Name: Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion In vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez la microfluidique flux chambers pour modéliser l'hémostase et la transfusion plaquettaire in vitro. Cette méthode évalue la fonction des plaquettes stockées sur collagène sous écoulement hydrodynamique.

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Ce protocole suit les lignes directrices éthiques institutionnelles pour la recherche sur des échantillons humains et le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les bailleurs de fonds impliqués. Approbation pour les expériences décrites ici a été obtenu à partir de la commission d&#39;examen institutionnel de l&#39;Hôpital universitaire d&#39;Anvers. Nota: Les indications de température sont toujours la température ambiante, sauf indication contraire. Installation 1. Préparation Chambre de débit <ol><li> Lanes Préparation, tubages et Pins <ol><li> Vortexer la suspension de collagène vigoureusement et on dilue au 1/20 dans la solution de glucose isotonique fourni par le fournisseur à une concentration finale de 50 pg / ml. Note: Nous utilisons le collagène de tendon équin, principalement composé de type fibrilles I. Le type de collagène équin I est souvent désigné comme &quot;Horm&quot; collagène et est la norme d&#39; or pour ce type de dosage 9 pour des raisons historiques, ainsi que biologiques. humain de type III, le collagène peut aussi être utilisé, mais the fibrilles manteau moins bien et la réponse plaquettaire est pas aussi forte. D&#39; autres surfaces de revêtement peuvent également être utilisés, par exemple , facteur de von Willebrand (VWF), le fibrinogène, la fibronectine, la laminine, la vitronectine, la thrombospondine-1 , ou des combinaisons de ceux - ci 16. </li><li> Prenez une nouvelle biopuce jetable du conteneur du fournisseur. Les dimensions des biopuces sont utilisées ici 0.4W x 0,1 H x 20L mm 3. </li><li> Pipet 0,8 ul dans la voie (s) de la biopuce microfluidique sur une extrémité de la puce et marquer comme sortie. Assurez-vous que la voie est rempli 5/6 avec le collagène contenant une solution de revêtement préparée en 1.1.1. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air. Remarque: Les canaux sont partiellement recouverts pour éviter l&#39;accumulation de fibres de collagène à l&#39;entrée du canal (voir la discussion). </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 4 heures ou pendant une nuit dans un récipient fermé et humidifiée. </li><li> Bloquer les canaux revêtus par pipetage du tampon de blocage (1,0% (p v) de sérum / albumine bovine à unej 0,1% (p / v) de glucose à 10 mM, 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), une solution saline tamponnée (HBS, 0,9% (p / v) de NaCl, pH 7,4) à l&#39;autre extrémité et une marque comme entrée. Assurez-vous que la voie est complètement rempli avec le tampon de blocage évitant les bulles d&#39;air. </li><li> Couper un tube à longueur égale (12 cm). Utilisez un par voie et connecter chaque tube avec une épingle. Par exemple, une expérience comparant deux conditions, courir en double exemplaire, il faudra quatre tronçons de tubes et quatre broches à préparer. </li><li> Rincer le tube avec de l&#39;eau distillée en utilisant une seringue et une aiguille 26 G, ou les connecteurs annexés. </li><li> Saturer le tube avec un tampon de blocage. Conserver dans un récipient fermé et humidifié pour un minimum de 1 heure. </li></ol></li><li> Préparation de la pompe et de collecteur <ol><li> Rincer la pompe et le collecteur avec de l&#39;eau distillée, éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Aspirer le tampon de blocage de la voie (s) de biopuce en utilisant la pointe de 10 pi fixe à la sortie. Nettoyer la surface dela