Name: Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Découvrez une méthode de différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en mélanocytes matures pigmentés via les étapes de crête neurale et mélanoblaste. Ce protocole permet une production à grande échelle pour la recherche sur les maladies pigmentaires et la découverte de médicaments.

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Ce travail a été soutenu par une bourse pour les chercheurs de mélanome de la Fondation M. Joanna Nicolay et par les Instituts nationaux de la santé en vertu de Ruth L. Award Research Service national Kirschstein F31. Ce travail a également été soutenu par des subventions de NYSTEM et l&#39;initiative sur les cellules souches Tri-institutionnelle (Starr Foundation).

NOTE: Le protocole de mélanocytes décrit ici a été démontrée par Mica et al. 1. Vaisselle Préparation du milieu de culture, enduit et entretien de hPSCs <ol><li> moyen Préparation Remarque: Conserver tout milieu à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 2 semaines. Filtrez tous les moyen de stérilisation. <ol><li> Préparer DMEM / 10% de FBS. Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml L-glutamine. Filtre pour la stérilisation. </li><li> Préparer CSEh moyen. Mélanger 800 ml de DMEM / F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamine, de 10 ml de MEM au moins une solution d&#39;acides aminés essentiels, 1 ml de ß-mercaptoethanol et 5 ml Pen / Strep. Après filtration à ajouter 10 ng / ml de FGF-2. </li><li> Préparer le milieu KSR-différenciation: Mélanger 820 ml de DMEM knock-out, 150 ml KSR, 10 ml de L-Glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution d&#39;acides aminés essentiels et 1 ml de β-mercaptoéthanol. Filtre pour la stérilisation. </li><li> Préparer le milieu N2-différenciation. Dissoudre 12 g DMEM / F12 poudre in dH 2 O. 980 Ajouter 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonate de sodium et 100 mg de transferrine humaine. Mélanger 2 ml de dH2Û avec 25 mg d&#39; insuline humaine et 40 pi de NaOH 1 N; Une fois dissous, ajouter le mélange au support. Ajouter 100 pi de dichlorhydrate de putrescine, 60 ul sélénite, 100 ul de la progestérone. Amener le volume final à 1 l avec dH 2 O avant de filtrer. </li><li> Préparer le milieu de mélanocytes complet. Mélanger 50% de milieu Neurobasal, 30% Low glucose DMEM, et 20% MCDB201. À ce module: 0,8% ITS + 250 nM de L-glutamine, 100 pM d&#39;acide ascorbique (L-AA), 50 ng de toxine / ml de choléra, 50 ng / ml de SCF, 0,05 uM de dexaméthasone, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . Filtre stérile puis ajouter les réactifs restants: supplément de 2% de B27, 25 ng / ml BMP4, 3 uM CHIR99021, 500 uM AMPc. </li></ol></li><li> Revêtement des plats Culture <ol><li> Effectuer le revêtement en utilisant la protéine gélatineux tel que Matrigel. Lors de l&#39;ouverture, aliquoter et congeler Matrigel dans 1 ml de pièces pour éviter le gel répétitif dégel cycles. Décongeler et re-suspendre une aliquote de 1 ml congelé avec 19 ml de DMEM / F12. Planche 5 ml sur un plat de 10 cm. Incuber les boîtes pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer la protéine gélatineuse immédiatement avant l&#39;étalement des cellules et laver avec DMEM / F12. </li><li> Effectuer le revêtement en utilisant Poly-L ornithine bromhydrate / souris laminine-I / fibronectine (PO / Lam / FN). Antenne Coat avec du PBS contenant 15 ug / Poly-L ml ornithine bromhydrate. Incuber O / N à 37 ° C dans un incubateur humidifié. Aspirer la solution et laver les plaques avec du PBS trois fois avant le revêtement avec du PBS contenant 1 pg / ml de laminine de souris-I et 2 pg / ml de fibronectine. Incuber les boîtes O / N à 37 ° C dans un incubateur humidifié. <ol><li> Avant le plaquage des cellules, aspirer la solution et on laisse les plaques sécher complètement sans couvercle dans la hotte de culture tissulaire. Laisser les plaques à sécher pendant environ 10-15 min. Remarque: Les plats sont secs et