Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion In vitro

L’objectif global de cette expérience est d’imiter la transfusion de plaquettes in vitro et de la tester à l’aide de l’hémostase sur du collagène, avec un flux hydrodynamique et une microscopie en temps réel. Les patients atteints de thrombocytopénie sont traités avec des concentrés de plaquettes stockés. Notre méthode est destinée à aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thrombose et de l’hémostase, en mettant l’accent sur la qualité et la fonction de ces concentrés de plaquettes stockés.

La valeur ajoutée de cette technique est qu’elle imite le flux sanguin, et prend ainsi en compte les influences de la rhéologie sur les cellules et les biomolécules participantes. La méthode actuelle évalue la liaison des plaquettes au collagène. Cependant, il peut également être appliqué à d’autres tissus adhésifs, y compris la plaque d’athérosclérose, les cellules endothéliales ou des protéines matricielles spécifiques comme le facteur de Von Willebrand et le fibrinogène.

Commencez par préparer la biopuce. Vortex et diluez un stock de collagène de un à 20 dans la solution isotonique de glucose du fabricant jusqu’à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Ensuite, pipetez 0,8 microlitre dans les voies d’une nouvelle biopuce jetable.

Remplissez toutes les voies à une extrémité de la puce et marquez-la comme l’extrémité de sortie. Ensuite, inspectez la puce pour vous assurer que chaque voie est remplie aux 5/6 de la solution et qu’il n’y a pas de bulles d’air. Ensuite, incubez la puce à quatre degrés Celsius pendant quatre heures ou toute la nuit dans un récipient humidifié et fermé.

Plus tard, bloquez les canaux codés en pipetant la mémoire tampon de blocage à l’autre extrémité des voies. Ensuite, pour chaque voie, coupez des longueurs de tube de 12 centimètres et fixez une goupille à chaque longueur de tube pour les rendre attachables à la biopuce. Rincez les longueurs des tubes avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue et d’un connecteur.

Ensuite, saturez-les avec un tampon bloquant et scellez-les dans un récipient humidifié pendant au moins une heure. Ensuite, préparez la pompe et le collecteur. Tout d’abord, rincez la pompe et le collecteur avec de l’eau distillée pour éliminer les bulles d’air.

Ensuite, fixez la biopuce à la platine du microscope automatisé. Mettez une extrémité des longueurs dans un tube de 1,5 millilitre rempli de HBS, puis fixez-les avec l’autre extrémité aux entrées de la biopuce. Placez les broches du collecteur dans les sorties de la biopuce.

Ensuite, rincez le système avec HBS à l’aide de la pompe. Tout tampon bloquant restant ou collagène mal adhérent sera ainsi éliminé. Cela termine les préparations de la chambre d’écoulement.

Commencez par regrouper les échantillons de sang récents de volontaires sains dans un tube à centrifuger conique. Faites tourner l’échantillon pendant environ 15 minutes à 250 Gs.Do utilisez pas le frein, car cela perturberait la phase inférieure peu tassée. Retirez et jetez le plasma riche en plaquettes et la couche leucocytaire.

Conservez les globules rouges contenant le moins de plaquettes possible, pour fabriquer le sang reconstitué. Maintenant, commencez à décongeler quatre millilitres de plasma de type AB à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et 20 secondes. Pendant ce temps, déterminez l’hématocrite des globules rouges emballés préparés à l’aide d’un analyseur d’hématologie automatisé.

Ensuite, déterminez la concentration plaquettaire d’une banque de sang préparée pour la reconstitution du sang entier. Calculez les volumes requis pour un millilitre de sang reconstitué avec 40 % d’hématocrite et 250 000 plaquettes par microlitre. Maintenant, à l’aide d’une pointe de pipette coupée, transférez le volume requis de globules rouges, de plasma et de concentré de plaquettes à la concentration souhaitée et un volume final d’un millilitre.

Mélangez le sang reconstitué avec des inversions douces et effectuez une numération globulaire complète. Ensuite, procurez-vous un tube de microcentrifugation préparé contenant Calcein AM et ajoutez-y un millilitre de sang reconstitué. Mélangez le sang avec le colorant en utilisant des inversions douces.

