Name: Cultiver des cellules primaires épithéliales nasales des enfants et des Reprogrammer dans les cellules souches pluripotentes induites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez la culture de cellules épithéliales nasales pédiatriques et leur reprogrammation en cellules souches pluripotentes induites. Cette méthode non invasive permet d'étudier l'asthme et les maladies respiratoires.

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Les auteurs tiennent à remercier le pluripotentes Facility de cellules souches et l&#39;imagerie confocale de base à l&#39;Hôpital pour enfants de Cincinnati. Ce travail a été soutenu par R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) et 2U19AI70235 (GKKH).

Le protocole suivant suit les directives du comité des institutions d&#39;éthique de la recherche humaine. 1. L&#39;échantillonnage de la muqueuse nasale NOTE: Obtenir des échantillons de sujets qui sont exempts de signes d&#39;infection virale des voies respiratoires. <ol><li> Préparer 15 ml frais conique avant la visite des participants et ajouter 2 ml BEGM (épithéliales bronchiques Cell Growth Medium) plus 20 ul stérile Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). </li><li> Ouvrir la cytologie brosse juste avant de prendre l&#39;échantillon, et être sûr de garder la brosse stérile et ne pas toucher à toutes les surfaces en dehors des surfaces nasales. </li><li> Demandez participant à rester assis et incliner la tête vers le plafond. Demandez plus petit ou plus d&#39;enfants agités sont assis sur leurs mains et / ou couché pour éviter swatting brosse loin. </li><li> Visez la brosse à l&#39;arrière du nez où le passage se rétrécit (On dirait un petit trou noir). Faites glisser la brosse vers le bas et tordre les poignets lorsque la brosse est retirée de nostril. </li><li> Placez la brosse dans conique et plonger dans BEGM. Coupez la brosse en excès et replacer le bouchon sur le tube. NE PAS VORTEX. NOTE: Si le participant est prêt, obtenir une deuxième brosse de la même manière, mais dans la seconde narine. L&#39;obtention d&#39;un brossage des deux narines se traduira par une forte probabilité que l&#39;échantillon sera couronné de succès. L&#39;échantillonnage de la même narine peut entraîner des saignements et ne sera probablement pas améliorer l&#39;échantillon. </li><li> Garder les échantillons aussi près de 37 ° C que possible pendant le transport en utilisant un bécher avec de l&#39;eau chaude. </li></ol> 2. Cell Count et Cytospin <ol><li> Agiter doucement le pinceau dans BEGM et prendre 10 pi de l&#39;échantillon pour un nombre de cellules en utilisant un hématimètre. Ajouter 10 ul d&#39;une tache en direct / morts et compter que les cellules vivre sous un microscope. </li><li> Prendre 50 pl de l&#39;échantillon et diluer à 200 pi avec PBS 1x. Ajouter à entonnoir Cytospin attaché à lame de verre et de spin à 300 tours par minute pendant 2 min. Laissez glisser O / N et aux taches slide sec followinles instructions du fabricant g. Laisser sécher O / N, de préférence dans l&#39;obscurité. </li><li> Stain Diapositive avec Hema 3 Stain <ol><li> Transférer chaque solution (Hema fixateur, bleu clair; Hema 3 Solution I, rose; Solution et Hema 3 II, bleu foncé) dans un plat de coloration; Garder couvert lorsqu&#39;ils ne sont pas en cours d&#39;utilisation. Insérer des diapositives dans diapositive bateau de coloration </li><li> Tremper les lames en continu dans un fixateur pendant 30 secondes, puis laisser excès d&#39;eau. Tremper les lames en continu dans la solution I pendant 30 secondes, puis laisser excès d&#39;eau. Tremper les lames en continu dans la solution II pendant 30 secondes, puis laisser égoutter l&#39;excès de </li><li> Rincer à l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à ce que l&#39;eau soit claire. Laisser sécher O / N, de préférence dans l&#39;obscurité </li></ol></li><li> Regardez glisser sous les cellules au microscope et comptage, déterminer le pourcentage de cellules épithéliales. Devrait être 90% ou plus si l&#39;échantillonnage est bon. </li></ol> 3. Les cellules Seeding REMARQUE: Effectuer toutes les opérations de culture de cellules dans une culture de tissu propre et certifiéhotte à l&#39;aide d&#39;une technique stérile. <ol><li> plaques de Enduire bovine collagène dermique (BDC), tapez 1. Ajouter 0,5 ml de 3 mg / ml BDC dilué dans 49,5 ml 1x PBS. Préparer moins si seulement quelques plaques seront utilisées. Enduire un flacon T25 avec 2 ml BDC et incuber dans le capot O stérile / N ou à 37 ° C pendant 2 heures, si nécessaire. </li><li> Après incubation, aspirer tout liquide restant. Exposer des flacons à la lumière UV pendant 30 minutes dans la hotte stérile. flacons de stockage pour jusqu&#39;à un mois à 4 ° C, mais les amener à la température ambiante ou à 37 ° C avant l&#39;ensemencement des cellules. </li><li> Gardez la brosse et les cellules dans BEGM à 37 ° C jusqu&#39;au moment de semer. Doucement brosse swish intérieur conique, mais ne pas vortex. <ol><li> La plaque 7 x 10 5 cellules dans un flacon T25. S&#39;il y a moins d&#39;utiliser un récipient plus petit, comme un puits d&#39;une plaque à 6 puits. Cette plaque de taille a besoin d&#39; environ 3 x 10 5 cellules. NOTE: S&#39;il n&#39;y a pas ce nombre de cellules, il est conseillé de continuer. </li></ol></li><li> Sous une hotte stérile, prendre brosse de tube et gently tourner la brosse sur la surface du flacon revêtu, en faisant attention à ne pas rayer le revêtement. Jeter la brosse dans un récipient biohazard approprié. </li><li> pipeter lentement les cellules restantes dans BEGM de la partie conique et dans la fiole T25. Observer les cellules au microscope. Un certain nombre de cellules flottantes sera observée et il peut y avoir quelques débris du nez, ce qui est acceptable à ce stade (figure 3A). </li></ol> 4. Culture cellulaire <ol><li> Après l&#39; ensemencement des cellules, laissez - les régler pendant 48 heures sans interruption (Figure 3). Après 48 heures, lentement et doucement ajouter 2 ml au chaud BEGM et 20 ul stérile penicilin / streptomycine / Fungizone (P / S / F). NOTE: NE PAS aspirer les originaux 2 ml de milieu. </li><li> Le 4 e jour après le semis, aspirer soigneusement tout le liquide, et le remplacer par 4 ml frais, réchauffé BEGM ainsi 1x Pen / Strep (Fungizone est plus nécessaire). Changer les médias tous les deux jours et évaluer les cellules pour joindrement, la croissance et la confluence. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, généralement en 2-3 semaines, ils sont prêts à être repiquées. </li><li> Un flacon T25 (environ 2,5 x 10 6 cellules lorsqu&#39;elles sont confluentes) peut être repiqué dans trois flacons T25 ou d&#39; un flacon T75. Après le premier passage, les cellules doivent être robustes et en bonne santé, d&#39;atteindre la confluence environ tous les trois jours. </li></ol> 5. Cellules de repiquage <ol><li> Aspirer doucement les médias de la plaque. Ajouter 1 ml de solution à 0,05% de trypsine par flacon T25 à la plaque et placer dans l&#39;incubateur pendant environ 4min, ou jusqu&#39;à ce que les cellules se détachent de la plaque. Vérifiez le niveau du détachement des cellules toutes les 2 min et ne pas laisser la trypsine sur plus de 10 min. </li><li> Ajouter 5 ml de trypsine Neutralisation Solution (TNS), ou un support contenant du sérum à neutraliser l&#39;enzyme. Retirer tout le liquide et les cellules du ballon et le placer dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Centrifuger à 200 x g (accélération décélération 0 0) pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire. Aspirer supernacellules et tantes resuspendre dans BEGM + P / S dans le volume requis pour les nouveaux flacons (4 ml pour un flacon T25, 10 ml pour un flacon T75) </li><li> Effectuer le nombre de cellules avec une tache en direct / morts comme décrit ci-dessus (2.1). Ajouter la quantité appropriée de BEGM et des cellules dans les flacons revêtus et revenir à l&#39;incubateur. Maintenir comme détaillé ci - dessus ou de cryoconservation dans un milieu de congélation (70% BEGM, 20% de FBS et 10% de DMSO) à une concentration de 0,5-2 x 10 6 cellules par ml. </li></ol> 6. Reprogrammation à CSPi NOTE: Avant de générer CSPi, assurer le respect de tous les règlements institutionnels régissant la production et l&#39;utilisation des CSPi humaines. une technique stérile est particulièrement important pour les cultures COPSI comme milieu de culture ne contient pas systématiquement des antibiotiques. Il est essentiel que les CNE semblent en bonne santé et sont solidement proliférative pour la reprogrammation réussie. <ol><li> Planche 5 x 10 5 PEN par puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 6 puits. Après 24 h, ajouter polybrèneà BEGM à une concentration finale de 8 pg / ml et transduction NECs en ajoutant des particules lentiviraux exprimant Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc aux médias. But de parvenir à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de ~ 5 27. <ol><li> Pour