biopuce avec une poussière de précision sans essuyage et l&#39;alcool dénaturé pour éliminer les empreintes et la poussière. </li><li> Fixer la biopuce sur une platine de microscope automatisé. Si plus d&#39;une voie est utilisée simultanément en une seule opération, connectez le à huit voies répartiteur collecteur à la sortie de biopuce. Note: Les huit voies collecteur répartiteur est un morceau de matériel (figure S1) relié à la pompe et la biopuce. Il permet le fonctionnement de tous les (huit) des voies disponibles sur une biopuce ou une combinaison de voies de circulation, qui peuvent être définis par l&#39;opérateur dans le logiciel qui l&#39;accompagne. </li><li> Utilisez les broches dans le tube pour les fixer dans l&#39;entrée de biopuce. Placer l&#39;autre extrémité du tube (sans broche) dans un tube à essai conique de 1,5 ml rempli avec du HBS. Rincer tous les tuyaux et leurs voies connectés avec 1 ml HBS en utilisant la pompe, de façon à éliminer reste du tampon de blocage et mal adhérer collagène. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des échantillons de sang <ol><li> Collecte et séparation desensemble du sang frais à partir d&#39; un volontaire sain. 17 <ol><li> Recueillir les premiers millilitres de sang dans un tube sous vide contenant de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) comme anticoagulant et utiliser exclusivement cet échantillon pour numération globulaire complète (CBC) avec un analyseur d&#39;hématologie automatisé. </li><li> Collecter un volume de sang dans un anticoagulant approprié en utilisant des tubes sous vide. Anticoagulants standard pour les expériences de la chambre d&#39;écoulement sont l&#39;héparine ou l&#39;hirudine lorsque la fibrine formation ne fait pas partie du protocole d&#39;étude et de citrate de sodium quand il est. Remarque: L&#39;héparine a été utilisée comme anticoagulant pour toutes les expériences décrites dans les résultats. Note: La quantité de sang est fonction du nombre d&#39;essais à effectuer. Environ 1 tube (7 ml) à 3 voies. </li><li> Placer les tubes sur un rotateur en attendant la reconstitution du sang. Remarque: Le test doit être terminé à moins de 3 h de saignées. </li><li> Centrifuger pendant 15 min à 250 g pour préparer plasma riche en plaquettes (PRP). Ne pas utiliser la pause de centrifugation pour éviter de perturber le culot légèrement tassées. <ol><li> Lorsque plus d&#39;un tube a été recueilli, en commun le sang dans un seul tube de centrifugation conique. Remarque: La centrifugation peut être effectuée plus lentement ou moins long terme, en fonction du rendement du PRP et différentiel cellule &quot;contamination&quot; préférée. </li></ol></li><li> Retirer et jeter le PRP et le manteau buffy rendement des cellules de globules rouges avec quelques plaquettes. Remarque: Le nombre de plaquettes dans la fraction de globules rouges est de 13 ± 5 x 10 3 par pi (moyenne ± écart type, n = 12) en moyenne dans nos mains. </li></ol></li><li> Reconstitution du sang <ol><li> groupe sanguin AB Thaw (Rhésus D négatif) du plasma à 37 ° C pendant 5 min et 20 sec par 4 ml. </li><li> Déterminer le taux d&#39;hématocrite des globules rouges concentrés préparés 2.1.5 en utilisant un analyseur hématologique automatisé. </li><li> Déterminer la concentration en plaquettes dans la banque de sang préparé concentré plaquettaire that sera utilisé pour reconstituer la fraction de globules rouges ci-dessus. </li><li> Calculer le volume de globules rouges concentrés et un concentré de plaquettes qui produiront 40% d&#39;hématocrite et 250 x 10 ^ plaquettes / ul dans un échantillon de 1 ml. Note: D&#39;autres titres cibles des cellules peuvent être fixés de façon arbitraire, en fonction du protocole d&#39;étude. </li><li> Transfert