prêts pour le placage cellulaire lorsque des structures cristallines apparaissent à la surface par les yeux. Le plates peuvent être conservées avec du PBS contenant LAM / PN dans l&#39;incubateur pendant deux semaines, aussi longtemps que le liquide ne s&#39;évapore. Les plaques peuvent être conservées séchées à température ambiante pendant quelques heures. </li></ol></li></ol></li><li> Entretien de hPSCs Note: hPSCs sont maintenus à 0,1% de gélatine et de fibroblastes embryonnaires de souris mitotique inactivé (MEF) dans CSEh-moyen. Les cellules doivent être divisées tous les 6-8 jours. <ol><li> Enduire un plat de 10 cm avec 0,1% de gélatine dans du PBS à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Décongeler MEFs congelés rapidement dans un bain d&#39;eau à 37 °. </li><li> Aspirer la gélatine et de la plaque les cellules. FAE en plaques à une densité de ~ 50000 cellules / cm2 dans du DMEM / 10% de FBS. Incuber MEFs à 37 ° CO / N avant d&#39;ajouter hPSCs. </li><li> Aspirer le% de FBS DMEM / 10 à partir de la plaque MEF préparée, laver la plaque avec du PBS et ajouter 10 ml CSEh-milieu avec hPSCs. Le passage hPSCs dans un rapport de 1: 5/10 en fonction de la densité avant le repiquage. Remarque: Si les hPSCs sont décongelés ou repiquées comme des cellules individuelles, supcomplément avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate (Rocki) jusqu&#39;à ce que le premier passage. </li><li> Nourrissez cellules par jour avec des produits frais 10 ml CSEh-moyen. </li><li> Avant de commencer une différenciation éliminer toutes les colonies pluripotentes qui semblent contenir des cellules différenciées, des bords irréguliers, ou des centres transparents 28. Déloger mécaniquement et aspirer les colonies irrégulières avec une pipette sous une hotte à flux laminaire avec un microscope à dissection. </li></ol></li></ol> 2. Placage de hPSCs pour Différenciation Remarque: Les conditions de différenciation sont décrites pour boîtes de 10 cm. <ol><li> Préparer 10 cm plats Matrigel avant de commencer la différenciation comme décrit à l&#39;étape 1.3.1. </li><li> Lorsque hPSCs placage pour une différenciation commencent avec une assiette de hPSCs à une densité prête pour le passage (~ 80% de confluence) aspirez le CSEh-milieu, laver avec du PBS et ajouter 3 ml de 0,05% de trypsine-EDTA aux cellules. </li><li> Vigoureusement secouer le plat horizontally pendant 2 minutes tout en visualisant sous le microscope jusqu&#39;à ce que le MEF décoller comme des cellules individuelles. Les colonies HPSC devraient rester attachés comme des colonies. </li><li> Aspirer le trypsine après le MEF ont levé, mais avant que les colonies de hPSCs détachent. </li><li> Ajouter 10 ml de CSEh-milieu contenant 10 uM Y-27632 dichlorhydrate à la plaque et détacher les cellules par pipetage de haut en bas sur les colonies. </li><li> Aspirer la solution Matrigel de l&#39;antenne de 10 cm préparé à l&#39;étape 2.1 et laver avec DMEM / F12 pour éliminer les grumeaux. Plate les hPSCs à un rapport 1: 2 sur la plaque Matrigel. Ajouter CSEh-milieu contenant 10 uM Y-27632 dichlorhydrate jusqu&#39;à 10ml. Incuber à 37 ° CO / N. Remarque: Ce placage devrait se traduire par environ 100 000 cellules / cm2. </li></ol> 3. Induction of Neural Différenciation Remarque: La différenciation doit être initié (jour 0), lorsque les hPSCs sont confluentes à 80%. Les cellules peuvent être nourris quotidiennement avec CSEh-moyencontenant 10 uM Y-27632 dichlorhydrate jusqu&#39;au début de la différentiation. <ol><li> Le jour 0 et le jour 1, nourrir les cellules avec 10 ml de milieu KSR-différenciation contenant 100 nM LDN193189 et 10 uM SB431542. </li><li> Le jour 2, nourrir les cellules avec 10 ml de milieu KSR-différenciation contenant 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542 et 3 uM CHIR99021. </li><li> Au jour 3, alimenter les cellules avec 10 ml de milieu KSR-différenciation contenant 10 uM SB431542 et 3uM CHIR99021. </li><li> Aux jours 4 et 5, l&#39;alimentation des cellules