la détermination de la MOI, préparer des dilutions en série du stock concentrée-lentivirus et la transduction des cellules HT1080 avec ces dilutions. Après la première détection de l&#39;expression sans équivoque dTomato dans les cellules HT1080, calculer le nombre d &#39; &quot;unités de transduction / ml» en marquant le nombre de dTomato positif cellules / petits amas de cellules dans chaque dilution. NOTE: En règle générale, il y aura des dilutions qui sont trop élevés (tout est dTomato positif) et trop faible (aucun ou seulement un couple de cellules positives). </li><li> Effectuer la notation des dilutions dans lesquelles des cellules positives discrètes / petits amas de cellules est identifiée. Déterminer le titre en corrigeant le nombre de transduire unités / ml avec le facteur de dilution approprié. MOI est alors le rapport entre le nombredes cellules transduites au nombre de particules virales 27. NOTE: Chaque dTomato cellulaire positive / petit bouquet est supposé provenir d&#39;une seule particule virale. </li></ol></li><li> Environ 3 heures après la transduction, retirer les médias et les remplacer avec des produits frais BEGM. Jeter les médias lentivirus contenant en utilisant des procédures institutionnellement approuvés. Retour NECs transduites à l&#39;incubateur pendant 3 jours. </li><li> Le jour 3, remplacer les médias avec des produits frais BEGM, puis incuber pendant 3 jours. Aspirer passé médias, laver les cellules avec PBS 1x et ajouter une solution de trypsine 1 ml de 0,05% dans le puits. cellules Passage avec trypsine comme écrit ci-dessus (section 5). Aspirer délicatement les cellules surnageant et remettre en suspension dans 4 ml BEGM + P / S. Les cellules peuvent être repiquées à un nouveau puits d&#39;une plaque à 6 puits revêtu de BDC, ou ajoutés aux cultures du MEF, il est prêt (voir l&#39;étape suivante). </li><li> Préparer des plaques revêtues MEF. Le jour 4 ajouter une solution de gélatine à 0,1% (1 ml / puits) pour 2 puits d&#39;une 6 (pour effectuer +/- Thiazovivin (SPT) voir l&#39;étape 6.6). Sur la prochainejour, décongeler un flacon de MEFs inactivés 28. </li><li> Placez MEFs dans 10 ml de milieu MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% de SFD). Spin à 200 xg pendant 5 min à sédimenter. Resuspendre dans les médias MEF. Aspirer la gélatine de la plaque de 6 puits et ajouter 1,87 x 10 5 MEFs par puits de la plaque 6 et la gélatine à revêtement. Incuber O / N à 37 ° C ou pendant un minimum de 24 heures. </li><li> Transférer 2 ml de BEGM contenant des cellules transduites par puits dans 2 puits d&#39;une plaque à 6 puits revêtus précédemment et incuber O / N. Le jour suivant, remplacer BEGM avec 2,5 ml par puits de milieu standard contenant hESC 4 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes. Nourrir les cellules avec les médias CSEh frais +/- SPT par jour pendant 10 jours NOTE: Il est possible d&#39;ajouter un cocktail de petites molécules (SB431542, PD0325901 et Thiazovivin (SPT) cocktail) pour améliorer l&#39;efficacité et la cinétique de reprogrammation pour NECs 23. </li><li> Après dix jours, continuer à nourrir tous les jours en utilisant les CSEh médias sans SPT. Nourrissez cultures tous les jours jusqu&#39;à colonies de CSEh-likeapparaît (figure 5A, P0 colonie). Identifier les colonies hébergeant CSPi putatifs par leur haute noyau: rapport cytoplasmique et nucléoles proéminents. </li><li> Manuelle accise et de transfert des colonies avec des CSEh-morphologie pour séparer les puits pour la culture et l&#39;expansion des lignes distinctes dans un système sans alimentation. colonies excisées doivent adapter rapidement à ces conditions. <ol><li> Après que les colonies de placage excisé ces lignes iPSC putatifs discrètes sont maintenant considérés comme passage 1 (P1). cultures d&#39;alimentation quotidienne avec mTeSR1. Passage et d&#39;étendre les lignes iPSC en utilisant des procédures standard. Il peut prendre plusieurs jours à une semaine pour les colonies de p1 pour atteindre la taille à laquelle ils doivent être repiquées. </li></ol></li></ol> 7. Maintenir CSPi en culture <ol><li> Flux et évaluer les cultures quotidienne. Manuellement les zones accises présentant une différenciation manifeste en grattant avec une pipette en verre stérile ou micro pointe de la pipette. Changer les médias après la cueillette quotidienne. </li><li> cellules Passage après approximationdiatement tous les quatre jours: Gently médias aspirés, ajouter 1 ml de dispase chaud (1 mg / ml) par puits