthésiée afin de vous préparer au site d’injection. Dirigez l’isoflurane à 4 % dans le cône nasal.

Placez ensuite la souris dans l’instrument stéréotaxique. Insérez la barre de morsure dans sa bouche jusqu’à ce que ses dents tombent dans la fente avant de fixer les barres d’oreille. Assurez-vous que le corps de l’animal est sur le coussin chauffant et que le nez est situé dans le cône nasal.

Ensuite, confirmez l’anesthésie en pinçant le pied. Appliquez ensuite des larmes artificielles pour lubrifier les yeux. Par la suite, frottez la tête rasée avec de la povidone iodée et de la lidocaïne.

Faites maintenant une petite incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu. Séchez le crâne avec un écouvillon et appliquez du peroxyde d’hydrogène pour aider à visualiser le bregma. À l’aide d’une lunette de dissection, localisez le bregma sur le crâne et placez le foret au-dessus.

Réglez les coordonnées stéréotaxiques numériques des plans X, Y et Z sur zéro. Afin de s’assurer que la tête est nivelée sur l’axe Y de la caudale rostrale, placez le trépan sur lambda et nivelez la tête de sorte que la coordonnée Z soit à peu près égale à zéro au niveau de bregma et lambda. Pour vous assurer que la tête est nivelée le long de l’axe X, placez le foret sur le point médian entre bregma et lambda et mesurez les coordonnées Z à un millimètre du milieu des deux côtés pour vous assurer qu’elles sont égales.

Ensuite, abaissez l’isoflurane à 2 % avant de placer la perceuse sur les coordonnées souhaitées et percez soigneusement le crâne. Après avoir percé tous les trous, fixez la seringue remplie de virus sur l’instrument stéréotaxique. Centrez la seringue sur le trou et réglez la coordonnée Z au niveau du crâne sur zéro.

Abaissez lentement la seringue jusqu’à la profondeur Z la plus profonde et commencez l’injection à un débit de 0,25 microlitre par minute à l’aide d’un injecteur stéréotaxique. Une fois l’injection terminée à la profondeur Z la plus profonde, attendez une minute avant de l’élever à la coordonnée suivante et recommencez l’injection. Continuez ce schéma jusqu’à ce que toutes les coordonnées d’injection Z soient injectées.

Après la dernière injection, attendez deux minutes avant de retirer la seringue. Retirez ensuite la souris de l’instrument stéréotaxique et suturez le cuir chevelu. Appliquez de la lidocaïne et une crème antibactérienne sur le site chirurgical et administrez des analgésiques avant de transférer l’animal dans une chambre de récupération chauffée.

Cette image fluorescente à grand champ 10X a démontré que les rétrovirus à titre élevé infectent un grand nombre de cellules dont la morphologie peut être évaluée via l’expression de fluorophores. Dans cet exemple, des virus exprimant GFP ou mCherry ont été co-injectés dans le gyrus denté. En utilisant un système de rétrovirus, on peut utiliser un virus pour effectuer une manipulation génétique marquée par GFP et une autre manipulation marquée par mCHerry, puis évaluer les changements uniques ou additifs dus à chaque virus.

Il s’agit d’une reconstruction 3D de l’étendue de l’injection dans laquelle les contours fermés de la propagation virale ont été tracés sur 21 coupes en série. Les tracés de contour ont ensuite été alignés pour générer des images 3D pour la quantification du volume. La propagation virale totale est indiquée en vert et la propagation localisée dendate est indiquée en violet.

Cette image montre le virus se propageant le long de la piste de l’aiguille et du corps calleux en plus de remplir l’axe caudal rostral du gyrus denté. Suite à l’injection virale in vivo, nous utilisons d’autres méthodes telles que l’histologie, l’électrophysiologie, ou le double en direct sur microscopie pour étudier la conséquence de la manipulation génétique sur le développement neuronal.