Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion

L'objectif général de cette expérience est de reproduire in vitro une transfusion de plaquettes et de la tester à l'aide d'un modèle d'hémostase sur collagène, en conditions d'écoulement hydrodynamique et d'observation microscopique en temps réel. Les patients atteints de thrombopénie sont traités par des concentrés de plaquettes conservés. Notre méthode vise à répondre à des questions clés dans le domaine de la thrombose et de l'hémostase, en mettant l'accent sur la qualité et la fonction de ces concentrés de plaquettes conservés.

La valeur ajoutée de cette technique réside dans le fait qu'elle imite l'écoulement sanguin, prenant ainsi en compte les influences de la rhéologie sur les cellules et les biomolécules impliquées. La méthode actuelle évalue l'adhésion des plaquettes au collagène. Toutefois, elle peut également être appliquée à d'autres tissus adhésifs, notamment la plaque d'athérome, les cellules endothéliales ou des protéines matricielles spécifiques telles que le facteur de Von Willebrand et le fibrinogène.

Commencez par préparer le biochip. Vortexez et diluez un stock de collagène au 1/20 dans la solution glucosée isotonique fournie par le fabricant pour obtenir une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Ensuite, pipetez 0,8 microlitre dans les sillons d'un nouveau biochip jetable.

Remplir toutes les voies à une extrémité de la puce et marquer cette extrémité comme étant la sortie. Ensuite, inspecter la puce pour s'assurer que chaque voie est remplie au cinq sixièmes par la solution et qu'aucune bulle d'air n'est présente. Puis, incuber la puce à quatre degrés Celsius pendant quatre heures ou toute la nuit dans un récipient fermé et humidifié.

Par la suite, bloquez les canaux codés en pipettant du tampon de blocage dans l'autre extrémité des voies. Ensuite, pour chaque voie, coupez des morceaux de tube de 12 centimètres de longueur et fixez une épingle à chaque morceau de tube afin de pouvoir les attacher à la puce à ADN. Rincez les morceaux de tube avec de l'eau distillée à l'aide d'une seringue et d'un connecteur.

Ensuite, les saturer avec du tampon de blocage et les placer dans un récipient humidifié pendant au moins une heure. Préparer ensuite la pompe et le collecteur. Rincer d'abord la pompe et le collecteur avec de l'eau distillée pour éliminer toute bulle d'air.

Ensuite, fixez la puce à biopuce sur la platine du microscope automatisé. Insérez une extrémité des canaux dans un tube de 1,5 millilitre rempli de HBS, puis reliez-les par l'autre extrémité aux entrées de la puce à biopuce. Placez les broches du collecteur dans les sorties de la puce à biopuce.

Ensuite, rincez le système avec du HBS à l'aide de la pompe. Tout tampon de blocage résiduel ou tout collagène mal fixé sera ainsi éliminé. Cela achève les préparatifs de la chambre d'écoulement.

Commencez par regrouper des prélèvements sanguins récents provenant de donneurs sains dans un tube conique à centrifuger. Faire tourner l'échantillon environ 15 minutes à 250 G. N'utilisez pas le frein, car il perturberait la phase inférieure faiblement compactée. Retirez et jetez le plasma riche en plaquettes et le buffy coat.

Conservez les globules rouges concentrés contenant le moins de plaquettes possible afin de préparer le sang reconstitué. Commencez maintenant à décongeler quatre millilitres de plasma de groupe AB à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et 20 secondes. Pendant ce temps, déterminez l'hématocrite des globules rouges concentrés préparés à l'aide d'un analyseur d'hématologie automatisé.

Ensuite, déterminez la concentration de plaquettes d'un concentré de plaquettes préparé par une banque de sang afin de l'utiliser pour la reconstitution du sang total. Calculez les volumes requis pour un millilitre de sang reconstitué avec un hématocrite de 40 % et 250 000 plaquettes par microlitre. À présent, à l'aide d'une pipette à embout coupé, transférez les volumes requis de globules rouges, de plasma et de concentré de plaquettes jusqu'à la concentration souhaitée, et pour un volume final d'un millilitre.

Homogénéisez le sang reconstitué par des inversions douces et effectuez un compte complet des éléments sanguins. Ensuite, prenez un tube microcentrifuge préparé contenant du Calcein AM, et ajoutez-y un millilitre de sang reconstitué. Mélangez le sang avec le colorant par des inversions douces.