d&#39;une plaque à 6 puits (la moitié du volume d&#39;alimentation), puis incuber à 37 ° C pendant environ 4 min. Les bords des colonies vont commencer à soulever, qui ressemble à un contour blanc autour de la colonie. Aspirer doucement le dispase et laver 3x avec réchauffé DMEM / F12. </li><li> Ajouter 2 ml mTeSR1 et utiliser un lève-cellule pour soulever les colonies de la plaque. Utilisez 5 ml de pipettes sérologiques ou P1000 micropipette à triturer doucement les cellules jusqu&#39;à ce que les colonies sont divisés en petits groupes. <ol><li> Évitez la production de très petites grappes ou des cellules isolées, comme la survie et la prolifération subséquente sera sous-optimale. Lorsque les colonies re-placage, 1: 4 à 1: 6 scission maintiendra la densité de la colonie optimale. Retirez délicatement les colonies et les médias de la plaque et ajouter de nouveaux puits de matrigel revêtu. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Cellules épithéliales nasales (NEC) sont une plate - forme accessible pour l&#39; étude des maladies des voies respiratoires, et NEC-CSPi offrent une avenue intéressante à explorer le développement de la maladie, le traitement et la thérapie 1,31,32. NECs peut facilement être obtenue sans procédures nuisibles stressantes ou potentiellement 6,23. Dans notre expérience, l&#39;échantillonnage de la muqueuse nasale, comme décrit dans ce protocole semble être moins stressant et mieux perçu que la collec...

Les cellules souches pluripotentes induites à partir d&#39;échantillons humains (hiPSCs) sont une technologie en développement rapide de la recherche sur les cellules souches. Ils offrent une alternative aux cellules souches embryonnaires (hESC) la recherche avec beaucoup moins inconvénients éthiques et morales 1,2. Bien qu&#39;ils ne sont pas épigénétique identique à CSEh 3-5, hiPSCs offrent un moyen unique de modéliser le développement et les maladies phénotypes, et ils peuvent être dérivés de tissus pertinents à l&#39;état de la maladie 5-8. De nouvelles méthodes de hiPSCs générant sont constamment à l&#39;étude pour identifier les types de cellules optimales pour commencer, comme un moyen de préparer CSPi GMP qualité convenant à la transplantation, et aussi pour augmenter la rapidité et l&#39; efficacité du processus de reprogrammation 6,9-11. Les cellules épithéliales des voies respiratoires sont essentielles dans le développement de l&#39; inflammation allergique 12, et l&#39;épithélium est un moteur important de réactions allergiques et remodelage des voies aériennes par l&#39; interaction avec immune stromales et les cellules. L&#39;épithélium des voies respiratoires joue un rôle essentiel dans l&#39;origine et la persistance des maladies pulmonaires telles que l&#39;asthme. Toutefois, les cellules epitheliales des voies respiratoires inférieures sont difficiles à obtenir dans un environnement clinique, en particulier chez des patients et des enfants témoins en bonne santé. Les données de plusieurs études soutiennent l&#39;hypothèse que les cellules épithéliales de la muqueuse nasale sont une procuration valide et pratique pour les voies respiratoires inférieures des cellules épithéliales 13-20, en particulier lors de l&#39; étude des réponses aux polluants atmosphériques et les allergènes. La muqueuse nasale se compose de plus de 90% des cellules épithéliales des voies respiratoires ciliées et échantillonner ces cellules épithéliales nasales (PEN) peut être facilement réalisée chez les enfants aussi jeunes que quatre ou cinq ans, car elle est moins invasive que les autres / techniques d&#39;échantillonnage des tissus cellulaires et est associé à un risque minimal d&#39;effets indésirables tels qu&#39;une infection 20-23. Il offre un moyen simple et rapide pour échantillonner les enfants sains et malades sans long, inutile, et souvent douloureuse procedu bronchoscopieres qui nécessitent une sédation. Des études antérieures ont montré que les sous - types de maladies liées à la sévérité de l&#39; asthme , on peut distinguer à la fois la muqueuse nasale, ainsi que des échantillons de cellules bronchiques prélevées sur les enfants asthmatiques, et l&#39; expression génique entre les deux types de tissus était similaire chez environ 90% des gènes non omniprésents 22 , 24. En tant que source pour CSPi, NECs offrent des avantages par rapport aux autres types de cellules fréquemment utilisées. Les fibroblastes sont souvent utilisées pour la production COPSi, mais, bien que ces cellules peuvent facilement