Name: Technique à la cible microinjection du Developing Xenopus Kidney (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Découvrez la microinjection ciblée dans le rein en développement de Xenopus laevis. Cette technique permet d'étudier la formation rénale et les gènes impliqués dans ce processus embryonnaire essentiel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par un National Institutes of Health subvention NIDDK (K01DK092320) et le financement de démarrage du département de pédiatrie à l&#39;Université du Texas Medical School McGovern.

Le protocole suivant a été approuvé par l&#39;Université du Texas Health Science Center au centre de Houston pour des animaux de laboratoire Comité de médecine bien-être animal, qui sert de soins en établissement et l&#39;utilisation Comité (protocole #: HSC-AWC-13-135). 1. Identification et sélection des blastomères pour Injections de rein ciblées <ol><li> Avant de générer des embryons, utiliser le tableau normal du Xenopus développement 21 pour comprendre l&#39;orientation des divisions cellulaires précoces dans l&#39;embryon. Sinon, l&#39; accès des diagrammes des premiers stades de développement Xenopus sur Xenbase 11. </li><li> Accédez aux Xenopus cartes interactives du destin cellulaire sur Xenbase 11 pour sélectionner blastomère sera ciblée pour la microinjection. </li><li> Observez que l&#39;embryon de cellule unique a un pôle animal sombre pigmentée et un pôle végétal, qui est blanc et yolky. A noter qu&#39;une membrane de protection, connue sous le vitelline envelope, couvre l&#39;embryon. </li><li> Notez que la première coupure se produit généralement entre les côtés gauche et droit de l&#39;embryon. Ces cellules contribuent également à la lignée pronephrique. </li><li> Notez que le deuxième clivage sépare la partie dorsale et ventrale moitiés de l&#39;embryon, conduisant à un embryon de quatre cellules. Les cellules dorsales sont plus petites et moins de pigment que les cellules ventrales (figure 2A et la figure 3A). <ol><li> Identifier les blastomères ventrales (V, les grandes cellules, sombres) sur les côtés gauche et droit, qui contribuent plus au rein en développement que la dorsale (D; petites cellules, lumière) blastomères (figure 2A). </li><li> Si l&#39; injection dans un embryon 4 cellules, injecter le blastomère ventral gauche pour cibler le rein gauche (figure 3A et la section 3). </li></ol></li><li> Le troisième clivage bissecte les côtés animales et végétales, résultant en un embryon de huit cellules. À ce stade, il y a quatre blastomères animaux [gauche et à droite ventrale(V1) et dorsale (D1)] et quatre blastomères végétaux [gauche et à droite ventrale (V2) et dorsale (D2)] (figure 2B et la figure 3B). <ol><li> Localisez les, blastomères végétales ventrales (V2). Ces blastomères contribuent davantage au développement de rein toutes les autres cellules à ce stade (figure 2B). Pour cibler le rein gauche d&#39;un embryon de 8 cellules, injecter dans le blastomère gauche V2 (figure 3B et la section 3). </li></ol></li><li> Notez que les quatrième et cinquième clivage bissectrices des blastomères animales et végétales. Deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, résultant en un embryon de 16 cellules. Les cellules sont nommées d&#39;après leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2 à partir du stade de 8 cellules donne lieu à V2.1 , V2.2 et descendants au stade de 16 cellules (figure 2C). La cellule V2.2 au stade 16 cellules fournit la majorité des cellules qui contribuent à l&#39;élaboration du rein. </li><li> Notez que les sixième et septième clivages se traduisent par une 32 cellule embryo. Encore une fois, deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, qui sont nommés suivant leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2.2 à partir du stade 16 cellules donne lieu à V2.2.1 et V2.2.2 au stade 32 cellules. Il existe un système d&#39;attribution de nom alternatif au stade 32 cellules dans lequel les cellules sont identifiées en quatre rangées A, B, C et D (de l&#39;animal à végétale), et quatre colonnes 1, 2, 3 et 4 ( de dorsale ventrale). Ainsi, le blastomère V2.2.2, ce qui contribue le plus aux pronéphros en développement, est appelé C3 dans ce système de nommage alternatif (figure 2D). </li></ol> 2. Préparation d&#39;embryons <ol><li> Préparer 50 ml de solution Dejelly (2% de cystéine, NaOH à pH 8,0). </li><li> Isoler les deux testicules d&#39;une seule grenouille mâle selon les protocoles standards 14. Placez les testicules dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de solution de stockage Testicules (Modifié Ringers [MMR 1x Marc; 0,1 M de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES à pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% d&#39; albumine de sérum bovin, 50 ug / ml de gentamycine). Conserver les testicules à 4 ° C. Remarque: Testicules peut être stocké pendant environ 7-10 jours à 4 ° C, mais l&#39;efficacité de la fertilisation diminuera plus les testicules ont été stockés. </li><li> Déposer une grenouille femelle pour obtenir des oeufs selon des protocoles standard 14. Ramassez les oeufs dans une boîte de Pétri de 100 mm. Verser tout excès d&#39;eau. </li><li> Couper ¼ de testis alors qu&#39;il est dans une solution de stockage à l&#39;aide de pinces et Testicules une lame de rasoir. Transférer le morceau de testis à la boîte de Petri contenant des œufs. Ajuster la taille de la partie testiculaire utilisée pour tenir compte de