Name: Imagerie réorganisation spatiale dune voie de signalisation MAPK Utilisation du système dexpression transitoire du tabac (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez l'imagerie de la réorganisation spatiale des voies MAPK dans les cellules végétales grâce au système d'expression transitoire du tabac. Cette méthode permet de visualiser les interactions protéiques dynamiques et leur organisation spatiale.

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Nous remercions Yumeng (Helen) Xia (Université Rutgers) pour l’édition du manuscrit. Les travaux sur la formation de la polarité BASL sont soutenus par des subventions de l’Institut national des sciences médicales générales des États-Unis à J.D. (R01GM109080) et à l’Université Rutgers.

1. Construction du plasmide <ol><li> Générer les constructions par la technologie du clonage comme décrit précédemment 1,6. <ol><li> Tout d&#39;abord utiliser un ADN polymérase haute fidélité avec des amorces appropriées pour amplifier les séquences codantes de BASL, YDA et MPK6 et sous-clone dans les vecteurs d&#39;entrée. Trouver le protocole détaillé dans 7. </li><li> Pour générer les versions négatives dominantes de MPK6 et YDA (DNmpk6 8 et DNyda 4, respectivement), utiliser les plasmides de MPK6 et YDA entrée en tant que modèle et introduire les mutations ponctuelles par une méthode 9 mutagenèse dirigée. </li></ol></li><li> Pour construire les constructions pour les essais de tabac transitoires, effectuer LR standard (attL x attR de recombinaison) Réactions (procédure détaillée dans 7) pour intégrer BASL dans pH35CG 10, DNyda et DNmpk6 en pXNGW et pXCGW vecteurs 11, respectivement. <ol><li> Confirmez les plasmides résultants par la digestion enzymatique et séquençage. Une fois successful, transformer les constructions binaires dans la souche d&#39; Agrobacterium tumefaciens GV3101 12 et les cultiver sur des plaques de sélection à 28 ° C pendant 2 - 3 jours. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de la solution d&#39; Agrobacterium Infiltration <ol><li> Inoculer quelques colonies d&#39;Agrobacterium fraîchement transformées dans 10 ml de milieu Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés (gentamicine 25 ug / ml, rifamycine 25 ug / ml de spectinomycine à 100 pg / ml pour pH35CG, pXNGW et pXCGW construit, les mêmes concentrations de la gentamycine et de la kanamycine rifamycine avec 50 pg / ml pour la p19 (exprimant des protéines contre silençage transgénique) 13. </li><li> Cultivez cultures d&#39;Agrobacterium dans un shaker C 28 ° à la vitesse de 200 tours par minute pendant environ 16 heures, puis de mesurer la DO 600 (estimé pour atteindre 1,5 à 1,8) (Figure 2A-B). Isoler les cultures à 2500 xg pendant 10 min. Re-suspendre et wash les culots cellulaires avec 10 mM de MgCl 2 (la solution d&#39;infiltration). </li><li> Isoler les cultures à nouveau et remettre en suspension les pastilles avec quantité appropriée de la solution d&#39;infiltration pour atteindre la DO finale 600 = 0,5 (figure 2C-D). Avant l&#39;infiltration de plantes, de laisser les mélanges de cellules à la température ambiante pendant 1-3 heures. Cette étape permet de maintenir l&#39;homéostasie cellulaire. </li></ol> 3. Plante du tabac et des feuilles Injection <ol><li> Utiliser des plants de tabac (Nicotiana benthamiana), cultivés 4-5 semaines d&#39;âge dans une chambre de croissance des plantes standard (23 ° C avec des cycles de / 8 h-16 h dark-light) 14 pour l&#39; injection de la feuille. Remarque: A ce stade, les plants de tabac ont généralement 6 feuilles (2 grandes, 2 moyennes et 2 petites). Les deux feuilles moyennes sont les plus optimales pour l&#39;injection de feuilles (les deux grands sont trop vieux, alors que les deux petits sont souvent trop jeunes). </li><li> Avant le jour de l&#39;infiltration, l&#39;eau de la Tobacplantes co pour saturer le sol. </li><li> Le jour d&#39;infiltration, pré-incuber les plantes dans l&#39;obscurité pendant 1-3 heures. Cette étape permet stomates dans l&#39;épiderme pour ouvrir largement, ce qui facilite grandement l&#39;Agrobacterium en pénétrant dans les cellules des feuilles épidermiques. </li><li> Utilisation de bandes de couleurs marquées avec des dates, drapeau des feuilles à infiltrer. Marquer les zones à infiltrées avec un sharpie noir épais (en option, les zones infiltrées sont visibles après avoir été infecté.). </li><li> Prenez des volumes égaux de l&#39;Agrobacterium remise en suspension et les mélanger dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm par douce tourbillonnant (Figure 2F). Note: Dans notre cas, nous avons mélangé 1 ml de p19 avec 1 ml de CFP-BASL, 1 ml de DNyda-NYFP et 1 ml de DNmpk-cYFP. </li><li> Dans le processus d&#39;infiltration, remplir un 3 ml seringue sans aiguille avec le mélange d&#39;infiltration (1 - 2 ml) et pousser sur le côté inférieur (abaxiale) de la feuille de tabac (figure 2F). Alors que l&#39;infiltration, il est utileà utiliser une main pour pousser et d&#39;autre part pour appuyer doucement sur le côté supérieur (adaxial, contre la force de poussée). Note: Une fois que le mélange d&#39;infiltration est injecté avec succès, les zones infectées seront facilement reconnaissables dans l&#39;épiderme. Cependant, l&#39;infiltration peut échouer en raison de l&#39;injection dure (de dommages aux tissus) ou insuffisante push (pas de pénétration de liquide). Pour chaque test, nous suggérons au moins deux injections dans deux feuilles indépendantes (à partir de différentes plantes). </li><li> Placer les plantes infectées de nouveau dans la chambre de croissance. En règle générale, les expressions de protéines sont détectables après 48 h infiltration suivante. </li></ol> 4. imagerie confocale <ol><li> A 48 heures après l&#39; infiltration, utiliser une perforatrice pour exciser un disque de feuille de la zone injectée (normalement 3 - 4 disques / zone