avec 15 ml de 75% de milieu KSR-différenciation et de 25% de milieu N2 contenant 3 uM de différenciation CHIR99021. Note: Ne vous inquiétez pas de voir une grande quantité de mort cellulaire en termes de cellules flottantes. Ceci est normal et à prévoir. </li><li> Aux jours 6 et 7 d&#39;alimentation des cellules avec 15 ml de 50% de milieu KSR-différenciation et de 50% de milieu N2 contenant à la fois la différenciation 3uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 et 100 nm EDN3. </li><li> Les jours 89 et l&#39;alimentation des cellules avec 20 ml de 25% de milieu KSR-différenciation et de 75% de milieu N2 contenant à la fois la différenciation 3uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 et 100 nm EDN3. </li><li> Les jours 9 et 10 préparer des plats PO / Lam / FN comme indiqué dans 1.2.2 pour re-placage des cellules le jour 11. </li><li> Au jour 10 cellules d&#39;alimentation avec 20 ml de milieu N2 contenant 3 uM différenciation CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 et 100 nm EDN3. </li></ol> 4. réensemencement en Droplets pour des spécifications NC <ol><li> Le jour 11 aspirée Lam / FN des PO / LAM / plaques préparées FN et sécher complètement. </li><li> Retirer moyen des cellules Jour 11, laver avec du PBS et ajouter 4 ml de solution de détachement des cellules telles que Accutase par boîte de 10 cm. Incuber pendant 25 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu complet mélanocytes dans le plat et remettre les cellules par pipetage manuellement de haut en bas avec une pipette de 10 ml jusqu&#39;à ce que toutes les cellules ont soulevé la plaque. Transférer la suspension dans un tube de 15 ml. </li><li> Faites tourner lacellules vers le bas pendant 5 minutes à 200 xg et remettre les cellules à 2 x 10 6 cellules par ml dans un milieu complet mélanocytes. Compter les cellules en utilisant l&#39;exclusion du bleu trypan sur un hémocytomètre ou technique équivalente. </li><li> Planche 10 pi gouttelettes proches les uns des autres (sans les toucher) sur les séchées PO / Lam / FN boîtes de 10 cm. Si la plaque a été suffisamment séchée, les gouttelettes auraient bien bords définis et ne pas courir. Note: Ceci crée un environnement local à haute densité pour les cellules, ce qui est important lorsque les plaquant les cellules, tout en maintenant la pièce dans la boîte d&#39;expansion. </li><li> Laisser les gouttelettes de se tenir à température ambiante pendant 10-20 min pour permettre aux cellules d&#39;adhérer, puis lentement (ne pas déranger les cellules attachées) ajouter 10 ml de milieu complet mélanocytes. Déplacer plat à l&#39;incubateur. </li></ol> 5. Expansion mélanocytes progéniteurs <ol><li> Continuer l&#39;alimentation avec un milieu de mélanocytes complet tous les 2 à 3 jours. Remarque: Pigmentation devrait commencer à être visible wurant amas de cellules à la fin de la première semaine et devenir très clair par la deuxième semaine. Voir la plaque sur un fond blanc, tel qu&#39;une feuille de papier pour discerner ces petites grappes sombres premières. Les cellules deviendront progressivement plus pigmentée au fil du temps, jusqu&#39;à ce que la totalité de la plaque est uniformément pigmentés (voir la figure 2B). </li><li> cellules Passage une fois par semaine à un rapport de ~ 1: 6 (dépôt sous forme de gouttelettes est plus nécessaire à ce stade). Utilisez Accutase pour dissocier les cellules et laver deux fois avec un milieu ordinaire Neurobasal avant de re-placage dans un milieu complet mélanocytes. Maintenir les cellules sur PO / LAM / plaques FN. Note: Nous avons constaté que le moyen complet mélanocytes est le mieux adapté pour le maintien et l&#39;expansion de CSEh et mélanocytes iPSC dérivées. Cependant, les cellules peuvent être cultivées dans brièvement disponibles dans le commerce à moyen M254 mais les médias simplifié augmente le risque de cellules mortes et de levage de la plaque. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont aucun intérêt à divulguer contradictoires.