la taille des testicules, combien de temps le testicule a été stocké, et combien d&#39;oeufs doivent être fécondé. Généralement utiliser ¼ à 1/3 d&#39;un testicule fraîchement disséqués pour fertiliser un embrayage d&#39;œufs. </li><li> Couper la partie testiculaire en petits morceaux à l&#39;aide de pinces et d&#39;une lame de rasoir. Ajouter suffisamment 0.3x MMR+ 30 mg / ml de gentamicine à la boîte de Pétri pour couvrir les oeufs. Agiter le MMR dans le plat pour mélanger. </li><li> Attendez environ 30 minutes pour la fécondation ait lieu à la température ambiante. Notez que l&#39;hémisphère animal (le côté pigmentée de l&#39;embryon) sera assis sur le dessus de l&#39;embryon après la fécondation efficace. Ensuite, retirez le MMR de la boîte de Pétri à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. Ajouter la solution Dejelly assez pour le plat pour couvrir les embryons. </li><li> Au cours des prochaines minutes, agiter doucement le plat par intermittence. Une agitation vigoureuse du plat à ce moment peut causer des défauts d&#39;axe. &#160; La couche de gelée sur les embryons se dissoudra, et les embryons se rassemblent dans le centre du plat pendant tourbillonnant. Une fois que les embryons sont étroitement en contact entre eux dans le centre de l&#39;assiette, retirer la solution Dejelly avec une pipette de transfert. Ne pas laisser les embryons dans la Solution Dejelly pendant plus de 5 minutes, ou les embryons peuvent être endommagés. </li><li> Laver les embryons dejellied 3 - 5 fois en 0.3xMMR + 30 mg / ml de gentamicine par le versant avec précaution ou pipetage hors du MMR et en remplissant le plat avec le nouveau vaccin ROR. Ne pas enlever tout le MMR de l&#39;antenne, ou les embryons peuvent être endommagés. </li><li> Retirez tous les œufs non fécondés ou des morceaux de testis de la boîte de Pétri à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li><li> Incuber embryons entre 14 et 22 ° C. Nota: Les embryons cultivés à des températures plus basses se développent plus lentement que les embryons cultivés à des températures plus élevées. Timing des stades de développement peuvent être trouvés sur Xenbase 22. <ol><li> Pour l&#39;espace sur leur développement, le lieu de la moitié des embryons provenant d&#39;une seule fécondation dans une boîte de Pétri maintenue à 14 ° C, et l&#39;autre moitié des embryons dans une boîte de Pétri maintenue à 18 ° C. Ceci permet d&#39;avoir deux ensembles d&#39;injections dans des embryons de cellules 4 ou 8 cellules à partir d&#39;une seule fécondation. </li></ol></li></ol> 3. Préparation des solutions d&#39;injection et de micro-injection d&#39;embryons <ol><li> Préparer une solution injectable contenant 0,01ng / nl protéine liée à la membrane rouge fluorescent (MEM-RFP) ARNm 9 tandis que les embryons se développent au stade 4 cellules ou 8 cellules. Conserver la solution d&#39;injection sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt à injecter. </li><li> Charger un &quot;tube capillaire en verre de remplacement dans un extracteur d&#39;aiguille, avec la partie supérieure du tube de remplacement aligné avec la partie supérieure du boîtier aiguille de traction. Réglez le # 2 valeur de la chaleur à 800, et la valeur de traction à 650. Appuyez sur la touche&quot; 7 tirer &quot;pour tirer l&#39;aiguille. Cela va créer 2 aiguilles à partir d&#39;un seul 7&quot; tube capillaire en verre. </li><li> Couper la pointe d&#39;une aiguille tirée avec une paire de pinces Dumont. Remarque: Après avoir tiré l&#39;aiguille, la pointe est scellé fermé et doit être coupé ouvert. Le plus proche de la pointe de l&#39;aiguille qu&#39;il est coupé, plus le diamètre de la pointe de l&#39;aiguille sera. Bien que le diamètre de la pointe ne sera pas affecter le volume d&#39;injection avec le système de microinjection utilisé ici, une pointe avec un plus grand diamètre est plus susceptible d&#39;endommager l&#39;embryon. </li><li> Glissez le micropipette virole sur le dos de l&#39;aiguille. Ensuite, glisser le grand joint torique de trou sur le dos de l&#39;aiguille derrière le collet. </li><li> Remplissez l&#39;aiguille avec de l&#39;huile minérale à l&#39;aide d&#39;une aiguille hypodermique de calibre 27, en faisant attention de ne pas obtenir des bulles d&#39;air dans l&#39;aiguille. </li><li> Glissez l&#39;aiguille sur le piston de la micro-injecteur, d&#39;un coin de l&#39;aiguille dans le grand trou du blanc entretoise en plastique installé sur le piston. Le plongeur doit avoir un petit joint torique le plus proche du corps du micro-injecteur, suivie par l&#39;entretoise blanche, grand joint torique de trou, et virole. Fixer l&#39;aiguille en serrant la pince. Tirez doucement sur l&#39;aiguille pour vous assurer qu&#39;il est correctement fixé. </li><li> Appuyez et maintenez enfoncé le bouton &quot;vide&quot; sur la boîte de contrôle de micro-injecteur jusqu&#39;à ce qu&#39;il ya deux bips. </li><li> Introduire à la pipette 3 pl de solution d&#39;injection sur un morceau de parafilm. Insérer la pointe de l&#39;aiguille dans le talon de la solution d&#39;injection sur le Parafilm. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton &quot;remplir&quot; sur le microiboîte njector de commande pour dessiner la solution d&#39;injection dans l&#39;aiguille. </li><li> Remplir une boîte de 60 mm de Pétri bordée de 500 microns maille polyester avec 5% Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Pipetter prudemment 20 - 30 4 cellules ou 8 cellules d&#39;embryons dans le plat. </li><li> En utilisant une boucle de cheveux 14, manipuler les embryons afin que le blastomère à injecter est tournée vers l&#39;aiguille. Pour cibler le rein gauche, aligner les embryons de sorte que les blastomères ventrales gauche d&#39;embryons 4 cellules ou blastomères V2 gauche des embryons à 8 cellules face à l&#39;aiguille. </li><li> Injecter 10 nl de solution d&#39;injection dans le blastomère choisi de chaque embryon dans le plat. Remarque: Le maillage au fond de la boîte de Petri stabilise les embryons et les empêche de rouler, en leur permettant d&#39;être injectées sans l&#39;utilisation d&#39;une boucle de cheveux pour la stabilisation. </li><li> Transfert injecté embryons dans des puits d&#39;une plaque de culture qui ont été remplis avec 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Incuber l&#39;embryon injectés à 16 ° C pendant au moins une heure pour permettre aux blastomères injectés à guérir. </li><li> Transférer les embryons cicatrisées dans les puits d&#39;une nouvelle plaque de culture qui ont été remplis de 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine par étape 9 (avant gastrulation). </li><li> Incuber les embryons à 14-22 ° C jusqu&#39;à ce que les embryons atteignent stade 38 - 40 21. </li></ol> 4. Fixation et immunocoloration des Embryons <ol><li> Préparer 50 ml de sulfate de MOPS / EGTA / magnésium / formaldéhyde tampon [MEMFA: 100 mM de MOPS (pH 7,4), 2 mM d&#39; EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldéhyde]. </li><li> En utilisant une pipette de transfert, mettre 10 - 20 étape 38 - 40 embryons dans un flacon en verre. Ajouter 10 pi 5% benzocaïne dans 100% d&#39;éthanol dans le flacon et inverti flacon pour mélanger. Attendre 10 min pour anesthésier les embryons. </li><li> Retirer le RMM du flacon à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre. Si le traitement de plusieurs flacons en même temps, les flacons peuvent être maintenus en position verticale dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits. </li><li> Avec un tube de verreTTE, remplir le flacon avec MEMFA. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Retirer la MEMFA du flacon à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre. Remplissez le flacon avec 100% de méthanol. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 10 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage une fois de plus, et de stocker les embryons dans 100% de methanol pendant une nuit à -20 ° C. </li><li> Préparer 1x solution saline tamponnée au phosphate-sérum-albumine bovine-Triton (PBT): 1 x PBS, 2 mg / ml de sérum-albumine bovine, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps primaire: 1x PBT avec 10% de sérum de chèvre à une dilution 1: 5 de l&#39; anticorps monoclonal de souris 4A6 anticorps (pour marquer les membranes des tubules intermédiaires distale et de liaison 20), une dilution à 01:30 d&#39; un anticorps monoclonal de souris 3G8 (à la lumière de l&#39; étiquette des tubules proximaux 20), et une dilution 1: 250 d&#39;anticorps polyclonal de lapin de RFP (pour étiqueter le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer le secondasolution d&#39;anticorps de ry: 1x PBT avec du sérum de chèvre 10%, 1: 500 Alexa 488 chèvre anti-IgG de souris (concentration en stock 2 mg / ml, à l&#39;étiquette 4A6 et 3G8), et 1: 500 Alexa 555 chèvre anti-IgG de lapin (stocks concentration de 2 mg / ml, pour marquer le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C, recouvrant le tube en aluminium pour protéger de la lumière. </li><li> Vous pouvez également recueillir les anticorps primaires et secondaires après coloration, et enregistrer à 4 ° C pour une réutilisation dans des expériences futures. Si l&#39;anticorps doit être sauvegardé pour réutilisation, ajouter l&#39;azide de sodium à 0,01%. </li><li> Immunocoloration les embryons en utilisant des protocoles établis 18. </li></ol> 5. Visualisation des embryons et l&#39;analyse des tissus ciblés pronephrique <ol><li> Tamiser les embryons immunohistochimique pour vérifier que le bon blastomère a été injecté en affichant la fluorescence du traceur fluorescent sous un stéréomicroscope à 1X (pour voir l&#39;embryon entier) et 5X (pour voir rein) grossissement. Placer les embryons dans une plaque de verre multi-bien avec le nouslls remplis 1x PBT à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert avec la pointe coupée. Manipuler les embryons avec une boucle de cheveux. Utiliser uniquement les embryons qui ont la co-injecté traceur présent dans le pronéphros sur le côté gauche de l&#39;embryon (figure 3C, et la figure 4C F, F) pour une surexpression du gène ou de l&#39; analyse knock - down. </li><li> Vous pouvez également effacer les embryons dans Murray Effacer (2 parties de benzoate de benzyle: 1 partie alcool benzylique) en plaçant les embryons dans un flacon en verre et remplir le flacon avec Murray Clear. Visualisez les embryons en utilisant une plaque de puits de verre. Remarque: Murray Clear est un solvant organique, et doit être manipulé avec précaution. Porter des gants, et utiliser uniquement des flacons en verre et pipettes avec Murray Clear. </li><li> embryons Conserver à 4 ° C dans 1x PBT pendant 2 - 3 semaines. Pour le stockage à long terme des embryons, les embryons déshydrater en lavant deux fois dans 100% de methanol à la température ambiante pendant 10 min. Conserver les embryons à -20 ° C dans 100% de méthanol. </li></ol>