peuvent être produites) (figure 2G). Utilisez des pinces pour transférer doucement les disques de feuilles à une diapositive (le côté abaxiale vers le haut) et les monter avec des gouttes d&#39;eau. Évitez d&#39;appuyer trop hard sur le feuillet de couverture , car les cellules comprimées / endommagées ne montrera pas bien sous le microscope confocal (Figure 2H). </li><li> Avant l&#39;imagerie confocale, analyser les échantillons montés sur un composé microscope epi-fluorescence pour vérifier les niveaux d&#39;expression. Remarque: D&#39;après notre expérience, les cellules qui présentent un niveau d&#39;expression intermédiaires sont mieux représentés sous le microscope confocal. </li><li> Commencez avec le 40X (NA 1.3) lentille sur un microscope confocal. Ajuster le coulisseau à la position désirée de sorte que les cellules exprimant des niveaux moyens de protéines fluorescentes restent au centre. Les spectres d&#39;excitation / émission de CFP et YFP sont 458 nm / 480-500 nm et 514 nm / 520-540 nm, respectivement. </li><li> Activez le bouton &quot;Live&quot; pour prévisualiser les images puis réglez l&#39;intensité du laser et le gain à puce pour le rapport intensité de fluorescence / bruit le plus équilibré. Pour améliorer la qualité d&#39;image, augmenter les pixels de balayage et / ou moyenne trame / ligne. Enfin, réglez le bouton de mise au point reach le plan focal médian et cliquez sur &quot;Capture&quot; pour prendre l&#39;image. Note: La PCP et les images YFP peuvent être capturées successivement ou simultanément en cochant ou désactiver l&#39;option de mode de balayage &quot;séquentiel&quot;, respectivement. </li><li> Lorsque Z projection est souhaitée pour la vue en profondeur des cellules, sélectionner le mode d&#39;imagerie &quot;xyz&quot;, définir la profondeur de la plage de balayage (10 - 15 um) et récupérer les images à partir du haut vers le bas de la cellule cible . Compiler les images obtenues avec le logiciel Leica en cliquant droit sur le fichier d&#39;image pour sélectionner &quot;renommer&quot; et d&#39;exporter des images sous forme de fichiers .tiff. </li><li> Photo 30 - 40 cellules pour l&#39;analyse de quantification. </li></ol> Traitement 5. Image et analyse de Quantification <ol><li> Utilisez le logiciel Fidji (http://fiji.sc/Fiji) pour traiter des images et effectuer la quantification. <ol><li> Tracer les graphes d&#39;intensité de fluorescence. <ol><li> Pour mieux visualiser si l&#39;expression CFP / YFP estuniformément répartie, utiliser Fidji pour démontrer la puissance du signal du CFP et YFP le long de la périphérie de la cellule. Pour ce faire, lancer la première Fidji puis sélectionnez &quot;Fichier&quot; et &quot;Ouvrir&quot; pour démarrer l&#39;image. Cliquez sur &quot;ligne&quot; dans le menu d&#39;outils et sélectionnez &quot;ligne segmentée&quot; par un clic droit. Décidez de la région d&#39;intérêt et tracer une ligne le long de la périphérie de la cellule pour tracer la PCP ou le signal YFP (figure 3A-C). Note: Fidji mesure la valeur d&#39;intensité de fluorescence absolue le long des lignes segmentées. </li><li> Sélectionnez le menu déroulant &quot;Analyser&quot; et &quot;Profil de la parcelle&quot; pour générer un graphique avec la position et l&#39;intensité des valeurs qui représentent les niveaux de CFP / YFP le long de la ligne segmentée. Si vous le souhaitez, dupliquer les valeurs d&#39;intensité (en sélectionnant le menu &quot;Copier&quot;) dans EXCEL ou un autre logiciel graphique pour générer des graphiques d&#39;intensité comparables. </li></ol></li><li> Quantifier degré de polarité. <ol><li> Prélever environ 20 représencellules tatives de 3 expériences répétées pour évaluer le degré de polarité du CFP et YFP dans les cellules de tabac. Calculer le degré de polarité sur la base du rapport de l&#39;intensité de fluorescence élevée (définie comme H) par rapport à la faible intensité de fluorescence (définie comme L). Remarque: La méthode de quantification est expliqué dans la Figure 3. <ol><li> Pour mesurer les valeurs de H et L, tracer une ligne segmenté le long de la région intéressée à la périphérie de la cellule (décrite ci-dessus), cliquez sur &quot;Analyser&quot; dans le menu déroulant, puis sélectionnez &quot;Mesure&quot;. Lorsqu&#39;une fenêtre &quot;Résultats&quot; apparaît, utiliser &quot;moyenne&quot; des valeurs pour effectuer la quantification. </li><li> A partir des cellules présentant une expression relativement uniforme de CFP et YFP, par exemple, CFP-BASL (figure 3A) ou YFP complétées de la co-expression de DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3B), obtenir les valeurs H et L en mesurant deux choisis au hasard segments périphériques de longueur égale. </li> &lt;li&gt; A partir des cellules présentant l&#39; accumulation polaire évidente de protéines fluorescentes, dans ce cas, la co-expression de la PCP-BASL, DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3C), collecter les valeurs H des régions périphériques avec des signaux de fluorescence enrichis et les Ls des régions à faible / pas d&#39;accumulation de fluorescence. </li><li> Réunir les rapports résultants de H / L de 20 cellules ensemble et essai pour la distribution normale. Calculer les valeurs de p par le test t de Student (pour la distribution normale) ou le test de Kolmogorov-Smirnov (KS) (pour la distribution non-normale). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Utilisation générale et modifications possibles du système d&#39;expression transitoire pour le tabac transduction de signal: surexpression de la protéine fluorescente (FP) -tagged protéines dans l&#39;épiderme du tabac a été utilisé avec succès pour un examen rapide de la protéine localisation subcellulaire dans les cellules végétales. Cependant, l&#39; étude de la distribution de signalisation dynamique du complexe protéique in planta est un sujet difficile e...

