Technique à la cible microinjection du Developing Xenopus Kidney

L’objectif global de cette procédure est de cibler les micro-injections dans le rein de xénope en développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que la formation du rein et les gènes importants pour ce processus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle maximise l’administration de réactifs micro-injectés à un tissu ciblé.

La visualisation de cette méthode est importante car l’identification du blastomère correct pour la micro-injection ciblée est essentielle. Pour commencer cette procédure, les deux testicules ont été isolés d’une seule grenouille mâle et placés dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie de 10 millilitres de solution de stockage des testicules. Stockez ensuite les testicules à quatre degrés Celsius.

Ensuite, des œufs ont été prélevés sur une grenouille femelle dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Videz l’excès d’eau de la boîte de Pétri. Après cela, coupez un quart d’un testicule dans la solution de stockage des testicules.

Transférez le morceau de testicule dans la boîte de Pétri contenant les œufs. Par la suite, coupez la partie du testicule en petits morceaux. Ajoutez du ROR et de la gentamycine dans la boîte de Pétri pour couvrir les œufs.

Mélangez-les en remuant le plat, puis attendez environ 30 minutes pour que la fécondation ait lieu à température ambiante. Après la fécondation, le côté pigmenté des embryons doit être orienté vers le haut. Retirez le ROR de la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette de transfert et ajoutez suffisamment de solution de dégelée pour couvrir les embryons.

Ensuite, faites tourner le plat pendant les prochaines minutes pour dissoudre la couche de gelée sur les embryons. Une fois que les embryons se touchent étroitement au centre de la boîte, la couche de gelée a été retirée. Prélever la solution de dégelée à l’aide d’une pipette de transfert.

Ensuite, lavez les embryons dégelées 3 à 5 fois avec du ROR plus de la gentamycine en versant soigneusement le ROR et en remplissant le plat avec du nouveau ROR. N’enlevez pas tout le ROR de la boîte, ce qui pourrait endommager les embryons. Après cela, retirez tous les ovules non fécondés ou les morceaux de testicules de la boîte de Pétri.

Pour échelonner leur développement, placez la moitié des embryons d’une seule fécondation dans une boîte de Pétri maintenue à 14 degrés Celsius, et l’autre moitié des embryons dans une boîte de Pétri maintenue à 18 degrés Celsius. Les embryons se développeront plus lentement à 14 degrés Celsius qu’à 18 degrés Celsius. Permettant plusieurs séries d’injections à partir d’un seul embrayage fertilisé.

Préparez la solution injectable contenant le point zéro un nanogramme par nanolitre d’ARNm de protéine fluorescente rouge liée à la membrane. Alors que les embryons se développent jusqu’au stade 4 cellules ou 8 cellules. Conservez la solution d’injection sur de la glace jusqu’à utilisation.

Ensuite, chargez un tube capillaire en verre de remplacement de sept pouces dans un extracteur d’aiguille avec le haut du tube de remplacement aligné avec le haut du boîtier de l’extracteur d’aiguille. Réglez la valeur du numéro deux de chaleur sur 800 et la valeur de traction sur 650 et appuyez sur le bouton de traction pour tirer l’aiguille. Après cela, coupez la pointe de l’aiguille tirée avec une paire de pinces Dumont.

Glissez la pince de la micropipette sur le dos de l’aiguille. Ensuite, glissez le joint torique à grand trou à l’arrière de l’aiguille derrière la pince. Maintenant, remplissez l’aiguille d’huile minérale à l’aide d’une aiguille hyperdermique de calibre 27, en faisant attention de ne pas faire entrer de bulles d’air dans l’aiguille.

Glissez l’aiguille sur le piston du micro-injecteur, en insérant l’aiguille dans le grand trou de l’entretoise en plastique blanc installée sur le piston. Fixez l’aiguille en serrant la pince. Ensuite, maintenez enfoncé le bouton « Empty » du boîtier de commande du micro-injecteur jusqu’à ce qu’il y ait deux bips.

Ensuite, pipetez trois microlitres de solution d’injection sur un morceau de parafilm. Ensuite, insérez la pointe de l’aiguille dans le cordon de solution d’injection sur le parafilm. Appuyez sur le bouton « Fill » du boîtier de commande du micro-injecteur et maintenez-le enfoncé pour aspirer la solution injectable dans l’aiguille.