concentré de globules rouges et le plasma dans un nouveau tube à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette écrêté et ajouter le concentré de plaquettes jusqu&#39;à un volume de 1 ml d&#39;échantillon est atteinte. Remarque: En fonction des variables étudiées, la fraction de plasma doit être égale dans tous les échantillons reconstitués, car le plasma a une influence significative sur le taux de formation de thrombus. Par exemple, répétée congélation-décongélation ou de plasma provenant de donneurs différents ou sur différents anticoagulants peuvent influencer le résultat. </li><li> Mélanger le sang reconstitué doucement en inversant et effectuer une CBC. </li><li> Préparer un &quot;blanc&quot; échantillon de contrôle dans lequel le volume de la fraction plaquettaire est remplacépar le même volume de 0,9% (m / v) de chlorure de sodium dans de l&#39; eau pour déterminer la concentration de plaquettes endogènes ( à savoir les plaquettes sanguines non bancaires) dans le sang reconstitué à l&#39; aide d&#39; une SRC. </li></ol></li><li> étiquetage <ol><li> Pipeter 1 ml de sang reconstituées dans un tube à essai contenant 1 ul de 5 mM calcéine AM (5 uM de concentration finale). Note: D&#39; autres colorants cellulaires peuvent être utilisés 14. </li><li> Mélanger doucement en inversant. </li><li> Incuber pendant 5 min à 37 ° C avant utilisation. </li></ol></li></ol> 3. Perfusion Assay <ol><li> Concentrez l&#39;objectif sur les fibres de collagène collées au fond des ruelles. Idéalement, utilisez contraste de phase ou de réglages contraste interférentiel différentiel (DIC) pour cette stratégie de focalisation. Sélectionnez &#39;Z Set actuel pour les régions de tuiles sélectionnées »dans le logiciel d&#39;expérimentation pour résoudre numériquement les Z-positions sélectionnées. </li><li> Sélectionner une région d&#39;intérêt (ROI) dans la voie (xy) dans le logiciel d&#39;expérimentation des microscope qui sera enregistrée au cours de l&#39;expérience. Remarque: Le retour sur investissement peut être une zone de surface choisie arbitrairement dans une voie de perfusion. Il est conseillé de ne pas analyser la formation de thrombus à proximité de l&#39;entrée et la sortie d&#39;une voie afin d&#39;éviter les effets secondaires du profil d&#39;écoulement variable dans cette région, même si cela est relativement faible. La surface spécifique du ROI doit contenir un nombre de plaquettes ou de thrombus pour permettre le nivellement du signal. Dans ce protocole , le retour sur investissement est un agrégat numériquement cousu de trois images côte à côte de taille égale entraînant 0,62 mm 2 dans le milieu de la 2 cm de long couloir. </li><li> Mélanger les échantillons doucement en inversant et positionner ceux-ci à côté de la biopuce sur la scène automatisée. </li><li> Placer le tuyau qui est relié à l&#39;entrée de la biopuce dans les tubes à essai contenant des échantillons de sang reconstituées. </li><li> Lancez la pompe à 50 dyne / cm 2 (ou d&#39; autres contraintes de cisaillement comme souhaité) pour les canaux liés tubes à essaicontenant les échantillons de sang reconstituées à l&#39;aide du logiciel de la pompe. Remarque: Les autres contraintes de cisaillement peuvent être utilisés. </li><li> Enregistrement des images toutes les 15 sec pendant 5 min en temps réel en utilisant le logiciel d&#39;acquisition et de l&#39;expérience du microscope. Remarque: D&#39;autres séries de temps peut être utilisé en fonction de la configuration expérimentale. Note: Nous utilisons généralement un grossissement 100X (objectif 10X et 10X lentilles), mais supérieur (ou inférieur) grossissement peut facilement être utilisé comme une alternative. </li></ol> 4. Laver Out <ol><li> Laver tous les tubes fixé à la