Les protéines interagissent dans un des complexes de réseau et forment hiérarchiques complexes qui jouent un rôle central dans presque tous les processus biologiques qui se produisent dans un environnement cellulaire imprévisible. Cependant, du développement des plantes à des réponses de croissance, il y a eu un manque d&#39;outils pratiques qui peuvent non seulement rapidement, mais aussi efficacement identifier et surveiller ces événements de signalisation dynamiques au niveau subcellulaire. Le système d&#39;expression de protéine transitoire tabac épiderme des feuilles a appel des avantages pour la visualisation des protéines fluorescentes dans les cellules vivantes. Ce système fournit des semi - conditions in vivo qui permettent la modification des protéines post-traductionnelle et un examen rapide de la localisation des protéines. En examinant le signal complémenté YFP, le dosage de complémentation bimoléculaire fluorescente (BiFC) indique la possibilité d&#39;une interaction protéine-protéine dans les cellules végétales. Par rapport à d&#39; autres méthodes, par exemple, la levure deux hybrides (Y2H) et co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fournit également un puissant moyen de visualiser les compartiments où les interactions protéine-protéine peuvent se produire au niveau subcellulaire. Parce que la division cellulaire asymétrique (ACD) maintient la tige population de cellules tout en générant de nouveaux types de cellules pour la formation de tissu / organe, il est un mécanisme indispensable pour la promotion de la multicellularité eucaryote. Le développement d&#39; Arabidopsis stomatique a été utilisé comme un système modèle pour l&#39; étude ACD dans les plantes. La cellule précurseur, cellule mère meristemoid, divise asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, un meristemoid (subit souches divisions cellulaires comme avant de se terminer dans une paire de cellules de garde) et une cellule de terre de la lignée stomatique (SLGC) (peut se diviser et se différencier en une cellule de revêtement), respectivement (figure 1). En stomatique ACD, le roman rupture des protéines de Asymétrie dans le Lineage stomatique (de BASL) est polarisé premitotically pour conduire asymétries de la division, qui incasymétrie physique lude et le destin des cellules d&#39;asymétrie 1. Une cascade MAPK composé du MAPKKK YODA et les MAPK, MPK3 et 6 est central pour la division des stomates motifs et sort adoption 2,3, 4,5. Récemment, Zhang et al. lié à la protéine de polarité BASL à la voie de signalisation MAPK YDA-Arabidopsis stomatique ACD 6. La voie YODA-MAPK canonique, par MPK3 / 6, phosphoryle BASL et active sa polarisation. Fonctions BASL phosphorylés comme un échafaudage et recrute YODA (YDA) et MPK3 / 6 pour former un complexe de protéines et de concentrer la signalisation au niveau du cortex cellulaire 6. Polarisation des composantes de MAPK et de la boucle de rétroaction positive entre BASL et la voie MAPK-YDA représente un nouveau mécanisme pour la protéine de polarisation dans les cellules végétales. Signalisation MAPK localement enrichi est supposé être étroitement liée à la différenciation du destin cellulaire dans stomatique ACD 6 (Figure 1). Un des key données expérimentales qui ont soutenu ce modèle provenaient des essais de tabac qui ont démontré la redistribution spatiale des MAPK induite par l&#39;expression de BASL 6. D&#39;une manière générale, il est facile de surveiller la signalisation MAPK où se produit parce que les molécules de MAPK ont souvent été trouvés partout à l&#39;intérieur d&#39;une cellule. Dans cette étude, nous avons utilisé le système split-YFP pour visualiser l&#39;interaction entre la kinase en amont et en aval les suggérer où le relais de signalisation se produit. Nous avons également étendu l&#39;utilisation du système BiFC par co-exprimant une troisième protéine (CFP-tagged) avec la paire YFP fendue (suggestive d&#39;interaction protéine-protéine) pour visualiser si et comment le YFP complété pourrait être modulée spatialement par la coopération protéine exprimée PCP. Ce faisant, nous avons démontré que la co-expression de la PCP-BASL induite réorganisation spatiale des interactions entre YDA et MPK6, de même la distribution à la structuration polarisée au niveau du cortex cellulaire de l&#39;épiderme du tabaccellules al. Ce système a donc le potentiel d&#39;être développé pour la surveillance des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales dans des conditions où les cellules sont contestées par les stimuli internes ou externes (par exemple, co-expression d&#39;autres protéines, l&#39; application chimique, pathogène attaque ou changements environnementaux, etc. ).