<ol><li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+kidney+development%3A+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li>
<li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li>
<li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).</li>
<li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li>
<li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84(2008).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+Berl%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li>
<li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cleavage+stage+origin+of+Spemann%27s+Organizer%3A+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li>
<li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li>
<li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li>
<li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+expression+of+the+Wilms%27+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis.+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).</li>
<li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li>
<li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li>
<li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Xenopus+pronephric+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).</li>
<li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li>
<li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+%28LFB1%29+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li>
<li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Cibler les pronéphros de développer des embryons de xénope repose sur l&#39; identification et l&#39; injection de la bonne blastomère. L&#39; injection de la blastomère V2 des embryons à 8 cellules cible les pronéphros gauche 18. Cela laisse les pronéphros controlatérale droite comme un contrôle interne. Si morpholino knockdown ou d&#39;ARN surexpression est utilisé pour modifier le développement du rein, les pronéphros controlatérale droite peuvent être utilisés pour comparer les effets de knockdow...

Le rein embryonnaire de Xenopus, les pronéphros, est un bon modèle pour étudier le développement du rein et de la maladie. Les embryons se développent à l&#39;extérieur, sont de grande taille, peuvent être produites en grand nombre, et sont facilement manipulés par microinjection ou des interventions chirurgicales. En outre, les gènes qui régissent le développement du rein chez les mammifères et les amphibiens sont conservés. Reins de mammifères progresser à travers trois étapes: les pronéphros, mésonéphros et métanéphros 1, tandis que les amphibiens embryonnaires ont un pronéphros et amphibiens adultes ont un métanéphros. L&#39;unité de filtrage de base de ces formes de rein est le néphron, et les mammifères et les amphibiens nécessitent les mêmes cascades de signalisation et des événements inductifs à subir néphrogenèse 2, 3. Le pronéphros Xenopus contient un seul néphron composé de proximal, intermédiaire, distale et reliant tubules, et un glomus (analogue au niveau du glomérule chez les mammifères) , 1, 4-6 (figure 1 </strong&gt;). Le seul grand néphrons présent dans les pronéphros Xenopus le rend approprié comme un modèle simple pour l&#39;étude des gènes impliqués dans les processus de développement du rein et de la maladie. Cartes Cell sort ont été établis pour les premiers embryons de xénope et sont librement disponibles en ligne à Xenbase 7-11. Ici, nous décrivons une technique de micro - injection de traceurs de la lignée de cibler pronéphros Xenopus développement, bien que la même technique peut être adaptée pour cibler d&#39; autres tissus tels que le cœur ou les yeux. traceurs sont des marqueurs de la lignée (y compris les colorants vitaux, les dextranes marqués par fluorescence, des enzymes détectables par voie histochimique et l&#39;ARNm codant pour des protéines fluorescentes, etc.) qui peuvent être injectés dans un blastomère précoce, permettant la visualisation de la descendance de cette cellule au cours du développement. Ce protocole utilise MEM-RFP ARNm, membrane de codage cible rouge protéine fluorescente 12, comme traceur de la lignée. La technologie de micro-injection cibléeniques pour blastomères individuels dans des embryons de 4 et 8 cellules décrites ici peuvent être utilisées pour l&#39;injection avec morpholinos pour abattre l&#39;expression des gènes, ou avec de l&#39;ARN exogène pour surexprimer un gène d&#39;intérêt. En injectant dans la ventrale, blastomère végétale, principalement les pronéphros de l&#39;embryon seront ciblés, laissant les pronéphros controlatéral comme un contrôle de développement. Co-injection d&#39;un traceur vérifie que le bon blastomère a été injecté, et montre quels tissus dans l&#39;embryon est née de la blastomère injecté, en vérifiant le ciblage des pronéphros. Immunocoloration des pronéphros permet la visualisation de la façon dont les tubules pronephrique ont été ciblés. Surexpression et knockdown effets peuvent ensuite être marqué contre le côté opposé de l&#39;embryon, qui sert de contrôle du développement, et peuvent être utilisés pour calculer l&#39;indice pronephrique 13. La disponibilité des cartes du destin cellulaire permet cette technique de micro-injection ciblée pour être utilisée pour cibler les tissus OTHer que les pronéphros, et co-injection d&#39;un traceur fluorescent permet de microinjection ciblée pour chaque tissu à vérifier avant l&#39;analyse. Pendant embryon microinjection, la température de développement doit être réglementé étroitement, étant donné que le taux de développement de Xenopus est très dépendante sur elle 14. Les embryons doivent être incubés à des températures plus fraîches (14 - 16 ° C) pour les injections 4 et 8 cellules parce que le temps de développement est ralenti. A 22 ° C, le temps de développement de l&#39;étape 1 (1 cellule) à l&#39;étape 3 (4 cellules) est d&#39;environ 2 heures, tandis que à 16 ° C le temps de développement à l&#39;étape 3 est d&#39;environ 4 heures. Il faut environ 15 minutes pour aller d&#39;un embryon 4 cellules à une 8 cellules (stade 4) embryon à 22 ° C, mais il faut environ 30 minutes à 16 ° C. De même, à 22 ° C, il ne prend que 30 minutes pour un embryon de 8 cellules de progresser à un embryon de 16 cellules (étape 5). Ce temps est augmenté à 45 minutes à 16 ° C. lerefore, il est utile de ralentir le rythme des embryons de développement pour permettre assez de temps pour les injections au stade 8 cellules avant que les embryons progressent au stade 16 cellules. En outre, des températures de croissance peuvent être modulées pour accélérer ou ralentir le développement embryonnaire jusqu&#39;à ce que le rein a pleinement développé. L&#39;épiderme des embryons de xénope têtard stade est relativement transparent, permettant une imagerie facile des pronéphros en développement sans dissection ou de compensation du tissu 15. En raison de la relative transparence des embryons de xénope, imagerie des cellules vivantes est également possible 16,17. Whole monture immunocoloration pour visualiser les pronéphros est possible avec des anticorps établis qui étiquettent proximale, intermédiaire, distale et tubules de connexion de l&#39; étape 38 - 40 embryons qui permettent d&#39;évaluer le développement pronephrique après manipulation de l&#39; expression du gène ciblé dans les embryons de xénope 18-20.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Solution de gentamycine, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine, 99 %+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Incubateur de paillasse pour embryons.</td></tr><tr>Plasmide <td></td><td></td><td>Gap43-RFP</td><td>Pour la fabrication de l’ARN traceur. Réf. : Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Rhodamine dextran, 10 000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Qualité biologie moléculaire, USP eau purifiée stérile</td><td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de remplacement Drummond 7</td>" <td>Aiguilles de micro-injection</td> <td>Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td>.</tr><tr><td>Extracteur d’aiguille</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>Pour casser la pointe de l’aiguille de microinjection.</td></tr><tr><td>Micro-injecteur</td> <td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td>.</tr><tr><td>Huile minérale, lourde</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Huile pour aiguilles.</td></tr><tr><td>27 G Aiguille hypodermique monoject</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>Pour charger l’huile minérale dans l’aiguille de micro-injection.</td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lok</td><td>BD</td><td>de</td> 5 ml <td>309646 Pour charger l’huile minérale dans l’aiguille de micro-injection.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 microns Maille polyester</td><td>Petites pièces</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Pour le transfert d’embryons. Coupez l’embout pour que les embryons soient facilement absorbés par la pipette.</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 6 puits</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Flacon à vis</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>Pour fixer, colorer et stocker les embryons.</td></tr><tr><td>Cellule à 24 puits Plaque de culture</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x poudre</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumen sérique bovin</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Mini rocker 3D, modèle 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre, origine néo-zélandaise</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal 3G8</td><td>Centre de ressources européen sur le xénope</td> Anticorps primaire à marquer proximal <td></td><td> Tubules.</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal 4A6</td> Centre <td></td><td>européen de ressources sur le xénope</td><td>Anticorps primaire pour marquer les tubules intermédiaires, distaux et connectants.</td></tr><tr><td>anticorps anti-RFP pAb, IgG purifiés/MBL</td><td></td><td>PM005</td><td>de lapin Anticorps primaire pour marquer le traceur Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Anticorps secondaire pour marquer les tubules rénaux.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 chèvre anti-lapin IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Anticorps secondaire pour marquer le traceur Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>9 Plaque de cavité</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Facultatif - pour éliminer les embryons</td></tr><tr><td>Alcool benzylique</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Facultatif - pour éliminer les embryons</td></tr></tbody></table>