sortie et raccordée au collecteur à canaux multiples ou à la pompe à l&#39;aide d&#39;eau distillée, suivi d&#39;hypochlorite de sodium (eau de Javel) 0,5% (v / v) et enfin 0,1 M de NaOH dans l&#39;eau. Jeter le tube épinglé à l&#39;entrée de la biopuce comme des déchets dangereux. </li></ol> Analyse 5. Données <ol><li> Déterminer la cinétique de croissance du thrombus avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;images. Les commandes suivantes sont spécifiques pour ZEN2012. <ol&gt; <li> Ouvrez l&#39;analyse plugin image pour déterminer la couverture de surface des plaquettes. </li><li> Régler le seuil de fluorescence dans l&#39;onglet Analyser Interactive pour définir l&#39;intensité de pixel qui est en corrélation avec un signal positif, à savoir une plaquette collée ou de plaquettes adhérentes. </li><li> Utilisez Créer des tables pour générer automatiquement une feuille de calcul qui contiendra les zones de surface séparées (en pm 2) de ces &quot;objets&quot; contenant des pixels avec un signal entre les seuils sélectionnés. Cette opération est effectuée pour chaque point de temps. Remarque: Une fois les seuils de fluorescence ont été choisi, le logiciel d&#39;analyse détecte automatiquement des «objets» dans le champ de vision qui remplissent les critères. Ces objets sont thrombus, les petits agrégats de plaquettes ou de plaquettes individuelles et couvrent un certain nombre de pixels. Chaque objet est répertorié dans la feuille de calcul séparément. </li><li> Conservez ces feuilles de calcul au format XML et les ouvrir dans un programme de feuille de calculpour d&#39;autres calculs. </li><li> Nombre de zones de la surface des objets sélectionnés par sommation et diviser le résultat par la superficie totale du champ de mesure (pm 2). Cela donnera la couverture de surface relative (%). Faites-le pour chaque point de temps. </li><li> Tracer ces couvertures de surface en fonction du temps de perfusion et de calculer la pente de la régression linéaire, ce qui donne la cinétique de cette condition particulière de croissance du thrombus. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Microfluidiques expériences en chambre d&#39;écoulement sont un excellent outil pour étudier la fonction plaquettaire dans le sang circulant et sont utilisés pour évaluer l&#39; hémostase in vitro dans des contextes expérimentaux. Malgré une mauvaise standardisation interlaboratoires 9, nous démontrons que , dans notre laboratoire , la variation expérimentale est acceptable. Ceci permet de comparer de manière fiable des échantillons (appariés) dans une étude donnée. Ceci a été validé en utilisant le ...

Hémostase exige l&#39;activité combinée et régulée des cellules, des protéines, des ions et des tissus dans un contexte spatiotemporel limité 1. une activité non contrôlée peut conduire à une hémorragie ou d&#39;une thrombose et de la morbidité ou de la mortalité dans un spectre de troubles liés à la coagulation du sang. Une expérience de la chambre d&#39;écoulement microfluidique est une technique difficile qui imite l&#39; hémostase in vitro. Cette approche permet d&#39;étudier l&#39;interaction complexe des processus qui prennent part à l&#39;hémostase avec un rôle de premier plan pour les plaquettes sanguines. Suite à une lésion vasculaire, les plaquettes adhèrent aux protéines matrice sous-endothéliale exposée (glyco) pour empêcher la perte de sang. À la suite de l&#39; adhérence, les plaquettes d&#39; activer et de l&#39; agrégat en réponse à la signalisation automobile et paracrine qui conduit finalement à la formation d&#39;un réseau de plaquettes stabilisées par la fibrine et résultant en un solide, d&#39;une plaie 2 thrombus d&#39; étanchéité. Contrairement à la plupart des autres tests de la