Pour la différenciation réussie de mélanocytes de hPSCs les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Tout d&#39;abord, il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles en tout temps. En outre, il est important de commencer par pluripotentes, hPSCs complètement indifférenciées; si la population de départ contient des cellules différenciées, le rendement sera invariablement tomber que les contaminants ne peuvent pas être dirigées vers mélanocytes et peuvent encore perturber les c...

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) fournissent une plate - forme pour imiter la différenciation normale de façon évolutive pour la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et les thérapies de remplacement cellulaire 1-6. D&#39;un intérêt particulier, hPSCs ouvrent des pistes pour l&#39;étude difficile d&#39;isoler ou de types rares / transitoires cellulaires où les échantillons des patients sont rares. Les cellules souches pluripotentes En outre, induites (CSPi) permettent aux chercheurs d&#39;étudier le développement et la modélisation de la maladie d&#39;une manière spécifique au patient de démêler les mécanismes uniques 1,2,7-11. Le protocole précédemment publié pour la différenciation des mélanocytes de hPSCs nécessite jusqu&#39;à 6 semaines de différenciations et implique la culture de cellules avec un milieu conditionné à partir de cellules L-Wnt3a 12. Le premier protocole présenté par Mica et al. Et décrit ici produit des cellules pigmentées en trois semaines et supprime l&#39;ambiguïté et les incohérences associées à un milieu conditionné. mélanocytes are dérivé de la crête neurale, une population migratoire des cellules uniques aux vertébrés. La crête neurale est définie lors de la gastrulation et représente une population de cellules sur le bord de la plaque neurale, en bordure entre le neuronal et ectoderme non-neural. Au cours de la neurulation, le tissu nerveux évolue à partir d&#39; une plaque de neurones pour former des plis neuraux, qui convergent vers la ligne médiane dorsale entraînant la 13,14 du tube neural. Les cellules de la crête neurale émergent de la plaque de toit du tube neural, opposée à la notochorde et subissent une transition épithélio-mésenchymateuse avant de migrer loin de donner lieu à une population diverse de cellules différenciées. Le sort des cellules de la crête sont définies en partie par la localisation anatomique de la plaque de toit le long de l&#39;axe du corps de l&#39;embryon. les dérivés de cellules neurales comprennent des crêtes caractéristiques des deux lignées mésoderme (cellules musculaires lisses, les ostéoblastes, les adipocytes, les chondrocytes) et les cellules ectodermiques (mélanocytes, c Schwannaunes, neurones) 14. Les cellules souches de la crête neurale régulation positive du facteur de transcription SOX10 et peuvent être isolés par des cellules activées par fluorescence de tri avec des anticorps dirigés contre p75 et HNK1. Les cellules de la crête neurale Fated pour devenir mélanocytes passent par un stade de mélanoblaste et régulent positivement KIT et MITF (microphtalmie associée facteur de transcription) 6,21 MITF est un régulateur maître du développement des mélanocytes et est un facteur de transcription responsable du contrôle beaucoup du développement des mélanocytes 22- 24. mélanoblastes humaines migrent vers la couche basale de l&#39;épiderme où ils résident soit dans le renflement de cheveux ou entouré par les kératinocytes de l&#39;épiderme (unités formant pigmentaires) pour servir de précurseurs des mélanocytes, pigmentées matures. La différenciation et la maturation des mélanoblastes dans les melanocytes pigmentés se produit concomitant avec la colonisation du bulbe pileux et l&#39;expression de la filière de production de mélanine (TYRP1, TYR, et OCA2PMEL) 25,26. Isoler mélanocytes humains et mélanoblastes des patients est coûteux, difficile et de limiter en quantité. Ce protocole permet aux chercheurs de différencier hPSCs (induite ou embryonnaire) dans les mélanocytes ou des précurseurs de mélanocytes dans un procédé rapide, reproductible, évolutive et économique bien défini sans tri cellulaire. Le protocole a été précédemment utilisé pour identifier des défauts spécifiques de la maladie lors de la différenciation iPSCs des patients atteints de troubles de la pigmentation.