technique à la cible microinjection du developing<em&gt; xenopus</em&gt; kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Le rein embryonnaire de Xenopus laevis (grenouille), pronéphros, se compose d&#39;un seul néphron, et peut être utilisé comme modèle pour les maladies rénales. Embryons de Xenopus sont grandes, à développer l&#39; extérieur et peuvent facilement être manipulés par micro - injection ou des interventions chirurgicales. En outre, les cartes du destin ont été établis pour les premiers embryons de xénope. microinjection ciblée dans le blastomère individu qui finira par donner naissance à un organe ou d&#39;un tissu d&#39;intérêt peut être utilisé pour surexprimer sélectivement ou renverser l&#39;expression des gènes dans cette région restreinte, ce qui diminue les effets secondaires dans le reste de l&#39;embryon en développement. Dans ce protocole, nous décrivons comment utiliser des cartes de destin Xenopus établies pour cibler le rein en développement Xenopus (les pronéphros), par microinjection dans blastomère spécifique d&#39;embryons 4 et 8 cellules. L&#39;injection de traceurs de lignée permet de vérifier le ciblage spécifique de l&#39;injection.Après les embryons se sont développés à l&#39;étape 38 - 40, toute monture immunocoloration est utilisé pour visualiser le développement pronephrique, et la contribution des cellules ciblées aux pronéphros peut être évaluée. La même technique peut être adaptée pour cibler d&#39;autres types de tissus, en plus des pronéphros.