Avant la micro-injection, il est important de comprendre les divisions cellulaires précoces de l’embryon de xénope. L’embryon unicellulaire a un pôle animal à pigmentation foncée et un pôle végétal qui est blanc et jaune. Dans l’embryon à deux cellules, le premier clivage se produit généralement entre les côtés gauche et droit de l’embryon.

Ces cellules contribuent à parts égales à la lignée pronéphrique. Le deuxième clivage divise les moitiés dorsale et ventrale de l’embryon, conduisant à un embryon à 4 cellules. Les cellules dorsales sont plus petites et ont moins de pigment que les cellules ventrales.

Si vous injectez dans un embryon à 4 cellules, injectez le blastomère ventral gauche pour cibler le rein gauche. Le troisième clivage divise les côtés animal et végétal. Il en résulte un embryon de 8 cellules.

À ce stade, il y a quatre blastomères animaux et quatre blastomères végétaux. Pour cibler le rein gauche d’un embryon de 8 cellules, injectez dans le blastomère végétal ventral gauche. Par la suite, remplissez une boîte de Pétri de 60 millimètres doublée d’un maillage en polyester de 500 microns avec cinq pour cent de fycol en MMR plus Gentamycin.

Pipetez soigneusement 20 à 30 embryons de 8 cellules dans la boîte. À l’aide d’une boucle de cheveux, manipulez les embryons de manière à ce que le blastomère à injecter soit face à l’aiguille. Pour cibler le rein gauche, alignez les embryons de manière à ce que les blastomères végétaux ventraux gauches des embryons à 8 cellules fassent face à l’aiguille.

Injectez 10 nanolitres de solution d’injection dans le blastomère sélectionné de chaque embryon dans la boîte. Ensuite, transférez les embryons injectés dans les puits d’une plaque de culture avec cinq pour cent de fycol dans le ROR plus la gentamycine. Incuber les embryons injectés à 16 degrés Celsius pendant environ une à deux heures pour permettre aux blastomères injectés de guérir.

Après cela, transférez les embryons micro-injectés dans de nouveaux puits dans la plaque de culture remplie de MMR plus Gentamycin. Incuber les embryons à 14 à 22 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade 38 à 40. Dans cette procédure, transférez 10 à 20 embryons de stade 38 à 40 dans un flacon en verre.

Ajoutez 10 microlitres de benzocaïne à 5 pour cent dans de l’éthanol à 100 pour cent dans le flacon. Mélangez en inversant le flacon et attendez 10 minutes pour anesthésier les embryons. Ensuite, retirez le ROR de la fiole et remplissez-la de MEMFA.

Ensuite, placez-le sur une plate-forme à bascule tridimensionnelle pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, retirez le MEMFA du flacon et remplissez-le de méthanol à 100 %. Ensuite, placez le flacon sur une plate-forme à bascule tridimensionnelle pendant dix minutes à température ambiante.

Répétez cette étape de lavage une fois de plus et conservez les embryons dans du méthanol à 100 % pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius. Les embryons sont maintenant fixés et prêts pour l’immunomarquage. Ce schéma montre quel blastomère injecter pour cibler le pronéphros gauche des embryons de xénope au stade 8 cellules en utilisant l’ARNm de la protéine fluorescente rouge liée à la membrane comme traceur.

La localisation du traceur après injection dans le blastomère végétal ventral gauche est indiquée en rouge tandis que le rein est marqué en vert. Cette image montre que le rein était coloré en vert avec les anticorps 3G8 et 4A6. Voici une vue rapprochée de la région rénale montrant la loacalisation du traceur et voici l’image fusionnée montrant la co-localisation du traceur avec le rein.

Voici l’image confocale du rein d’un deuxième embryon coloré avec 3G8 et 4A6. Il s’agit de la localisation du traceur rouge dans le rein et les tissus environnants et voici l’image fusionnée montrant la co-localisation des traceurs 3G8 et 4A6 dans le rein. Avant d’effectuer cette procédure, il est important de se familiariser avec l’embryon de xénope précoce.

Cela vous permettra de cibler correctement les micro-injections grâce à la carte de fondue établie du xénope. Une fois maîtrisée, cette technique peut être adaptée pour cibler d’autres tissus comme le tube neural ou le cœur.