être mises en culture à partir d&#39;une biopsie de la peau, ce procédé nécessite généralement une anesthésie locale, une incision, et des sutures, et est associée à un risque d&#39;infection. Par conséquent, l&#39; obtention du consentement éclairé des patients pour ce type de biopsie peut être difficile 25. Une alternative aux fibroblastes sont des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP). Cependant, il peut être difficile d&#39;obtenir suffisamment de sang pour la génération COPSi des patients pédiatriques. En outre, il existe des limitations en aval du point d&#39;accèsplications pour les fibroblastes et les cellules sanguines iPSCs dérivés, en particulier leur capacité de différenciation de certains types cellulaires 5,26. Par conséquent, compte tenu de l&#39;accessibilité relative et le faible risque d&#39;effets secondaires après leur collecte, NECs représentent une source cellulaire idéal pour la génération iPSC des populations pédiatriques. CSPi ont reçu beaucoup d&#39;attention récemment en tant que plate-forme pour l&#39;étude du développement humain, générant de nouveaux modèles de maladies, et comme une source potentielle de cellules pour des thérapies personnalisées. Avant tout le potentiel de cette technologie peut être réalisée, les bases moléculaires du processus de reprogrammation doivent être élucidés, mais pour l&#39;instant ce protocole et les procédures décrites dans les élucideront les études de recherche ont porté sur l&#39;exposition des voies respiratoires, ainsi que de fournir une plate-forme étudier les effets de la médecine personnalisée impliquant CSPi. Le travail de collaboration de plusieurs laboratoires a conduit à la generation d&#39;une technique efficace non seulement pour l&#39; échantillonnage de la muqueuse nasale, mais aussi la mise en culture PEN, et la reprogrammation de ces cellules à 23 iPSCs. Cet article donne un aperçu d&#39;un protocole d&#39;échantillonnage optimal, la culture, et les conditions de reprogrammation.

<table><tbody><tr><td>15 ml conique</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protocole Étape 1.1.</td></tr><tr><td>Protocole BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Étape 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protocole Étape 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocole Étape 4.a.</td></tr><tr><td>brosse de cytologie cytosoft</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocole Étape 1.2.</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protocole Étape 2.1.</td></tr><tr><td>hémacytomètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocole Étape 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protocole Étape 2.2.</td></tr><tr><td>Pinces d’entonnoir de cytologie</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protocole Étape 2.2.</td></tr><tr><td>entonnoir de cytospin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocole Étape 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>protocole Étape 2.2.</td></tr><tr><td>lame vierge</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocole Étape 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 stain kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocole Étape 2.2.</td></tr><tr><td>Colage dermique bovin, type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protocole Étape 3.2.</td></tr><tr><td>Fiole T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocole Étape 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Étape de protocole 5.2.</td></tr><tr><td>Solution neutralisante de trypsine</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocole Étape 5.2.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS), stérilisé thermiquement à 65 &deg ; C pour 30 min</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protocole Étape 5.5.</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde Hybri-Max&trade ;, stérile-filtré, BioReagent, adapté aux hybridomes, &ge ; 99,7 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Étape 5.5 du protocole.</td></tr><tr><td>lentivirus polycistonique*</td><td>p. ex. Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protocole Étape 6.4.&nbsp ; Une source commerciale de vecteur de reprogrammation est répertoriée. Nous utilisons régulièrement le plasmide 4-en-1 rapporté par Voelkel et al (PMID : 20385817) pour générer en interne un lentivirus polycistronic de reprogrammation pseudotypé VSV-G. Ce plasmide peut être obtenu en contactant&nbsp ;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocole Étape 6.4.