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>apo transfert humain</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique (L-AA)</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>B27 (supplément B27)</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-bp</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>4423</td><td>6 mM</td></tr><tr><td>Toxine cholérique</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>AMPc (AMPc cyclique)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td>50 &mu ; M</td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11985-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Mélange de nutriments F-12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1133--032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>poudre Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>EDN3 (Endothéline-3, humain)</td><td>American Peptide Company</td><td>88-5-10B</td><td>100 &mu ; </td></tr><tr><td>M Fibronectine</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>200 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>de gélatine (PBS sans Mg/Ca)</td><td>en interne</td><td></td><td>0,1 % dans PBS</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Insuline humaine</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Universal Culture Supplement Premix&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>KSR (Knockout Serum Replacement)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Faible teneur en glucose DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>matrix BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Dissoudre 1:20 dans DMEM/F12</td></tr><tr><td>MCDB201 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>MEM minimum essential amino acids solution</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-080</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris (7 millions de cellules/flacon)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-8105M</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-I de souris</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline/Streptomycine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>Poly-L Bromhydrate d’omithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>15 mg/ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>0,032 g dans 100 ml 100 % éthanol</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (FGF humain recombinant basique)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1814</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Sélénite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SCF (Facteur de cellules souches humaines recombinantes)&nbsp ;</td><td>Peprotech Inc.</td><td>300-07</td><td>50 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>TYRP1 (G-17) Anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>10443</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorps TYRP2</td><td>Abcam</td><td>74073</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Tocris-R& D Systèmes</td><td>1254</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

dérivation libre feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines cellules souches

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) représentent une plate-forme pour étudier le développement humain in vitro dans des conditions normales et pathologiques. Les chercheurs peuvent orienter la différenciation des hPSC dans le type de cellule d’intérêt en manipulant les conditions de culture pour récapituler les signaux observés au cours du développement. L’un de ces types de cellules est le mélanocyte, une cellule productrice de pigments d’origine de la crête neurale (NC) responsable de la protection de la peau contre les rayons UV. Ce protocole présente une extension d’un protocole de différenciation de la crête neurale in vitro actuellement disponible à partir de hPSC pour différencier davantage les NC en mélanocytes entièrement pigmentés. Les précurseurs de mélanocytes peuvent être enrichis à partir du protocole Neural Crest via une exposition programmée à des activateurs de la signalisation WNT, BMP et EDN3 dans des conditions de double inhibition SMAD. Les précurseurs de mélanocytes résultants sont ensuite purifiés et matures en mélanocytes entièrement pigmentés par culture dans un milieu sélectif. Les mélanocytes résultants sont entièrement pigmentés et se colorent de manière appropriée pour les protéines caractéristiques des mélanocytes matures.