fonction plaquettaire, EXPERIments avec des chambres d&#39;écoulement prennent en compte le paramètre physique de l&#39; écoulement sanguin et par conséquent l&#39;influence de la rhéologie dans les cellules participant biomolécules et 3,4. expériences en chambre de débit ont généré des idées marquantes de l&#39;hémostase et de la thrombose en faisant varier les paramètres clés qui influencent hémostatique (sub) processus, y compris les profils matrice adhésive, rhéologie et de débit, la composition cellulaire, la présence de toxines ou des médicaments, la force ionique et beaucoup plus. Au cours des deux dernières décennies, à faible débit des expériences en chambre d&#39;écoulement nécessitant des volumes d&#39;échantillons de grande taille (10-100 ml) ont évolué vers des chambres microfluidiques souvent constituées de petites chambres à plaques parallèles et dont la technologie moderne pour perfuser le sang total dans des conditions mur de cisaillement contrôlées 5. Microscaling a augmenté de façon significative le débit dosage surtout parce que la configuration matérielle a simplifié et moins (sang) volume est nécessaire, ce qui rend l&#39;expérience Versati plus accessible etle. Par exemple, le sang de petits animaux de laboratoire peut maintenant être utilisé sans qu&#39;il soit nécessaire de sacrifier les animaux. Des échantillons de sang de souris génétiquement modifiées ont ainsi contribué à l&#39;identification de molécules clés favorisant ou inhibant l&#39; hémostase et de nouvelles idées de base 6. Les laboratoires de recherche spécialisés souvent utilisent encore sur mesure chambres d&#39;écoulement , par exemple de polydiméthylsiloxane (PDMS) 7 qui polymérise sur des moules lithographiées qui peuvent être blueprinted par le logiciel. La chambre résultant est peu coûteux, jetable et peut être facilement démonté pour analyse post-hoc. En outre, essentiellement toute la conception des navires, y compris les bifurcations ou des virages serrés peut être construit sur commande. Cet avantage est aussi son inconvénient puisque la normalisation était déjà le principal problème avec les expériences de la chambre d&#39;écoulement et PDMS sur mesure chambres n&#39;ont pas aidé cela. En plus de cette question particulière, le revêtement (conditions), des sondes fluorescentes, anticoagulant, templit- et le temps entre le prélèvement et l&#39; analyse sont tous mal standardisés 8. La normalisation de ces variables est difficile, mais néanmoins nécessaire pour permettre la comparaison des résultats entre les laboratoires. Ce sujet est le principal objet de la Société internationale de thrombose et d&#39; hémostase au sous-comité scientifique et de la normalisation sur Biorheology 9,10. Les concentrés plaquettaires (PC) sont transfusées chez les patients souffrant de diverses maladies qui causent la thrombocytopénie et / ou des saignements. Mais les plaquettes dans le PC sont connus pour désensibiliser, en particulier en fonction du temps de stockage 11, un processus de dégradation liée au vieillissement et communément appelée lésion de stockage des plaquettes. On prétend parfois que ces plaquettes restaurer en circulation une fois transfusé 12, mais la preuve de ceci est rare. En outre, la fonctionnalité des plaquettes constituant un PC ne sont pas systématiquement testé car la relation entre ces essais etl&#39; efficacité thérapeutique ou prophylactique ne sait pas 13. chambres d&#39;écoulement microfluidiques offrent un moyen d&#39;enquêter sur la fonction plaquettaire dans le PC pour optimiser la chaîne de manipulations entre la collecte et la délivrance. Il est un puissant outil de recherche pour (appariés) des comparaisons directes de PC comme nous l&#39; avons déjà publiés 14,15 et est décrite ici.