</td></tr><tr><td>MEFs CF1 irradiés</td><td>GlobalStem&nbsp ;</td><td>Protocole GSC-6301G</td><td>Étape 6.4.</td></tr><tr><td>Voir la</td><td>recette incluse dans l’étape</td><td>6.11 du protocole</td><td></td> Protocole.</tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Étape de protocole 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Étape de protocole 6.11.</td></tr><tr><td>Thiazovivine&nbsp ;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Étape de protocole 6.11.</td></tr><tr>Matrigel <td>BD Biosciences</td><td>354277</td> le protocole <td>qualifié hESC</td><td>Étape 6.13.</td></tr><tr><td>Plaque Corning, 6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocole Étape 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Étape 6.13.</td></tr><tr><td>Gourde filtrante jetable de 250 ml (0,22 & micro ; m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocole Étape 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Étape de protocole 7.3.</td></tr><tr><td>lève-cellules</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocole Étape 7.4.</td></tr><tr><td>Milieu hESC**</td><td></td><td></td><td>Étape du protocole 6.11. composants doivent être mélangés, puis stérilisés par filtre. Les supports peuvent être conservés à 4 &deg ; C jusqu’à deux semaines. Lors du réchauffement du support, ne pas laisser à 37 &deg ; C plus de 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 média</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp ; 11330-032</td><td>Concentration finale</td></tr><tr><td>Sérum de remplacement KO (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0,2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig ;-mercaptoéthanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>100x acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &micro ; g/ml Facteur de croissance des fibroblastes basiques (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

cultiver des cellules primaires épithéliales nasales des enfants et des reprogrammer dans les cellules souches pluripotentes induites

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Les cellules épithéliales nasales (NEC) sont la partie des voies respiratoires qui réagissent aux polluants atmosphériques et sont les premières cellules infectées par des virus respiratoires. Ils sont également impliqués dans de nombreuses maladies des voies respiratoires par leur réponse immunitaire innée et leur interaction avec les cellules immunitaires et stromales des voies respiratoires. Les ECN sont particulièrement intéressantes pour les études chez les enfants en raison de leur accessibilité lors des visites cliniques. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) ont été générées à partir de plusieurs types de cellules et constituent un outil puissant pour modéliser le développement humain et la maladie, ainsi que pour leurs applications potentielles en médecine régénérative. Il s’agit du premier protocole à présenter des méthodes pour générer avec succès des CSPi à partir de NEC dérivées de participants pédiatriques à des fins de recherche. Il décrit comment obtenir des cellules épithéliales nasales chez des enfants, comment générer des cultures primaires de NEC à partir de ces échantillons et comment reprogrammer des NEC primaires en iPSC bien caractérisées. Les échantillons de muqueuse nasale sont utiles dans les études épidémiologiques liées aux effets de la pollution de l’air chez les enfants et constituent un outil important pour l’étude des maladies des voies respiratoires. Les cellules nasales primaires et les iPSC qui en sont dérivées peuvent constituer un outil permettant de fournir un matériel illimité pour la recherche spécifique au patient dans divers domaines de la biologie épithéliale des voies respiratoires, y compris la recherche sur l’asthme et la BPCO.

La première partie du nez, appelé le vestibule nasal, est la zone entourée par le cartilage 29. La brosse doit aller en douceur passée cette zone du nez, au - delà de la valve nasale (ostium internum, ou le «trou noir» vu à l&#39;arrière de la narine), et l&#39;échantillon est obtenu à partir du cornet inférieur (Figure 1). Les fosses nasales sont des structures osseuses qui augmentent la surface du nez 29, ce qui les rend un endroit idéal pour l&#3...

Cette publication démontre des méthodes permettant de prélever et de cultiver avec succès la muqueuse épithéliale nasale d’enfants, et de reprogrammer ces cellules en cellules souches pluripotentes induites (iPSC).