Ce protocole fournit un procédé pour dériver, les mélanocytes matures totalement pigmentées à partir hPSCs d&#39;une manière in vitro libre dispositif d&#39; alimentation, rentable et reproductible. Par contraste avec les Fang et al. Protocole précédemment établie pour les mélanocytes HPSC dérivés, le protocole décrit ne nécessite pas de milieu conditionné et diminue l&#39;exigence de temps. Le protocole Fang et al. , Utilise un milieu conditionné provenant d&#...

Ce travail décrit un protocole de différenciation in vitro pour produire pigmentées, mélanocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines par une crête neurale et mélanoblaste étape intermédiaire en utilisant un protocole de 25 jours sans alimentation.

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

L'objectif général de ce protocole est de différencier des cellules souches pluripotentes humaines en mélanocytes matures et entièrement pigmentés. Cette méthode peut aider à identifier les facteurs clés intervenant au cours du développement des mélanocytes. De plus, ce protocole nous permettra d'identifier les facteurs altérés lors du développement de maladies, ainsi que de cribler des médicaments importants dans le cadre de la découverte de nouveaux traitements.Le principal avantage de ce protocole est qu'il nous permet d'obtenir un grand nombre de mélanocytes entièrement pigmentés, alors que l'isolement de mélanocytes à partir de patients donne généralement un nombre relativement faible de cellules. Après avoir aliquoté et congelé la protéine gélatineuse, décongelez et resuspendez un aliquot de un millilitre dans 19 millilitres de DMEM f12.Ensuite, introduisez cinq millilitres de ce mélange dans une seule boîte de culture tissulaire de 10 centimètres. Après avoir préparé plusieurs de ces boîtes, procédez à leur incubation pendant une heure à température ambiante. Ensuite, commencez à préparer des boîtes recouvertes de PO, de laminine et de fibronectine en ajoutant d'abord du PBS contenant 15 microgrammes par millilitre de PO dans une boîte de culture.Incuber ensuite les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié. Après cela, aspirer la solution et laver les boîtes trois fois avec du PBS 1X. Poursuivre le revêtement en ajoutant 10 millilitres de PBS contenant 1 microgramme par millilitre de laminine 1 de souris et 2 microgrammes par millilitre de fibronectine.Ensuite, incuber les boîtes comme décrit précédemment. Pour commencer, ajouter 0,1 % de gélatine dans du PBS dans une boîte de 10 centimètres. Et laisser pendant cinq minutes à température ambiante.Pendant que cette plaque est en cours de revêtement, placer les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) congelés dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pour les décongeler rapidement. Ensuite, aspirer la gélatine du plat et ensemencer les MEF à une densité d'environ 50 000 cellules par centimètre carré dans du DMEM supplémenté avec 10 pour cent de sérum de veau fœtal. Après une incubation de la boîte pendant la nuit à 37 degrés Celsius, aspirer le milieu et laver la plaque de MEF préparée avec du PBS 1X.Procédez à l'ajout de 10 millilitres de milieu pour hESC préparé au préalable contenant des cellules souches pluripotentes humaines, abrégées en hPSC, dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Après avoir semé les cellules à une densité de 5 millions de cellules par boîte, incubez les plaques à 37 degrés Celsius sous 5 pour cent de dioxyde de carbone. Alimentez les cellules quotidiennement avec 10 millilitres de milieu frais pour hESC.Avant de commencer la différenciation, examiner la plaque à la recherche de colonies qui présenteraient des cellules différenciées, des bords irréguliers ou des centres transparents. Sous un microscope stéréo dans une hotte à flux laminaire, détacher mécaniquement toute colonie irrégulière à l’aide d’une pipette. Pour effectuer l’ensemencement avec une protéine gélatineuse telle que Matrigel, aliquoter d’abord la