Contrôle optique d'une protéine Neuronal L'utilisation d'un acide aminé Unnatural génétiquement codificateur dans Neurones

L’objectif global de cette procédure est de contrôler optiquement la fonction d’une protéine neuronale à l’aide d’un acide aminé non naturel codé génétiquement dans les neurones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la contribution d’une protéine neuronale spécifique à la signalisation neuronale dans la fonction cérébrale avec une résolution temporelle spatiale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a le potentiel d’être appliquée à diverses protéines neuronales pour obtenir une régulation optique de divers processus neuronaux.

Commencez cette procédure en plaquant les neurones de l’hippocampe sur des lamelles de couverture dans une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de milieu de croissance, après avoir filtré à travers un treillis en nylon de 40 micromètres. Après cela, incubez la culture neuronale à 35 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et à 95 % d’air humidifié pendant 2 à 3 semaines. Le jour de la transfection, préparez une solution fraîche de chlorure de calcium à 2,5 molaires dans de l’eau distillée deux fois et filtrez-la stérilement avec un filtre à 0,22 micromètre.

Ensuite, préparez du BBS frais 2X à pH 7 et filtrez-le stérilement avec un filtre de 0,22 micromètre. Après cela, remplacez le milieu de culture par 500 microlitres de milieu de transfection frais et préchauffé, et ne jetez pas l’ancien milieu de culture. Préparez la solution de transfection immédiatement avant de l’ajouter à la culture en combinant du chlorure de calcium et de l’eau distillée deux fois, tout en agitant lentement le tube.

Continuez à agiter le tube et ajoutez lentement de l’ADN dans la solution. Ensuite, ajoutez 2X BBS buffer dropwise. La préparation du tampon 2X BBS est une étape critique de la transfection du phosophate de calcium, et c’est une bonne idée de calibrer le pH optimal pour le tampon 2X BBS entre 6,90 et 7,15 pour les nouvelles constructions ou préparations d’ADN.

Ensuite, ajoutez immédiatement 30 microlitres de la solution de transfection à chaque lamelle de la culture neuronale. Secouez le plat de culture plusieurs fois pour mélanger la solution et incubez-le à 35 degrés Celsius pendant 45 minutes à une heure. Après environ une heure, une fine couche de phosphate de calcium précipité doit être observée recouvrant les neurones.

Ensuite, remplacez le support de transfection par 500 microlitres de tampon de lavage préchauffé et incubez-le à 35 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. Les précipités de phosphate de calcium devraient disparaître après le lavage. Maintenant, remplacez le tampon de lavage par 500 microlitres de substrat de croissance frais.

Ensuite, remplacez le milieu de croissance par le milieu d’origine enregistré. Ensuite, ajoutez à la culture un acide aminé prémélangé et non naturel, Cmn, dans 50 microlitres de milieu de croissance chaud, ce qui permet d’obtenir une concentration finale d’un millimolaire. Incuber la culture transfectée à 35 degrés Celsius pendant 12 à 48 heures avant l’enregistrement.

Dans cette procédure, préparez les solutions extracellulaires et intracellulaires. Dans notre configuration, la LED avec une émission de 385 nanomètres est installée à côté du microscope pour fournir la lumière à un centimètre du point focal à un angle de 45 degrés. Ensuite, tirez quelques pipettes patch avec une électrode en verre à l’aide d’un extracteur de micro-pipettes.

Ensuite, prenez une lamelle de culture de neurones de l’incubateur et rincez-la une fois dans la solution extracellulaire. Imprégnez la plate-forme d’une solution extracellulaire. Ensuite, placez la lamelle sur la plate-forme du microscope d’électrophysiologie, en utilisant les techniques standard de serrage par patch.

Patch d’un neurone transfecté avec des fluorescents M-citrine. Ensuite, enregistrez l’activité neuronale à l’aide de la méthode de la pince de courant. Tout d’abord, ajustez le potentiel de repos à environ moins 72 millivolts.

Ensuite, injectez un courant de pas pour induire une activation continue de potentiels d’action à cinq à 15 Hertz. Pendant l’enregistrement, délivrez des impulsions LED uniques au neurone et surveillez les changements de ses potentiels d’action. Ensuite, ajoutez 0,5 millimolaire de chlorure de baryum dans le bain, pour récupérer les potentiels d’action.

Dans le cadre d’une coupe cérébrale aiguë, patchez un neurone avec des fluorescents GFP M-cherry de la région néocorticale. Ensuite, enregistrez l’activité PIRK à l’aide de la méthode de la rampe de tension. Plus précisément, surveillez les courants entrants spécifiques de Kir2.1 à moins 100 millivolts.

Ensuite, délivrez des impulsions LED uniques au neurone pendant l’enregistrement et surveillez si les protéines PIRK sont activées. Une fois que PIRK est activé, les courants entrants à moins 100 millivolts augmenteraient considérablement. À la fin, ajoutez 0,5 millimolaire de chlorure de baryum dans le bain et vérifiez si le PIRK est inactivé.

Voici des images exemplaires de cultures neuronales hippocampiques de rats en bonne santé. Et deux neurones sains présentant des corps cellulaires dodus et des dendrites et des axones prononcés. Il s’agit des images DIC et de fluorescence de cultures de neurones de l’hippocampe de rat in vitro, et transfectées pour l’expression de PIRK sans CMN.

En présence d’un CMN millimolaire, les neurones transfectés sont capables d’exprimer les protéines de citrine PIRK M sur toute leur longueur, montrant ainsi une fluorescence verte. Et voici un exemple d’une seule impulsion lumineuse, supprimant l’activité d’un neurone de l’hippocampe exprimé par PIRK. Ces images de fluroescence de neurones corticaux embryonnaires de souris montrent l’incorporation réussie de CMN dans les protéines GFP et Kir2.1 in vivo.

Dans ce graphique, l’activation dépendante de la lumière de PIRK est indiquée dans les courants enregistrés par les neurones néocorticaux de souris. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies cérébrales causées par le dysfonctionnement de protéines neuronales spécifiques, par exemple, Kir2.1 muté dans le syndrome d’Andersens, car cette technique aide à découvrir quels circuits cérébraux sont affectés par les déficits de Kir2.1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour contrôler la fonction des protéines neuronales avec la lumière en haute spécificité dans les neurones vivants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’incorporer des acides aminés non naturels dans les protéines des neurones pour obtenir un photocontrôle sur les protéines neuronales d’intérêt.