Cultiver des cellules primaires épithéliales nasales des enfants et des Reprogrammer dans les cellules souches pluripotentes induites

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

L'objectif général de cette procédure est de faire croître des cellules épithéliales nasales obtenues auprès d'enfants et de les reprogrammer en cellules souches pluripotentes induites. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies respiratoires, comme la manière dont l'asthme se développe. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de recueillir des cellules épithéliales des voies respiratoires chez les enfants sans recourir à des procédures invasives.En culture, ceux-ci forment une population homogène et constituent une excellente source pour générer des cellules souches pluripotentes induites ou iPSC. Nous avons eu l'idée de cette étude en discutant avec les Drs. Ji et Hershey de leur recherche visant à recueillir des cellules mésos-épithéliales chez des enfants afin d'analyser la variation épigénétique dans l'asthme et la pollution atmosphérique.La démonstration visuelle de ces techniques est essentielle, car le prélèvement nasal et la reprogrammation en cellules souches induites (iPS) des cellules épithéliales nasales sont des techniques difficiles à apprendre, car elles reposent sur l'expérience personnelle et non sur des protocoles établis. Avant la visite du participant, transférez deux millilitres de milieu de croissance pour cellules épithéliales bronchiques fraîchement préparé, abrégé BEGM, dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez à ce milieu 20 microlitres d'un mélange de pénicilline, de streptomycine et d'amphotéricine B afin d'obtenir une concentration finale de 0,01 %. Lorsque le participant arrive, dirigez-le vers une chaise pour qu'il s'assoie.Ensuite, ouvrez une brosse cytologique immédiatement avant de prélever l'échantillon, et ne la touchez aucune surface afin de garantir qu'elle reste stérile. Demandez ensuite au participant de rester immobile et d'incliner la tête vers le haut, en direction du plafond. S'il est agité, demandez-lui de s'asseoir sur ses mains afin d'éviter qu'il tente d'écarter la brosse.Ensuite, dirigez et insérez la brosse à l’arrière du nez, là où le passage se rétrécit. Retirez ensuite la brosse de la narine en la faisant glisser vers le bas avec un mouvement de rotation du poignet. Placez ensuite la brosse dans le tube conique préparé précédemment, et assurez-vous qu’elle est bien immergée dans le BEGM.Ensuite, coupez la partie excédentaire de la brosse et fixez le bouchon sur le tube. Après avoir prélevé l'échantillon, placez-le immédiatement dans un bécher rempli d'eau tiède afin de le maintenir à une température aussi proche que possible de 37 degrés Celsius. Transportez-le ensuite au laboratoire.Une fois en laboratoire, agiter doucement le pinceau dans le BEGM. Ensuite, prélever 10 microlitres de l'échantillon et ajouter 10 microlitres d'un colorant viable/non viable. Procéder ensuite à l'introduction de ce mélange sur un hématocytomètre.Et comptez uniquement les cellules vivantes au microscope. Après le décompte cellulaire, prélevez 50 microlitres de l'échantillon et diluez-le jusqu'à 200 microlitres avec du PBS 1X. Transférez le reste du mélange cellulaire non dilué, ainsi que la brosse, dans un bain-marie régulé à 37 degrés Celsius jusqu'à la semence des cellules.Procédez à l'ajout de l'échantillon dilué dans du PBS dans un entonnoir de cytocentrifugeuse fixé sur une lame de verre. Puis, faites tourner l'appareil complet à 400 tr/min pendant deux minutes. Ensuite, retirez l'entonnoir et laissez la lame sécher toute la nuit à l'abri de la lumière.Après avoir coloré la lame avec le Hema 3, comme indiqué dans le protocole écrit, observez-la au microscope et comptez les cellules. Identifiez les cellules épithéliales par leurs caractéristiques distinctives : une forme en colonne, des cils et un noyau rond unique, puis déterminez le pourcentage de ces cellules dans la préparation.Pour commencer l'ensemencement, agiter doucement la brosse à l'intérieur du cône dans une hotte de culture tissulaire certifiée, puis la retirer du tube. Ensuite, faire doucement tourner la brosse sur la surface intérieure d'un flacon T25 préalablement recouvert de collagène dermique bovin, en prenant soin de ne pas rayer le revêtement. Puis jeter la brosse dans un contenant approprié pour déchets biologiques. Transférez lentement les cellules restantes dans le BEGM du tube conique vers le flacon T25, au moins 7 fois 10 à la puissance 5 cellules. Passez ensuite à l'observation des cellules au microscope inversé. Après la culture et le passage des cellules, comme décrit dans le texte, procédez au semis de 5 fois 10 à la puissance 5 cellules épithéliales nasales dans deux millilitres de BEGM par puits d'une plaque de culture tissulaire à six puits.Incubez ensuite les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, vérifiez que les cellules prolifèrent de manière robuste. Ajoutez alors du Polybrene dans chaque puits contenant du BEGM jusqu'à une concentration finale de huit microgrammes par millilitre sous une hotte aspirante.Procédez à la transduction des cellules épithéliales nasales en ajoutant des particules rétrovirales exprimant Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc dans le milieu de chaque puits, comme indiqué dans le protocole écrit. Après avoir incubé les