<table><tbody><tr><td>Tube de vacutainer BD avec EDTA&nbsp ;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>Tube de vacutainer BD avec héparine</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Tube de vacutainer BD avec citrate de sodium</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Tube de sang Hirudin</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD vacutainer Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>Aiguille de prélèvement sanguin avec support préfixé</td></tr><tr><td>Pointes de pipette 100-1 000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Tube 5 ml</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Seringue</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes de précision</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Nommé dans Figure S1 A comme 'Biochip’Vena8</td></tr> <tr><td>Tubing</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Nommé dans Figure S1 B comme 'Tube jetable</td></tr>' <tr><td>Aiguilles Vena8 Cellix</td><td></td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Nommé dans Figure S1 B comme 'Pin’Connectors</td></tr> <tr><td>pour câbles d’entrée unique de biopuces</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Nommé dans Figure S1 B comme 'Tube réutilisable' et 'Splitter’Boîte</td></tr> <tr><td>humidifiée</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pompe microfluidique logicielle Cellix</td><td></td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm</td><td>Collagen Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Collagène tendineux équin natif (type I) Solution de glucose isotonique pour diluer le collagène est complétée</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée HEPES (HBS)</td><td>dans la maison préparation</td><td>dans la maison Préparation maison</td><td>10 mM 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine acide éthananesulfonique (HEPES) solution saline tamponnée (0,9 % (p/v) NaCl, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Tampon bloquant</td><td>dans la préparation maison</td><td>Préparation maison</td><td>1,0 % (p/v) d’albumine sérique bovine et 0,1 % (p/v) de glucose dans HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sondes moléculaires</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel 10 %</td><td>dans la maison préparation</td><td>dans la maison préparation</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M NaOH</td><td>dans la maison préparation</td><td>dans la maison</td><td></td></tr><tr><td>Alcool dénaturé</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>avec Multiflow8. Nommé dans Figure S1 A comme 'Pompe' et 'Microscope collecteur'</td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>équipé d’une caméra à LED colibri et d’une caméra CCD haute résolution</td></tr><tr><td>Microscope logiciel&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>Analyseur d’hématologie</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de plaquettes</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau d’incubation</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>de marque</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Tube Roller</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d’amarrage stérile</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Scelleuse de tubes</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidique flux chambers utilisation de sang reconstitué au modèle hémostase et platelet transfusion<em&gt; in vitro</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Les plaquettes sanguines préparées pour la transfusion perdent progressivement leur fonction hémostatique pendant le stockage. La fonction plaquettaire peut être étudiée à l’aide d’une variété d’expériences in vitro (indirectes), mais aucune d’entre elles n’est aussi complète que les chambres d’écoulement microfluidique. Dans ce protocole, la reconstitution de sang frais thrombocytopénique avec des plaquettes de banque de sang stockées est utilisée pour simuler une transfusion de plaquettes. Ensuite, l’échantillon reconstitué est perfusé dans des chambres d’écoulement microfluidique qui imitent l’hémostase sur les protéines de la matrice sous-endothéliale exposées. Les effets du don de sang, du transport, de la séparation des composants, du stockage et de l’inactivation des agents pathogènes peuvent être mesurés dans des plans expérimentaux appariés. Cela permet une comparaison fiable de l’impact de chaque manipulation dans la préparation des composants sanguins sur l’hémostase. Nos résultats démontrent l’impact du cycle de température, des taux de cisaillement, de la concentration plaquettaire et de la durée de stockage sur la fonction plaquettaire. En conclusion, ce protocole analyse la fonction des plaquettes de la banque de sang, ce qui permet d’optimiser la chaîne de traitement, y compris la phlébotomie, le transport, la préparation des composants, le stockage et la transfusion.

Pour démontrer la variation intra-essai, trois échantillons de sang identiques reconstitués entiers ont été perfusés simultanément sur ​​collagène surfaces revêtues (figure 1). Il en est résulté un coefficient de variation de 8,7%. Cette statistique suggère intra-dosage acceptable et variation intralaboratoire permettant la comparaison fiable entre les échantillons liés. L&#39;entrée de la chambre d&#39;écoule...

La transfusion de plaquettes et l’hémostase ont été modélisées à l’aide de la reconstitution sanguine et des chambres de flux microfluidique pour étudier la fonction des plaquettes de banque de sang. Les données démontrent les conséquences de la lésion de stockage plaquettaire sur l’hémostase, in vitro.