protéine en parties d’un millilitre et les congeler afin d’éviter des cycles répétés de congélation-décongélation.Ensuite, décongeler et resuspendre un aliquot congelé d'un millilitre avec 19 millilitres de DMEM F12. Procéder à la mise en place de cinq millilitres de ce mélange dans une boîte de 10 centimètres et incuber les boîtes pendant une heure à température ambiante. Par la suite, aspirer immédiatement la protéine gélatineuse juste avant de semer les cellules et rincer avec du DMEM F12. Pendant que cette boîte est en cours d'ensemencement, sélectionner une plaque où les hPSC présentent une confluence d'environ 80 %.Passez à l'aspiration du milieu des cellules souches embryonnaires humaines. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine-EDTA 0,05 % dans la plaque. Procéder à agiter vigoureusement la boîte horizontalement pendant deux minutes, jusqu'à ce que les MEF soient observées au microscope en train de se détacher sous forme de cellules isolées. Pendant ce temps, s'attendre à ce que les colonies de hPSC restent attachées à la plaque. Procéder ensuite à l'aspiration de la trypsine une fois que les MEF se sont détachées, mais avant que les colonies de hPSC ne se soient détachées.Ensuite, ajoutez dans la plaque 10 millilitres de milieu pour hESC contenant 10 micromolaire de Y-27632 dihydrochlorure, un inhibiteur de la protéine kinase ROCK. Puis détachez les cellules en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas au-dessus des colonies. Ensuite, retournez dans la boîte contenant une protéine gélatineuse et aspirez la solution.Lavez cette boîte avec du DMEM F12 pour éliminer tous les agrégats. Ensuite, ensemencez les hPSC dans un rapport de 1 à 2. Puis, ajoutez au plateau du milieu pour hESC contenant 10 micromolaire de Y-27632 dihydrochlorure jusqu'à 10 millilitres.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Alimenter les cellules quotidiennement avec un milieu supplémenté en inhibiteur de ROCK. Lorsque les cellules souches pluripotentes humaines atteignent une confluence de 80 %, commencer la différenciation neuronale et désigner ce moment comme le jour 0.Pour commencer la différenciation, nourrissez les cellules au jour 0 et au jour 1 avec 10 millilitres de milieu de différenciation KSR contenant 100 nanomolaire de LDN-193189, un inhibiteur de la MP, et 10 micromolaire de SB 431542, un inhibiteur de l’activine et de Nodal. Poursuivez au jour 2 en remplaçant le milieu par un milieu contenant les mêmes concentrations des inhibiteurs de BNP et de l’activine et de Nodal, ainsi que 3 micromolaires de CHIR99021, un agoniste de la voie Wnt. Ensuite, au jour 3, nourrissez les cellules avec le milieu de différenciation KSR, supplémenté uniquement avec 10 micromolaires de SB 431542 et 3 micromolaires de CHIR99021.Après avoir préparé un mélange de milieu de différenciation 75 %KSR et de milieu de différenciation 25 %N2 contenant également trois micromoles de l'agoniste de la voie Wnt, nourrissez les cellules avec 15 millilitres de ce liquide aux jours 4 et 5. Ensuite, aux jours 6 et 7, nourrissez les cellules avec 15 millilitres de milieu composé de 50 % de milieu de différenciation KSR et de 50 % de milieu de différenciation N2, supplémenté également avec trois micromoles de CHIR99021, 25 nanogrammes par millilitre de BMP4 et 100 nanomoles par litre de EDN3.Ensuite, aux jours 8 et 9, nourrissez les cellules avec 20 millilitres de milieu de différenciation 25 %KSR et 75 %N2 supplémenté avec les mêmes concentrations de facteurs utilisées aux jours 6 et 7. Poursuivez la différenciation neuronale au jour 10 en nourrissant les cellules avec 20 millilitres de milieu de différenciation N2 contenant trois micromoles de CHIR99021, 25 nanogrammes par millilitre de BMP4 et 100 nanomoles d’EDN3. Au jour 11, aspirez la solution des boîtes préalablement revêtues de PO lamanine 1 et de fibronectine.Ensuite, laissez les plaques découvertes dans une hotte de culture tissulaire pendant environ 10 à 15 minutes, afin de