cellules transduites pendant environ trois heures, retirez le milieu contenant le virus et éliminez-le conformément aux procédures approuvées par l'institution. Remplacez ensuite ce milieu par du BEGM et remettez les cellules épithéliales nasales transduites dans l'incubateur.Après trois jours, remplacer le milieu par du BEGM frais. Puis incuber les cellules transduites dans les mêmes conditions. Le jour suivant, ajouter une solution de gélatine à 0,1 % dans deux puits d'une plaque de six puits afin de commencer la préparation des plaques recouvertes de fibroblastes embryonnaires de souris.Ensuite, couvrez la plaque avec son couvercle correspondant et incubez-la toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le cinquième jour, décongelez un flacon contenant environ 5 fois 10 à la puissance 5 fibroblastes embryonnaires de souris inactivés, abrégés en MEF. Puis placez ces cellules dans 10 millilitres de milieu pour MEF.Puis faites-les centrifuger à 200 x g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et resuspendez les MEF dans le même milieu. Une fois le nombre de cellules déterminé, aspirez la solution de gélatine du plat à six puits préparé précédemment.Ensuite, ajoutez 1,87 × 10⁵ MEF par puits revêtu de gélatine de la plaque et incubez à 37 °C pendant au moins 24 heures. Puis, au jour 6 de culture, aspirez le milieu usé des cellules transduites et rincez-les avec du PBS 1X. Ajoutez ensuite un millilitre de solution de trypsine 0,05 % dans chaque puits de la plaque.Une fois les cellules détachées, procédez à la neutralisation à l’aide de la solution de neutralisation de la trypsine ou du TNS, puis recueillez et centrifugez les cellules comme indiqué précédemment. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans quatre millilitres de BEGM, enrichi de pénicilline et de streptomycine. Introduisez ensuite deux millilitres de cette suspension cellulaire dans chacun des puits revêtus de gélatine et de MEF de la plaque préparée auparavant.Après avoir incubé les cellules pendant une nuit, remplacer le BEGM par 2,5 millilitres de milieu standard pour cellules souches embryonnaires humaines, abrégé en hESC, contenant quatre nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes de base. Continuer à cultiver les cellules et les alimenter quotidiennement avec du milieu hESC frais jusqu'à l'observation de colonies de type hESC, contenant des cellules souches pluripotentes induites présumées, ou iPSCs, dans les cultures. Exciser manuellement ces colonies et les transférer dans des puits séparés d'une plaque 24 puits afin de les cultiver et de les amplifier comme des lignées distinctes dans un système sans cellules nourricières.Initialement, les échantillons nasaux constituent un mélange de types cellulaires et de débris. Toutefois, après culture et changements de milieu, les cellules épithéliales deviennent prédominantes dans ces préparations, comme le montre cette image prise un jour après le repiquage des cellules. Ici, les cellules épithéliales, en cours de croissance jusqu'à la confluence, présentent de grands noyaux et un cytoplasme étiré.En raison des propriétés des particules lentivirales utilisées dans cette étude, lorsque ces cellules épithéliales nasales sont transduites, elles expriment le marqueur fluorescent tdTomato, comme le montre l'image en haut à droite des cellules, quatre jours après la transduction. Une comparaison avec l'image correspondante en champ clair révèle que toutes les cellules n'affichent pas le signal tdTomato, comme en témoigne l'image fusionnée en bas. Ainsi, toutes les cellules ne sont pas transduites.Cependant, l'efficacité de transduction est d'environ 90 %. Lorsque les cellules épithéliales nasales transduites sont cultivées selon les indications du protocole, elles donnent naissance à des colonies de CIP. Après la récolte des colonies de CIP et leur culture dans des conditions standard sans cellules nourricières, les cellules individuelles de ces colonies présentent une morphologie typique semblable à celle des CSH humaines, comme une forme arrondie, un noyau volumineux et un rapport noyau/cytoplasme élevé, tel qu'illustré par cette image agrandie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure et demie, si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de prélever correctement l'échantillon, de maintenir les cellules à 37 degrés Celsius et de les ensemencer le plus rapidement possible à la densité appropriée. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la mise en place d'une interface air-liquide à l'aide de cellules épithéliales nasales primaires, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont les voies respiratoires réagissent aux allergènes et aux agents pathogènes. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs de modéliser des maladies telles que l'asthme, la BPCO et la fibrose kystique.Cette technique aide également à étudier les effets environnementaux sur le développement pulmonaire dans un système humain in vitro. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cultiver des cellules épithéliales nasales provenant d'enfants et générer des iPSC à partir de cette population. Étant donné que nous travaillons avec des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches pluripotentes induites, n'oubliez pas de toujours respecter les directives institutionnelles et nationales.

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