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

L'objectif général de cette expérience est de reproduire in vitro une transfusion de plaquettes et de la tester à l'aide d'un modèle d'hémostase sur collagène, en conditions d'écoulement hydrodynamique et d'observation microscopique en temps réel. Les patients atteints de thrombopénie sont traités par des concentrés de plaquettes conservés. Notre méthode vise à répondre à des questions clés dans le domaine de la thrombose et de l'hémostase, en mettant l'accent sur la qualité et la fonction de ces concentrés de plaquettes conservés.La valeur ajoutée de cette technique réside dans le fait qu'elle imite l'écoulement sanguin, prenant ainsi en compte les influences de la rhéologie sur les cellules et les biomolécules impliquées. La méthode actuelle évalue l'adhésion des plaquettes au collagène. Toutefois, elle peut également être appliquée à d'autres tissus adhésifs, notamment la plaque d'athérome, les cellules endothéliales ou des protéines matricielles spécifiques telles que le facteur de Von Willebrand et le fibrinogène.Commencez par préparer le biochip. Vortexez et diluez un stock de collagène au 1/20 dans la solution glucosée isotonique fournie par le fabricant pour obtenir une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Ensuite, pipetez 0,8 microlitre dans les sillons d'un nouveau biochip jetable.Remplir toutes les voies à une extrémité de la puce et marquer cette extrémité comme étant la sortie. Ensuite, inspecter la puce pour s'assurer que chaque voie est remplie au cinq sixièmes par la solution et qu'aucune bulle d'air n'est présente. Puis, incuber la puce à quatre degrés Celsius pendant quatre heures ou toute la nuit dans un récipient fermé et humidifié.Par la suite, bloquez les canaux codés en pipettant du tampon de blocage dans l'autre extrémité des voies. Ensuite, pour chaque voie, coupez des morceaux de tube de 12 centimètres de longueur et fixez une épingle à chaque morceau de tube afin de pouvoir les attacher à la puce à ADN. Rincez les morceaux de tube avec de l'eau distillée à l'aide d'une seringue et d'un connecteur.Ensuite, les saturer avec du tampon de blocage et les placer dans un récipient humidifié pendant au moins une heure. Préparer ensuite la pompe et le collecteur. Rincer d'abord la pompe et le collecteur avec de l'eau distillée pour éliminer toute bulle d'air.Ensuite, fixez la puce à biopuce sur la platine du microscope automatisé. Insérez une extrémité des canaux dans un tube de 1,5 millilitre rempli de HBS, puis reliez-les par l'autre extrémité aux entrées de la puce à biopuce. Placez les broches du collecteur dans les sorties de la puce à biopuce.Ensuite, rincez le système avec du HBS à l'aide de la pompe. Tout tampon de blocage résiduel ou tout collagène mal fixé sera ainsi éliminé. Cela achève les préparatifs de la chambre d'écoulement.Commencez par regrouper des prélèvements sanguins récents provenant de donneurs sains dans un tube conique à centrifuger. Faire tourner l'échantillon environ 15 minutes à 250 G. N'utilisez pas le frein, car il perturberait la phase inférieure faiblement compactée. Retirez et jetez le plasma riche en plaquettes et le buffy coat.Conservez les globules rouges concentrés contenant le moins de plaquettes possible afin de préparer le sang reconstitué. Commencez maintenant à décongeler quatre millilitres de plasma de groupe AB à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et 20 secondes. Pendant ce temps, déterminez l'hématocrite des globules rouges concentrés préparés à l'aide d'un analyseur d'hématologie automatisé.Ensuite, déterminez la concentration de plaquettes d'un concentré de plaquettes préparé par une banque de sang afin de l'utiliser pour la reconstitution du sang total. Calculez les volumes requis pour un millilitre de sang reconstitué avec un hématocrite de 40 % et 250 000 plaquettes par microlitre. À présent, à l'aide d'une pipette à embout coupé, transférez les volumes requis de globules rouges, de plasma et de concentré de plaquettes jusqu'à la concentration souhaitée, et pour un volume final d'un millilitre.Homogénéisez le sang reconstitué par des inversions douces et effectuez un compte complet des éléments sanguins. Ensuite, prenez un tube microcentrifuge préparé contenant du Calcein AM, et ajoutez-y un millilitre de sang reconstitué. Mélangez le sang avec le colorant par des inversions douces.Ensuite, incubez le sang reconstitué pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Dans