les laisser sécher complètement. Procédez ensuite à l'élimination du milieu des cellules du jour 11 et rincez-les avec du PBS. Ajoutez alors quatre millilitres de solution de détachement cellulaire dans la boîte et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.Après l'incubation, ajouter cinq millilitres de milieu complet pour mélanocytes dans la boîte. Resuspendre les cellules en pipetant manuellement plusieurs fois de haut en bas jusqu'à ce qu'elles se détachent de la plaque. Transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres et centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 200 ×g. Après avoir dénombré les cellules à l'aide de l'exclusion au bleu de Trypan et d'un hématimètre, les resuspendre dans du milieu complet pour mélanocytes à une densité de 2×10⁶ cellules par millilitre.Déposez des gouttelettes de 10 microlitres de la suspension cellulaire sur les boîtes enduites et séchées. Veillez à ce que les gouttelettes soient proches les unes des autres sans se toucher, qu'elles aient des bords bien définis et ne s'étalent pas. Pour permettre l'adhérence des cellules, laissez les gouttelettes reposer à température ambiante pendant 10 à 20 minutes.Ensuite, ajoutez lentement 10 millilitres de milieu complet pour mélanocytes dans la boîte, en prenant soin de ne pas perturber les cellules attachées. Puis, placez la boîte dans l'incubateur. Alimentez les cellules tous les deux à trois jours avec du milieu complet pour mélanocytes.Et s'attendre à observer une pigmentation en grappes de cellules d'ici la fin de la première semaine. Une fois par semaine, repiquer les cellules en les associant d'abord à une solution de détachement cellulaire comme décrit précédemment. Après avoir collecté et centrifugé les cellules, les laver deux fois avec un milieu neurobasal simple.Ensuite, repiquez les cellules à un ratio de un à six dans un milieu complet pour mélanocytes sur des boîtes revêtues de PO, de lamine 1 et de fibronectine. Après environ 30 jours de différenciation, les cellules apparaîtront fortement pigmentées, ce qui est facilement visible lorsqu'elles sont cultivées à forte densité ou formées en culot lors du passage.On voit ici une image en champ clair de cellules issues d'une lignée de cellules souches embryonnaires humaines transgéniques psox10 GFP, cultivées jusqu'au jour 11 du protocole de différenciation décrit, avant le repiquage des cellules. Des crêtes cellulaires sombres bien délimitées sont visibles dans ces cultures. Lorsque ces cultures ont été analysées pour le signal GFP, les crêtes sombres se sont révélées enrichies en cellules positives pour sox10.Étant donné que sox10 est un facteur de transcription surexprimé par les cellules souches de la crête neurale et maintenu dans les mélanoblastes, ces résultats suggèrent qu'au jour 11, cette méthode de différenciation enrichit les cellules qui donneront éventuellement naissance à des mélanocytes. En preuve de cela, au jour 20 du protocole, les cultures contenaient des mélanocytes non pigmentés, en cours de maturation et complètement matures et pigmentés. Au jour 25, les mêmes types de cellules sont observés dans les cultures.La présence de mélanocytes en cours de maturation et pigmentés dans ces préparations est confirmée par une coloration utilisant deux protéines impliquées dans la production de mélanine. La TYRP2, qui sert de marqueur à la fois des mélanoblastes et des mélanocytes, et la TYRP1, qui est un marqueur spécifique des stades tardifs des mélanocytes, exprimée uniquement ici dans les mélanocytes pigmentés. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être utilisé pour différencier des cellules souches pluripotentes humaines en mélanocytes matures et complètement pigmentés en 25 jours.Le protocole suit le développement normal des mélanocytes en passant d'abord par l'état de crête neurale, puis par la phase de mélanoblaste.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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