Ensuite, incubez le sang reconstitué pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Dans le logiciel, sélectionnez la région d'intérêt dans la voie de perfusion. Concentrez-vous sur les fibres de collagène adhérées au fond des voies avec un grossissement de 100x.

De préférence, utilisez le contraste de phase ou le contraste interférentiel différentiel. Choisissez l'option régler le courant Z pour les régions sélectionnées afin de fixer numériquement les positions Z sélectionnées. La mise au point optique avant la perfusion doit être sur le collagène des améloblastes, mais cela peut être délicat.

Une alternative consiste à régler la mise au point du microscope sur les plaquettes initialement adhérentes. Ensuite, mélangez délicatement les échantillons et placez-les à côté du biopuce. Puis, insérez le tube relié à la voie observée dans le sang reconstitué.

Ensuite, à l’aide du logiciel de commande de la pompe, appliquez une pression de 50 dynes par centimètre carré pour faire pénétrer l’échantillon sanguin dans la voie et démarrer l’expérience. Pendant l’expérience, enregistrez des images toutes les 15 secondes pendant cinq minutes. Déterminez la cinétique de croissance du thrombus à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.

Dans ce cas, Zen 2012 est utilisé. Commencez par ouvrir l'analyse d'image du plugin afin de déterminer la couverture superficielle des plaquettes. Réglez le seuil de fluorescence dans l'onglet analyser interactif pour définir l'intensité des pixels qui correspond à un signal positif, provenant des plaquettes adhérentes.

Ensuite, utilisez la fonction de création de tableaux pour générer automatiquement un classeur contenant une liste des aires de surface des signaux positifs pour chaque point temporel. Enregistrez ces classeurs au format XML et ouvrez-les dans un tableur pour effectuer des calculs supplémentaires. Pour chaque point temporel, calculez la surface totale des objets sélectionnés et exprimez cette valeur en pourcentage de surface couverte.

Ensuite, tracer les données en fonction du temps de perfusion et calculer la pente par régression linéaire. Cela modélise la cinétique de croissance du thrombus pour cette condition expérimentale particulière. Trois échantillons identiques de sang total reconstitué ont été perfusés simultanément sur des surfaces revêtues de collagène.

Cela a donné un coefficient de variation de 8,7 %, suggérant une variation intra-test et intra-laboratoire acceptable pour la comparaison des tests. La transfusion a été simulée en reconstituant le sang avec le composant déficient. Plusieurs reconstitutions ont été réalisées avec des concentrations décroissantes de plaquettes.

Comme prévu, des taux de plaquettes plus faibles ont entraîné une adhérence réduite en fonction du temps de perfusion. Ensuite, l'effet des températures diminuées après le prélèvement sanguin et pendant la perfusion a été étudié. On a observé que les thrombus se formaient plus lentement lorsque le sang était refroidi à la température ambiante.

Par rapport à un échantillon maintenu à 37 degrés Celsius tout au long de l'étude. En circulation, les plaquettes se lient aux sites de lésion vasculaire dans des conditions de contrainte de cisaillement pariétal élevée. Comme prévu, la variation du taux de cisaillement dans les chambres d'écoulement microfluidiques a modifié l'adhésion plaquettaire totale.

Ces conditions modifient également la cinétique de croissance du thrombus. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des expériences en chambre d'écoulement microfluidique en utilisant du sang reconstitué pour évaluer la qualité et la fonction des concentrés de plaquettes stockés. Cette technique peut être réalisée en environ sept heures.

Les expériences menées avec des chambres d'écoulement microfluidiques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transfusion de plaquettes pour explorer l'impact des variables liées au don, à la préparation et à la conservation. Un exemple pertinent est l'inactivation des agents pathogènes. Nous avons donné l'exemple d'un seul sujet expérimental.

Cependant, des variations de la concentration en calcium, du cisaillement et des revêtements de surface peuvent être utilisées pour aborder différentes questions de recherche. Des mesures similaires dans des chambres à écoulement microfluidiques peuvent être réalisées selon cette procédure afin de répondre à d'autres questions. Par exemple, l'évaluation de la performance des plaquettes stockées en ce qui concerne la coagulation sous écoulement.