le logiciel, sélectionnez la région d'intérêt dans la voie de perfusion. Concentrez-vous sur les fibres de collagène adhérées au fond des voies avec un grossissement de 100x.De préférence, utilisez le contraste de phase ou le contraste interférentiel différentiel. Choisissez l'option régler le courant Z pour les régions sélectionnées afin de fixer numériquement les positions Z sélectionnées. La mise au point optique avant la perfusion doit être sur le collagène des améloblastes, mais cela peut être délicat.Une alternative consiste à régler la mise au point du microscope sur les plaquettes initialement adhérentes. Ensuite, mélangez délicatement les échantillons et placez-les à côté du biopuce. Puis, insérez le tube relié à la voie observée dans le sang reconstitué.Ensuite, à l’aide du logiciel de commande de la pompe, appliquez une pression de 50 dynes par centimètre carré pour faire pénétrer l’échantillon sanguin dans la voie et démarrer l’expérience. Pendant l’expérience, enregistrez des images toutes les 15 secondes pendant cinq minutes. Déterminez la cinétique de croissance du thrombus à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.Dans ce cas, Zen 2012 est utilisé. Commencez par ouvrir l'analyse d'image du plugin afin de déterminer la couverture superficielle des plaquettes. Réglez le seuil de fluorescence dans l'onglet analyser interactif pour définir l'intensité des pixels qui correspond à un signal positif, provenant des plaquettes adhérentes.Ensuite, utilisez la fonction de création de tableaux pour générer automatiquement un classeur contenant une liste des aires de surface des signaux positifs pour chaque point temporel. Enregistrez ces classeurs au format XML et ouvrez-les dans un tableur pour effectuer des calculs supplémentaires. Pour chaque point temporel, calculez la surface totale des objets sélectionnés et exprimez cette valeur en pourcentage de surface couverte.Ensuite, tracer les données en fonction du temps de perfusion et calculer la pente par régression linéaire. Cela modélise la cinétique de croissance du thrombus pour cette condition expérimentale particulière. Trois échantillons identiques de sang total reconstitué ont été perfusés simultanément sur des surfaces revêtues de collagène.Cela a donné un coefficient de variation de 8,7 %, suggérant une variation intra-test et intra-laboratoire acceptable pour la comparaison des tests. La transfusion a été simulée en reconstituant le sang avec le composant déficient. Plusieurs reconstitutions ont été réalisées avec des concentrations décroissantes de plaquettes.Comme prévu, des taux de plaquettes plus faibles ont entraîné une adhérence réduite en fonction du temps de perfusion. Ensuite, l'effet des températures diminuées après le prélèvement sanguin et pendant la perfusion a été étudié. On a observé que les thrombus se formaient plus lentement lorsque le sang était refroidi à la température ambiante.Par rapport à un échantillon maintenu à 37 degrés Celsius tout au long de l'étude. En circulation, les plaquettes se lient aux sites de lésion vasculaire dans des conditions de contrainte de cisaillement pariétal élevée. Comme prévu, la variation du taux de cisaillement dans les chambres d'écoulement microfluidiques a modifié l'adhésion plaquettaire totale.Ces conditions modifient également la cinétique de croissance du thrombus. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des expériences en chambre d'écoulement microfluidique en utilisant du sang reconstitué pour évaluer la qualité et la fonction des concentrés de plaquettes stockés. Cette technique peut être réalisée en environ sept heures.Les expériences menées avec des chambres d'écoulement microfluidiques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transfusion de plaquettes pour explorer l'impact des variables liées au don, à la préparation et à la conservation. Un exemple pertinent est l'inactivation des agents pathogènes. Nous avons donné l'exemple d'un seul sujet expérimental.Cependant, des variations de la concentration en calcium, du cisaillement et des revêtements de surface peuvent être utilisées pour aborder différentes questions de recherche. Des mesures similaires dans des chambres à écoulement microfluidiques peuvent être réalisées selon cette procédure afin de répondre à d'autres questions. Par exemple, l'évaluation de la performance des plaquettes stockées en ce qui concerne la coagulation sous écoulement.

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