Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

L'objectif général de ce protocole est de différencier des cellules souches pluripotentes humaines en mélanocytes matures et entièrement pigmentés. Cette méthode peut aider à identifier les facteurs clés intervenant au cours du développement des mélanocytes. De plus, ce protocole nous permettra d'identifier les facteurs altérés lors du développement de maladies, ainsi que de cribler des médicaments importants dans le cadre de la découverte de nouveaux traitements.

Le principal avantage de ce protocole est qu'il nous permet d'obtenir un grand nombre de mélanocytes entièrement pigmentés, alors que l'isolement de mélanocytes à partir de patients donne généralement un nombre relativement faible de cellules. Après avoir aliquoté et congelé la protéine gélatineuse, décongelez et resuspendez un aliquot de un millilitre dans 19 millilitres de DMEM f12.

Ensuite, introduisez cinq millilitres de ce mélange dans une seule boîte de culture tissulaire de 10 centimètres. Après avoir préparé plusieurs de ces boîtes, procédez à leur incubation pendant une heure à température ambiante. Ensuite, commencez à préparer des boîtes recouvertes de PO, de laminine et de fibronectine en ajoutant d'abord du PBS contenant 15 microgrammes par millilitre de PO dans une boîte de culture.

Incuber ensuite les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié. Après cela, aspirer la solution et laver les boîtes trois fois avec du PBS 1X. Poursuivre le revêtement en ajoutant 10 millilitres de PBS contenant 1 microgramme par millilitre de laminine 1 de souris et 2 microgrammes par millilitre de fibronectine.

Ensuite, incuber les boîtes comme décrit précédemment. Pour commencer, ajouter 0,1 % de gélatine dans du PBS dans une boîte de 10 centimètres. Et laisser pendant cinq minutes à température ambiante.

Pendant que cette plaque est en cours de revêtement, placer les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) congelés dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pour les décongeler rapidement. Ensuite, aspirer la gélatine du plat et ensemencer les MEF à une densité d'environ 50 000 cellules par centimètre carré dans du DMEM supplémenté avec 10 pour cent de sérum de veau fœtal. Après une incubation de la boîte pendant la nuit à 37 degrés Celsius, aspirer le milieu et laver la plaque de MEF préparée avec du PBS 1X.

Procédez à l'ajout de 10 millilitres de milieu pour hESC préparé au préalable contenant des cellules souches pluripotentes humaines, abrégées en hPSC, dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Après avoir semé les cellules à une densité de 5 millions de cellules par boîte, incubez les plaques à 37 degrés Celsius sous 5 pour cent de dioxyde de carbone. Alimentez les cellules quotidiennement avec 10 millilitres de milieu frais pour hESC.

Avant de commencer la différenciation, examiner la plaque à la recherche de colonies qui présenteraient des cellules différenciées, des bords irréguliers ou des centres transparents. Sous un microscope stéréo dans une hotte à flux laminaire, détacher mécaniquement toute colonie irrégulière à l’aide d’une pipette. Pour effectuer l’ensemencement avec une protéine gélatineuse telle que Matrigel, aliquoter d’abord la protéine en parties d’un millilitre et les congeler afin d’éviter des cycles répétés de congélation-décongélation.

Ensuite, décongeler et resuspendre un aliquot congelé d'un millilitre avec 19 millilitres de DMEM F12. Procéder à la mise en place de cinq millilitres de ce mélange dans une boîte de 10 centimètres et incuber les boîtes pendant une heure à température ambiante. Par la suite, aspirer immédiatement la protéine gélatineuse juste avant de semer les cellules et rincer avec du DMEM F12. Pendant que cette boîte est en cours d'ensemencement, sélectionner une plaque où les hPSC présentent une confluence d'environ 80 %.

Passez à l'aspiration du milieu des cellules souches embryonnaires humaines. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine-EDTA 0,05 % dans la plaque.

Procéder à agiter vigoureusement la boîte horizontalement pendant deux minutes, jusqu'à ce que les MEF soient observées au microscope en train de se détacher sous forme de cellules isolées. Pendant ce temps, s'attendre à ce que les colonies de hPSC restent attachées à la plaque. Procéder ensuite à l'aspiration de la trypsine une fois que les MEF se sont détachées, mais avant que les colonies de hPSC ne se soient détachées.

Ensuite, ajoutez dans la plaque 10 millilitres de milieu pour hESC contenant 10 micromolaire de Y-27632 dihydrochlorure, un inhibiteur de la protéine kinase ROCK. Puis détachez les cellules en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas au-dessus des colonies. Ensuite, retournez dans la boîte contenant une protéine gélatineuse et aspirez la solution.

Lavez cette boîte avec du DMEM F12 pour éliminer tous les agrégats. Ensuite, ensemencez les hPSC dans un rapport de 1 à 2. Puis, ajoutez au plateau du milieu pour hESC contenant 10 micromolaire de Y-27632 dihydrochlorure jusqu'à 10 millilitres.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Alimenter les cellules quotidiennement avec un milieu supplémenté en inhibiteur de ROCK. Lorsque les cellules souches pluripotentes humaines atteignent une confluence de 80 %, commencer la différenciation neuronale et désigner ce moment comme le jour 0.

