Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

L’objectif global de cette méthode est de suivre l’ensemble du processus de reproduction sexuée chez la levure à fission par microscopie optique. Cette méthode décrit la préparation de cellules de levure à fission pour l’imagerie en accéléré de diverses étapes du cycle de vie sexuelle, telles que le choix du partenaire d’accouplement, la croissance polarisée, la fusion cellule-cellule, la myose et la sporulation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser une seule cellule et de surmonter ainsi le problème que les cellules n’entrent pas dans la différenciation sexuelle de manière synchrone.

Cette méthode est très simple, mais la démonstration visuelle est utile pour montrer comment monter plusieurs souches en parallèle pour la microscopie. Laura Merlini, postdoc dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec ma doctorante Omaya Dudin. Il existe plusieurs variantes de ce protocole qui peuvent être adaptées pour étudier les différentes étapes du cycle de vie sexuel, en utilisant des souches homothalliques ou hétérothalliques.

Dans cette démonstration, des souches homothalliques H90 seront utilisées. Dans ces souches, le changement de type d’accouplement a lieu lors de la dernière division mitotique après la privation d’azote, ce qui entraîne un mélange des deux types d’accouplement. Le soir, deux jours avant l’expérience d’accouplement, inoculez des souches fraîchement striées à partir d’un milieu solide dans des tubes de culture contenant 3 millilitres de milieu de sporulation minimum avec de l’azote ou du MSL plus N. Incuber toute la nuit en agitant à 25 degrés Celsius.

Le lendemain matin, si nécessaire, diluez les suspensions cellulaires dans MSL plus N pour assurer une croissance exponentielle tout au long de la journée. Le soir, mesurez la densité optique et diluez les cellules dans 20 millilitres de MSL plus N dans des flacons de 100 millilitres à une densité optique de 025 Les cultures cellulaires de type sauvage devraient atteindre une densité optique de 600 d’environ 8 le lendemain matin. La dilution doit donc être ajustée en conséquence, si vous travaillez avec des souches avec des temps de génération plus longs.

Incuber les cultures pendant la nuit à 30 degrés Celsius en secouant. Le lendemain matin, mesurez la densité optique pour vérifier que chaque culture a une densité optique de 600 autour de 8. Granulez les cellules à 1000 x g pendant une minute et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre.

Lavez les cellules trois fois dans 1 millilitre de milieu de sporulation minimum sans azote ni MSL moins N.Après le dernier lavage, remettez les cellules en suspension dans 3 millilitres de milieu MSL moins N. Mesurez la densité optique et diluez les cellules à une densité optique 600 de 1,5. Pour commencer la préparation des coussinets d’agarose, faites d’abord fondre un aliquat de MSL moins N agarose 2 % dans un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes.

Entre-temps, granulez 100 microlitres de la suspension cellulaire préparée plus tôt à 1000 x g pendant une minute. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans les 2 à 4 microlitres de milieu résiduels. Avec les cellules en attente sur la paillasse, ajoutez 200 microlitres de milieu fondu sur une lame de verre entre deux entretoises.

Placez délicatement une autre lame sur l’agar-gélose fondue. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, retirez soigneusement les entretoises. Pour retirer la glissière en verre supérieure, tournez-la doucement et tirez-la sur le côté.

Si plusieurs souches doivent être imagées simultanément, le tampon peut être subdivisé en quatre mini-tampons. Pour cela, utilisez une lame de rasoir et fendez le tampon en son milieu en écartant les pièces d’environ 1 millimètre et répétez dans le sens perpendiculaire. Ajoutez 1 microlitre de cellules dans le tampon d’agarose et attendez environ une minute.

Couvrez les cellules avec une lamelle et scellez toute la périphérie de la lamelle avec du VELAP chauffé. Il est important de sceller l’ensemble de la lamelle pour éviter la dessiccation du tampon. Laissez le tampon reposer pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie.

Pour assurer le succès du protocole et une efficacité d’accouplement élevée, les cellules doivent être maintenues en croissance exponentielle jusqu’à ce qu’elles soient privées d’azote et montées sans excès de liquide afin qu’elles soient stationnaires sur le tampon d’agarose. L’imagerie des cellules vivantes des cellules de levure d’accouplement est ensuite effectuée à 25 degrés Celsius, ou température ambiante, en suivant la procédure décrite dans le texte du protocole. L’imagerie en accéléré permet de visualiser les cellules subissant un remaniement, une fusion et une sporulation dans les 24 heures qui suivent la privation d’azote.

Ce processus est illustré dans ce film représentatif par les deux cellules agrandies dans l’encart en bas à gauche. Ce protocole peut également être utilisé pour surveiller la dynamique des protéines marquées par fluorescence dans les cellules d’accouplement. Ici, une souche H hétérothallique exprimant myo52 marquée avec 3GFP a été accouplée avec une souche hétérothallique H+ exprimant myo52 fusionnée à la protéine tdTomato fluorescente rouge, ainsi qu’à la GFP cytosolique.

La GFP cytosolique permet de surveiller le moment de la fusion, visualisé par son entrée dans la cellule H. Ces images en accéléré montrent que myo52 s’est initialement formé dans des zones dynamiques dans tout le cortex cellulaire. Le signal Myo52 a ensuite été stabilisé dans un seul foyer juste avant l’événement de fusion.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les cellules pour un accouplement efficace et l’étude sur les cellules vivantes du processus d’accouplement de la levure de fission.