Ensuite, incubez le sang reconstitué pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Dans le logiciel, sélectionnez la région d’intérêt dans la voie de perfusion. Focus sur les fibres de collagène collées au bas des voies à un grossissement de 100x.

Idéalement, utilisez le contraste de phase ou le contraste d’interférence différentiel. Choisissez l’option Définir le Z actuel pour les régions de tuile sélectionnées pour fixer numériquement les positions Z sélectionnées. L’objectif optique avant la perfusion doit être porté sur le collagène d’améloblaste, mais cela peut être délicat.

Une alternative consiste à régler la mise au point du microscope sur les plaquettes initiales adhérentes. Maintenant, mélangez délicatement les échantillons et positionnez-les à côté de la biopuce. Ensuite, mettez le tube connecté à la voie observée dans le sang reconstitué.

Ensuite, à l’aide du logiciel contrôlant la pompe, appliquez une pression de 50 dyne par centimètre carré pour déplacer l’échantillon de sang dans la voie et commencer l’expérience. Pendant l’expérience, enregistrez des images toutes les 15 secondes pendant cinq minutes. Déterminez la cinétique de croissance du thrombus à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.

Dans ce cas, Zen 2012 est utilisé. Commencez par ouvrir le plugin d’analyse d’image pour déterminer la couverture de surface des plaquettes. Définissez le seuil de fluorescence dans l’onglet interactif Analyser pour définir l’intensité des pixels en corrélation avec un signal positif, qui proviendrait de plaquettes adhérentes.

Ensuite, utilisez la création de tables pour générer automatiquement une feuille de calcul avec une liste des surfaces des signaux positifs pour chaque point temporel. Enregistrez ces feuilles de calcul au format XML et ouvrez-les dans un tableur pour des calculs ultérieurs. À chaque point temporel, calculez la surface totale des objets sélectionnés et exprimez cette valeur en pourcentage de la surface couverte.

Ensuite, tracez les données en fonction du temps de perfusion, et calculez la pente par régression linéaire. Cela modélise la cinétique de croissance du thrombus de cette condition expérimentale particulière. Trois échantillons de sang total reconstitués identiques ont été perfusés simultanément sur des surfaces enduites de collagène.

Cela a donné un coefficient de variation de 8,7 %, ce qui suggère une variation intra-essai et intra-laboratoire acceptable pour la comparaison des tests. La transfusion a été simulée en reconstituant le sang avec le composant déficient. Plusieurs reconstitutions ont été réalisées avec des concentrations plaquettaires décroissantes.

Comme prévu, une numération plaquettaire plus faible a entraîné une diminution de l’adhérence en fonction du temps de perfusion. Ensuite, l’effet de la baisse de la température après le prélèvement sanguin et pendant la perfusion a été étudié. On a constaté que les thrombi se construisaient plus lentement lorsque le sang était refroidi à température ambiante.

Par rapport à un échantillon maintenu à 37 degrés Celsius tout au long de l’étude. En circulation, les plaquettes se lient aux sites de lésion des vaisseaux dans des conditions de stress élevé de la paroi pure. Comme prévu, la variation de la vitesse dans les chambres d’écoulement microfluidique a modifié l’adhésion plaquettaire totale.

Ces conditions modifient également la cinétique de croissance du thrombus. Après avoir regardé cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de chambre d’écoulement microfluidique en utilisant du sang reconstitué pour tester la qualité et la fonction des concentrés de plaquettes stockés. Cette technique peut être réalisée en environ sept heures.

expériences en chambre d’écoulement microfluidique ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transfusion de plaquettes pour explorer l’impact des variables de don, de préparation et de stockage. L’inactivation des agents pathogènes en est un exemple pertinent. Nous avons donné l’exemple d’un seul sujet expérimental.

Cependant, les variations de la concentration en calcium, le stress pur et simple et les revêtements de surface peuvent être utilisés pour répondre à différentes questions de recherche. De manière similaire à cette procédure, d’autres mesures dans des chambres d’écoulement microfluidique peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, la performance des plaquettes stockées à la coagulation sur le flux.