<table><tbody><tr><td>Phusion ADN polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL Kit de mutagénèse dirigée vers le site</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>AMRESCO</td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm Slide</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Verre de protection</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>TCS SP5 II</td><td>LAS AF Lite logiciel</td></tr><tr><td>Objectif 40X</td><td>Leica</td><td>HCX&nbsp ; Plan APO&nbsp ;</td><td>HCX&nbsp ; Plan APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>SORVALL 6+</td><td></td></tr><tr><td>Perforateur</td><td>Staples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes de faucon</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>N° 5 Pince</td><td>Canemco & Marivac</td><td>205EQA-Spec</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation mapk utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualisation des événements de signalisation dynamiques dans des cellules vivantes a été un défi. Nous avons élargi un système d&#39;expression transitoire établie, la complémentation fluorescente (BiFC) Essai biomolécules dans les cellules épidermiques du tabac, de l&#39;interaction protéine-protéine d&#39;essai pour surveiller la distribution spatiale de la transduction du signal dans des cellules végétales. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test BiFC pour montrer que l&#39;interaction et la signalisation entre l&#39;Arabidopsis MAPKKK YODA et MAPK6 se produisent à la membrane plasmique. Lorsque le BASL de protéine d&#39;échafaudage a été co-exprimé, l&#39;interaction YODA-MAPK redistribué et spatialement co-polarisé avec CFP-BASL. Ce système d&#39;expression de tabac modifiée permet un examen rapide de signalisation localisation et dynamiques des changements (moins de 4 jours) et peut accueillir plusieurs de couleurs de protéines fluorescentes (au moins trois). Nous avons également présenté des méthodes détaillées pour quantifier la distribution des protéines (localisation spatiale asymétrique, ou «polarisation»;) Dans des cellules de tabac. Ce système d&#39;expression de tabac de pointe a un potentiel à être largement utilisé pour le test rapide des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales vivantes.

