Myéloïde cellule d'isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée Plasmodium sporozoïtes

L’objectif global de cet ensemble de procédures est d’immuniser les souris avec des parasites plasmodium atténués par les radiations. Faciliter l’analyse du recrutement des cellules myéloïdes dans la peau de la souris et les ganglions lymphatiques drainants. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du paludisme, telles que quels sont les acteurs cellulaires impliqués dans la réponse immunitaire innée aux parasites vivants atténués.

Entre 18 et 25 jours après le repas de sang de l’infection, recueillir et anesthésier par le froid les moustiques infectés dans un tube de 15 millilitres sur de la glace. Ensuite, retournez soigneusement le tube dans une boîte de Pétri sur de la glace et exposez les insectes à une dose de 12 kilorad d’irradiation gamma ou X. Récupérez les glandes salivaires de moustiques irradiées dans 15 microlitres de DPBS sur de la glace.

Et puis, écrasez doucement les glandes pour libérer les sporozoïtes. L’injection d’une suspension parasitaire hautement concentrée dans un petit volume est essentielle, il est donc important de récolter un nombre suffisant de glandes salivaires chez des moustiques bien infectés, comme en témoigne l’expression robuste de la fluorescence verte. Remettre en suspension la suspension parasitaire avant la filtration à travers une passoire de 35 micromètres adaptée à un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

À l’aide d’une chambre de comptage au microscope, comptez le nombre total de sporozoïtes isolés et ajustez la suspension du parasite à une concentration de 8,3 fois dix à quatre sporozoïtes par microlitre dans des DPBS froids sur glace. Avant d’injecter les sporozoïtes, confirmez le bon niveau de sédation de l’animal de laboratoire par pincement des orteils et appliquez une pommade oculaire pour prévenir le dessèchement de la cornée. Ensuite, en travaillant rapidement, utilisez du ruban adhésif transparent pour fixer doucement la face ventrale du pavillon de l’oreille sous un stéréomicroscope et chargez une seringue de dix microlitres, équipée d’une aiguille de calibre 35, avec 0,6 microlitre de parasites en suspension.

Ensuite, insérez soigneusement l’aiguille, côté biseau vers le haut, sous l’épiderme sur le côté dorsal de l’oreille et injectez 0,15 microlitre de sporozoïtes dans le site. Une papule caractéristique sera observée au site d’injection. Après avoir injecté le derme trois fois de plus, comme nous venons de le démontrer, retirez soigneusement le ruban adhésif et surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.

Au moment souhaité après l’inoculation du sporozoïte, sacrifiez la souris et commencez la procédure immédiatement. Assurez-vous que la souris présente des signes de mort clinique. Désinfectez l’oreille et la région du cou correspondante avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, à l’aide de ciseaux stériles et de pinces, faites une incision dans la région jugulo-carotidienne. Ensuite, étirez l’incision avec deux pinces pour exposer le ganglion lymphatique drainant d’apparence grise. Pincez et retirez soigneusement le tissu conjonctif directement au-dessus du ganglion lymphatique et extrayez-le avec une deuxième paire de pinces, placée en dessous.

Transférez le ganglion lymphatique dans une passoire de 70 microns dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits, contenant 4,5 millilitres de milieu standard, complété par de la collagénase et de la DNase. Ensuite, prélevez toute l’oreille inoculée et utilisez deux pinces pour pincer et séparer l’oreille en faces dorsale et ventrale. Placez ensuite chaque côté de l’oreille dans un puits d’une deuxième plaque à six puits, contenant 4,5 millilitres par puits de milieu complété par des enzymes digestives, en veillant à ce que chaque tissu soit complètement immergé dans le milieu.

Pour isoler les cellules immunitaires des ganglions lymphatiques, incubez la plaque de tissu lymphoïde à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 sous une légère agitation. Après 15 minutes, ajoutez dix millimolaires d’EDTA dans chaque puits et placez l’assiette sur de la glace. Ensuite, pour chaque ganglion lymphatique, utilisez l’extrémité d’un nouveau piston de seringue de cinq millimètres et appuyez le ganglion lymphatique contre la crépine en utilisant des mouvements circulaires pour dissocier le tissu.

Lorsqu’il ne reste que du tissu conjonctif blanc, rincez la passoire deux fois avec 500 microlitres de DPBS contenant du FBS et de l’EDTA et transférez le lavage dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, lavez le puits deux fois de plus avec 500 microlitres de DPBS supplémenté et transférez le lavage dans le tube placé sur de la glace. Pour isoler les cellules immunitaires de l’oreille, incubez les feuillets de l’oreille à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 avec une légère agitation.

Au bout de 20 minutes, coupez les tissus en petits morceaux pour faciliter leur digestion et renvoyez les échantillons dans l’incubateur. Après 40 minutes, arrêtez la digestion avec dix millimolaires d’EDTA et placez l’assiette sur de la glace. À l’aide d’une pipette d’un millilitre avec une pointe coupée, transférez tout le contenu de chaque puits dans de nouveaux puits contenant des passoires de 70 microns.

Et utilisez un piston de seringue de cinq millilitres pour dissocier les fragments de tissu de l’oreille avec des mouvements circulaires, comme nous venons de le démontrer. Lorsqu’il ne reste que du tissu conjonctif blanc et des cheveux, lavez les crépines et les puits avec du DPBS plus FBS et de l’EDTA, comme nous venons de le démontrer, en regroupant les lavages dans un tube de 50 millilitres sur de la glace. Enfin, lavez le puits deux fois avec du DPBS supplémenté et transférez le lavage dans le tube placé sur de la glace.

Dans cette vidéo, on peut voir la migration des sporozoïtes atténués par les radiations dans la peau de la souris 15 minutes après l’injection intradermique des parasites. 24 heures après l’injection intradermique de sporozoïtes, les cellules totales sont isolées de la peau et du ganglion lymphatique drainant. Comme observé sur cette figure, la fréquence des cellules myéloïdes dans la peau et le drainage des ganglions lymphatiques est fortement augmentée par rapport aux souris naïves.

Une fois maîtrisés, les premières étapes du protocole d’irradiation des moustiques à l’injection de sporozoïte peuvent être réalisées en quatre heures. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que le sporozoïte isolé des glandes salivaires des moustiques perd rapidement son infectiosité. Ils doivent donc être injectés le plus rapidement possible.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules myéloïdes de la peau de souris et du ganglion lymphatique drainant pour explorer la réponse immunitaire à l’injection intradermique de parasites plasmodium vivants atténués.