Microinjections de 4 et 8 cellules d&#39; embryons de xénope avec MEM-RFP ARNm montrent différents niveaux de ciblage pour les pronéphros. La figure 4 montre la scène 40 embryons avec des motifs appropriés d&#39;expression de l&#39; ARNm MEM-DP. Les embryons ont été injectés dans le blastomère ventral gauche (figure 4A), et triés pour le motif d&#39;expression correcte du MEM-DP ARNm. En plus d&#39;exprimer MEM-RFP dans le proximal, intermédiair...

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser des cartes de destin et des traceurs de lignées pour cibler les injections dans des blastomères individuels qui donnent naissance au rein d’embryons de Xenopus laevis.

Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

L'objectif général de cette procédure est de diriger des micro-injections vers le rein en développement de Xenopus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que la manière dont le rein se forme et quelles sont les gènes importants pour ce processus. Le principal avantage de cette technique est qu'elle maximise l'acheminement des réactifs micro-injectés vers un tissu ciblé.La visualisation de cette méthode est importante car l'identification du blastomère correct pour la microinjection ciblée est essentielle. Pour commencer cette procédure, les deux testicules ont été isolés d'un seul mâle de grenouille et placés dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie de 10 millilitres de solution de conservation des testicules. Ensuite, conserver les testicules à quatre degrés Celsius.Ensuite, les œufs ont été collectés à partir d'une grenouille femelle dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Éliminer l'excès d'eau de la boîte de Pétri. Après cela, découper un quart d'un testicule dans la solution de conservation des testicules.Transférez le morceau de testicule dans la boîte de Pétri contenant les œufs. Ensuite, découpez la portion de testicule en petits morceaux. Ajoutez du MMR contenant de la gentamicine dans la boîte de Pétri afin de recouvrir les œufs.Les mélanger en faisant tourner doucement la boîte et attendre environ 30 minutes afin que la fécondation ait lieu à température ambiante. Après la fécondation, le côté pigmenté des embryons doit être orienté vers le haut. Retirer le MMR de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette de transfert et ajouter suffisamment de solution de dégélatinage pour recouvrir les embryons.Ensuite, agiter doucement la boîte pendant les quelques minutes suivantes afin de dissoudre la couche gélatineuse des embryons. Une fois que les embryons sont en contact étroit les uns avec les autres au centre de la boîte, la couche gélatineuse a été retirée. Éliminer la solution de dégelée à l’aide d’une pipette de transfert.Ensuite, laver les embryons dégélifiés 3 à 5 fois dans du MMR additionné de gentamicine en versant soigneusement le MMR et en remplissant la boîte avec du nouveau MMR. Ne pas retirer tout le MMR de la boîte, ce qui pourrait endommager les embryons. Par la suite, retirer les œufs non fécondés ou les fragments de testicule présents dans la boîte de Pétri.Pour échelonner leur développement, placer la moitié des embryons issus d'une même fécondation dans une boîte de Pétri maintenue à 14 degrés Celsius, et l'autre moitié des embryons dans une boîte de Pétri maintenue à 18 degrés Celsius. Les embryons se développeront plus lentement à 14 degrés Celsius qu'à 18 degrés Celsius, permettant ainsi plusieurs séries d'injections à partir d'une seule ponte fécondée.Préparez la solution d'injection contenant 0,01 nanogramme par nanolitre d'ARNm de protéine fluorescente rouge liée à la membrane. Pendant que les embryons se développent jusqu'au stade 4 cellules ou 8 cellules. Conservez la solution d'injection sur de la glace jusqu'à son utilisation.Ensuite, insérez un tube capillaire en verre de rechange de sept pouces dans un tire-embout avec le haut du tube de rechange aligné sur le haut du boîtier du tire-embout. Réglez la valeur de chaleur deux à 800 et la valeur de traction à 650, puis appuyez sur le bouton de traction pour former l'embout. Après cela, coupez l'extrémité de l'embout étiré à l'aide d'une pince Dumont.Glissez le collier de micropipette à l'arrière de l'aiguille. Ensuite, glissez le joint torique à gros trou à l'arrière de l'aiguille, derrière le collier. Remplissez maintenant l'aiguille d'huile minérale à l'aide d'une aiguille hypodermique de calibre 27, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air dans l'aiguille.Insérez l'aiguille sur le piston du microinjecteur, en la positionnant dans le grand trou de l'entretoise en plastique blanc installée sur le piston. Fixez l'aiguille en resserrant le collier. Ensuite, appuyez et maintenez enfoncé le bouton « Empty » sur la boîte de commande du microinjecteur jusqu'à ce qu'il émette deux bips sonores.Ensuite, pipetez trois microlitres de solution d'injection sur un morceau de parafilm. Puis, insérez la pointe de l'aiguille dans la goutte de solution d'injection déposée sur le parafilm. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton « Remplir » sur la boîte de commande du microinjecteur afin d'aspirer la solution d'injection dans l'aiguille.Avant la microinjection, il est important de comprendre les premières divisions cellulaires de l'embryon de Xenopus. L'embryon unicellulaire possède un pôle animal fortement pigmenté et un pôle végétal blanc et riche en vitellus. Chez l'embryon à deux cellules, le premier clivage se produit généralement entre les côtés gauche et droit de l'embryon.Ces cellules contribuent de manière égale à la lignée pronephrétique. Le deuxième clivage divise les moitiés dorsale et ventrale de l'embryon, conduisant à un embryon à 4 cellules. Les cellules dorsales sont plus petites et contiennent moins de pigment que les cellules ventrales.Si l'injection s'effectue dans un embryon à 4 cellules, injecter le blastomère ventral gauche afin de cibler le rein gauche. La troisième division clive les côtés animal et végétal, donnant ainsi un embryon à 8 cellules.À ce stade, il existe quatre blastomères animaux et quatre blastomères végétatifs. Pour cibler le rein gauche d'un embryon à 8 cellules, injectez dans le blastomère végétal ventral gauche. Ensuite, remplissez une boîte de Pétri de 60 millimètres, tapissée d'un treillis en polyester de 500 microns, avec une solution de cinq pour cent de Fycol dans du MMR additionné de Gentamicine.Prélève soigneusement à la pipette de 20 à 30 embryons à 8 cellules et dépose-les dans la boîte. À l’aide d’une boucle capillaire, manipule les embryons de manière à ce que le blastomère à injecter soit orienté vers l’aiguille. Pour cibler le rein gauche, aligne les embryons de sorte que les blastomères végétatifs ventraux gauches des embryons à 8 cellules soient dirigés vers l’aiguille.Injecter 10 nanolitres de solution d'injection dans le blastomère sélectionné de chaque embryon dans la boîte. Ensuite, transférer les embryons injectés dans les puits d'une plaque de culture contenant 5 % de Fycol dans du MMR additionné de gentamicine. Incuber les embryons injectés à 16 degrés Celsius pendant environ une à deux heures afin de permettre la cicatrisation des blastomères injectés.Après cela, transférer les embryons microinjectés dans de nouveaux puits de la plaque de culture remplis de MMR additionné de gentamicine. Incuber les embryons à une température de 14 à 22 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade 38 à 40. Dans cette procédure, transférer 10 à 20 embryons aux stades 38 à 40 dans un flacon en verre.Ajouter 10 microlitres de benzocaïne à cinq pour cent dans de l'éthanol à 100 pour cent dans le flacon. Mélanger en retournant le flacon et attendre 10 minutes pour anesthésier les embryons. Ensuite, retirer le MMR du flacon et le remplir avec du MEMFA.Ensuite, placez-le sur une plateforme tridimensionnelle oscillante pendant une heure à température ambiante. Après une heure, retirez le MEMFA du flacon et remplissez-le avec du méthanol à 100 pour cent. Puis, placez le flacon sur une plateforme tridimensionnelle oscillante pendant dix minutes à température ambiante.Répétez cette étape de lavage une fois de plus et conservez les embryons dans du méthanol à 100 % pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius. Les embryons sont désormais fixés et prêts pour l'immunomarquage. Ce schéma indique quel blastomère injecter pour cibler le pronephros gauche des embryons de Xenopus au stade 8 cellules en utilisant de l'ARNm de protéine fluorescente rouge liée à la membrane comme traceur.La localisation du traceur après injection dans le blastomère végétal ventral gauche est indiquée en rouge, tandis que le rein est marqué en vert. Cette image montre que le rein a été coloré en vert avec les anticorps 3G8 et 4A6. Voici un agrandissement de la région rénale montrant la localisation du traceur, et voici l'image fusionnée illustrant la co-localisation du traceur avec le rein.L'image confocale présentée ici montre un rein d'embryon prélevé sur un second embryon, coloré avec les anticorps 3G8 et 4A6. On observe la localisation du traceur rouge dans le rein et les tissus environnants, ainsi qu'une image fusionnée mettant en évidence la co-localisation des traceurs 3G8 et 4A6 dans le rein. Avant de réaliser cette procédure, il est important de se familiariser avec l'embryon précoce de *Xenopus*.Cela vous permettra de cibler correctement les micro-injections grâce à la carte de repères établie pour Xenopus. Une fois maîtrisée, cette technique peut être adaptée pour cibler d'autres tissus, tels que le tube neural ou le cœur.