Pour empêcher la mort cellulaire induite par la signalisation MAPK hyperactif, la kinase de versions inactives YDA (DNyda) et MPK6 (DNmpk6) ont été utilisés dans le test de co-expression dans des cellules de tabac. Ni l&#39;interaction entre DNyda et DNmpk6 révélé par BiFC ni CFP-BASL se modèle de distribution inégale générée (figure 3A-B). Toutefois, lorsque CFP-BASL a été introduit dans la paire d&#39;interaction DNyda-DNmpk6, à la fois des signaux YFP PCP et ont été r...

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Le but général de cette procédure est de visualiser la distribution spatiale dynamique d'une protéine

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Biology

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Deux méthodes complémentaires basées sur la cytométrie en flux et la microscopie sont présentées qui permettent la quantification, au niveau de la cellule unique, de la dynamique de l'expression génique induits par l'activation d'une voie de MAPK dans la levure.

Quantification temporelle d&#39;expression MAPK induite en simples cellules de levure

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Etudier les premiers événements de la progression de cellules prénéoplasiques et l'interaction immunitaire innée des cellules est essentiel pour comprendre et traiter le cancer. Ici, nous décrivons une méthode pour induire une condition transformations de cellules epitheliales et de la formation d'image en temps réel de l'interaction subséquente immunitaire inné avec des cellules exprimant HRAS G12V cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre.

Imagerie en direct d&#39;Innate immunitaire et prénéoplasiques Interactions cellulaires L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression / UAS inductible Gal4 dans des larves de poisson zèbre peau

L’horloge de segmentation pilote l’expression des gènes oscillatoires à travers le mésoderme pré-somitique (PSM). L’activité Dynamic Notch est la clé de ce processus. Nous utilisons l’imagerie et les analyses computationnelles pour extraire la dynamique temporelle des données d’expression spatiale afin de démontrer que l’expression du ligand Delta et du récepteur Notch oscille chez le PSM des vertébrés.

Commande temporelle des données d&#39;expression dynamique d&#39;expression spatiale détaillée Plans

Ce protocole décrit une stratégie opto-génétique pour moduler l'activité de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK) pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire de Xenopus . Cette méthode permet l'activation réversible de la voie de signalisation MAPK dans la culture de cellules de mammifères et dans les organismes vivants multicellulaires, comme les embryons de Xenopus , avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et<em&gt; Xenopus</em&gt; Développement embryonnaire

Nous présentons ici un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes d’activité signalisation TGF-β/Smad3 utilisant un système de reporter des adénovirus. Ce système suit l’activité transcriptionnelle en temps réel et peut être appliqué à ces deux cellules isolées in vitro et dans l’animal vivantmodèles.

Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct

Une procédure est présentée pour visualiser les activités de kinase a de protéine dans les souris head-fixed, se comportant. Un journaliste amélioré d'activité de A-kinase, tAKARMD, est exprimé dans les neurones corticaux et rendu accessible pour la formation image par une fenêtre crânienne. La microscopie d'imagerie à vie à deux photons est utilisée pour visualiser les activités de LPJ in vivo pendant la locomotion forcée.

Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie

Les changements morphologiques se produisent dans les cellules de fibroblaste sensibles au système immunitaire après l'activation et favorisent des changements dans le recrutement cellulaire. Utilisation de l'imagerie à 2 photons en conjonction avec une protéine génétiquement modifiée spécifique au fibroblaste 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) ligne de souris et vert fluorescent marqué lipopolysaccharide-FITC, nous pouvons illustrer l'apport très spécifique de lipopolysaccharide...

In Vivo Deux-Couleur 2-Photon Imagerie des cellules de reporter génétiquement marqués dans la peau

La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Plusieurs méthodes couramment utilisées sont présentées ici pour étudier les événements de trafic membranaire d’une kinase du récepteur de la membrane plasmique. Ce manuscrit décrit les protocoles détaillés, y compris la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale.

Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

Découvrez l'imagerie de la réorganisation spatiale des voies MAPK dans les cellules végétales grâce au système d'expression transitoire du tabac. Cette méthode permet de visualiser les interactions protéiques dynamiques et leur organisation spatiale.

Imagerie réorganisation spatiale d'une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d'expression transitoire du tabac

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