Pour commencer la différenciation, nourrissez les cellules au jour 0 et au jour 1 avec 10 millilitres de milieu de différenciation KSR contenant 100 nanomolaire de LDN-193189, un inhibiteur de la MP, et 10 micromolaire de SB 431542, un inhibiteur de l’activine et de Nodal. Poursuivez au jour 2 en remplaçant le milieu par un milieu contenant les mêmes concentrations des inhibiteurs de BNP et de l’activine et de Nodal, ainsi que 3 micromolaires de CHIR99021, un agoniste de la voie Wnt. Ensuite, au jour 3, nourrissez les cellules avec le milieu de différenciation KSR, supplémenté uniquement avec 10 micromolaires de SB 431542 et 3 micromolaires de CHIR99021.

Après avoir préparé un mélange de milieu de différenciation 75 %KSR et de milieu de différenciation 25 %N2 contenant également trois micromoles de l'agoniste de la voie Wnt, nourrissez les cellules avec 15 millilitres de ce liquide aux jours 4 et 5. Ensuite, aux jours 6 et 7, nourrissez les cellules avec 15 millilitres de milieu composé de 50 % de milieu de différenciation KSR et de 50 % de milieu de différenciation N2, supplémenté également avec trois micromoles de CHIR99021, 25 nanogrammes par millilitre de BMP4 et 100 nanomoles par litre de EDN3.

Ensuite, aux jours 8 et 9, nourrissez les cellules avec 20 millilitres de milieu de différenciation 25 %KSR et 75 %N2 supplémenté avec les mêmes concentrations de facteurs utilisées aux jours 6 et 7. Poursuivez la différenciation neuronale au jour 10 en nourrissant les cellules avec 20 millilitres de milieu de différenciation N2 contenant trois micromoles de CHIR99021, 25 nanogrammes par millilitre de BMP4 et 100 nanomoles d’EDN3. Au jour 11, aspirez la solution des boîtes préalablement revêtues de PO lamanine 1 et de fibronectine.

Ensuite, laissez les plaques découvertes dans une hotte de culture tissulaire pendant environ 10 à 15 minutes, afin de les laisser sécher complètement. Procédez ensuite à l'élimination du milieu des cellules du jour 11 et rincez-les avec du PBS. Ajoutez alors quatre millilitres de solution de détachement cellulaire dans la boîte et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.

Après l'incubation, ajouter cinq millilitres de milieu complet pour mélanocytes dans la boîte. Resuspendre les cellules en pipetant manuellement plusieurs fois de haut en bas jusqu'à ce qu'elles se détachent de la plaque. Transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres et centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 200 ×g. Après avoir dénombré les cellules à l'aide de l'exclusion au bleu de Trypan et d'un hématimètre, les resuspendre dans du milieu complet pour mélanocytes à une densité de 2×10⁶ cellules par millilitre.

Déposez des gouttelettes de 10 microlitres de la suspension cellulaire sur les boîtes enduites et séchées. Veillez à ce que les gouttelettes soient proches les unes des autres sans se toucher, qu'elles aient des bords bien définis et ne s'étalent pas. Pour permettre l'adhérence des cellules, laissez les gouttelettes reposer à température ambiante pendant 10 à 20 minutes.

Ensuite, ajoutez lentement 10 millilitres de milieu complet pour mélanocytes dans la boîte, en prenant soin de ne pas perturber les cellules attachées. Puis, placez la boîte dans l'incubateur. Alimentez les cellules tous les deux à trois jours avec du milieu complet pour mélanocytes.

Et s'attendre à observer une pigmentation en grappes de cellules d'ici la fin de la première semaine. Une fois par semaine, repiquer les cellules en les associant d'abord à une solution de détachement cellulaire comme décrit précédemment. Après avoir collecté et centrifugé les cellules, les laver deux fois avec un milieu neurobasal simple.

Ensuite, repiquez les cellules à un ratio de un à six dans un milieu complet pour mélanocytes sur des boîtes revêtues de PO, de lamine 1 et de fibronectine. Après environ 30 jours de différenciation, les cellules apparaîtront fortement pigmentées, ce qui est facilement visible lorsqu'elles sont cultivées à forte densité ou formées en culot lors du passage.

On voit ici une image en champ clair de cellules issues d'une lignée de cellules souches embryonnaires humaines transgéniques psox10 GFP, cultivées jusqu'au jour 11 du protocole de différenciation décrit, avant le repiquage des cellules. Des crêtes cellulaires sombres bien délimitées sont visibles dans ces cultures. Lorsque ces cultures ont été analysées pour le signal GFP, les crêtes sombres se sont révélées enrichies en cellules positives pour sox10.

Étant donné que sox10 est un facteur de transcription surexprimé par les cellules souches de la crête neurale et maintenu dans les mélanoblastes, ces résultats suggèrent qu'au jour 11, cette méthode de différenciation enrichit les cellules qui donneront éventuellement naissance à des mélanocytes. En preuve de cela, au jour 20 du protocole, les cultures contenaient des mélanocytes non pigmentés, en cours de maturation et complètement matures et pigmentés. Au jour 25, les mêmes types de cellules sont observés dans les cultures.

La présence de mélanocytes en cours de maturation et pigmentés dans ces préparations est confirmée par une coloration utilisant deux protéines impliquées dans la production de mélanine. La TYRP2, qui sert de marqueur à la fois des mélanoblastes et des mélanocytes, et la TYRP1, qui est un marqueur spécifique des stades tardifs des mélanocytes, exprimée uniquement ici dans les mélanocytes pigmentés. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être utilisé pour différencier des cellules souches pluripotentes humaines en mélanocytes matures et complètement pigmentés en 25 jours.

Le protocole suit le développement normal des mélanocytes en passant d'abord par l'état de crête neurale, puis par la phase de mélanoblaste.