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ici nous démontrons micro-injection cytoplasmique de...

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

Des cultures d&#39;explants neuraux de<em&gt; Xenopus laevis</em

Cette vidéo décrit une technique de micro-injection d’embryons pour délivrer des composés dans le sac vitellin du poisson-zèbre.

Microinjection d’embryons : une technique pour délivrer un composé dans le jaune de poisson-zèbre

Cette vidéo démontre la micro-injection intraveineuse de néphrotoxines dans la veine de la queue d’un embryon de poisson-zèbre pour étudier leurs effets chimiques sur la fonction rénale.

Micro-injection intraveineuse de néphrotoxines dans l’embryon de poisson-zèbre : une technique pour administrer des agents néphrotoxiques dans la circulation sanguine de l’embryon de poisson-zèbre

Méthodes qui produisent des embryons morphant sont indispensables pour étudier les mécanismes de développement et les réseaux de régulation génétique. L'étoile de mer Patiria miniata est un système de modèle émergent de ces études. Nous présentons ici un protocole pour obtenir des gamètes, la production de cultures d'embryons, et la micro-injection rapide de zygotes de cette espèce.

Une méthode pour micro-injection de Patiria minata zygotes

Le manuscrit ici fournit un jeu simple de méthodes pour analyser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par fluorescence dans Xenopus. Ceci permet d'obtenir un contexte pour tester la capacité des autres protéines de modifier la distribution de ligand et en permettant des expériences qui peuvent donner un aperçu des mécanismes de régulation des gradients de morphogènes.

Utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

Des procédures optimisées pour l’isolement des follicules uniques, les micro-injections d’ARN cytoplasmique, l’élimination des couches cellulaires environnantes et l’expression des protéines dans les ovocytes de xénope sont décrites. En outre, une méthode simple pour des changements rapides de solution dans des expériences électrophysiologiques avec des canaux ioniques ligand-dépendants est présentée.

Xenopus Ovocytes: Méthodes optimisées pour microinjection, suppression des couches de cellules folliculaires, et les changements de solution rapide dans les expériences électrophysiologiques

Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .

Visualisation et analyse quantitative de l&#39;angiogenèse embryonnaire dans<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Découvrez la microinjection ciblée dans le rein en développement de Xenopus laevis. Cette technique permet d'étudier la formation rénale et les gènes impliqués dans ce processus embryonnaire essentiel.

Technique à la cible microinjection du Developing

Explorer plus de vidéos