Name: Imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles danalyser motilité gastro-intestinale chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Découvrez une technique d'imagerie vidéo pour cartographier la motilité colique chez la souris. Cette méthode permet d'étudier le système nerveux entérique et ses effets sur la fonction gastro-intestinale.

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JCB et ELH-Y ont été pris en charge par le ministère américain du programme de recherche sur l&#39;autisme CDMRP Défense (AR11034). NHMRC (1047674) à ELH-Y.Procédé mai Stewart Bourse-Université de confiance Melbourne financé bourse pour MS. Nous remercions Ali Taher, Fátima Ramalhosa et Gracia Seger des contributions techniques.

Contact avec les animaux et la dislocation cervicale des animaux avant toutes les expériences ont été réalisées dans le strict respect des protocoles approuvés par le Comité pour l&#39;expérimentation animale de l&#39;Université de Melbourne (Éthique ID: 1,212,494,7) 1. Tissue Collection et Dissection <ol><li> Euthanasier souris adultes par dislocation cervicale. Si possible, éviter l&#39;anesthésie pour éviter les influences sur la fonction de l&#39;intestin par l&#39;intermédiaire des récepteurs situés sur les populations neuronales d&#39;intérêt. </li><li> Enregistrez poids total du corps de l&#39;animal, la broche du corps (par l&#39;intermédiaire des quatre pattes, face ventrale exposée à expérimentateur) fermement à une carte de dissection à l&#39;aide d&#39;aiguilles hypodermiques (Taille: 20 G). </li><li> En utilisant des pinces à dissection et ciseaux; faire une incision à travers l&#39;épiderme recouvrant les couches musculaires abdominaux inférieurs. Continuer à utiliser les pinces et ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale le long de la ligne médiane de l&#39;abdomen au sternum. </li><li> Pour éviter la déshydratation des tissus, versez physaline gique (solution de Krebs: 118 NaCl, 4,6 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 11 D-glucose en mM - barboter à TA avec du gaz carbogène; 95% O 2 et 5 % CO 2 pour un minimum de 20 min) sur le contenu abdominal à intervalles réguliers (par exemple, tous les 30-60 sec) au cours du processus de dissection. </li><li> Pour isoler le côlon tout attaché à le caecum et le rectum, maintenez le caecum (situé à côté de l&#39;extrémité proximale du colon) doucement à l&#39;aide des pinces à dissection environ 4-5 cm au-dessus du corps de l&#39;animal tout en réduisant le mésentère utilisant des ciseaux fins de dissection. </li><li> Prenez soin de ne pas manipuler, étirer ou couper le tissu gastro-intestinal, tout en éliminant le mésentère attenant. </li><li> Retirer l&#39;excès de tissu (par exemple, de la vessie et les testicules urinaire). Avec des ciseaux de dissection grossiers, faire deux incisions verticales (soit environ 0,5 cm de la ligne médiane) pour couper l&#39;os du bassin sur eacôté ch du côlon. </li><li> Utilisez des ciseaux fins pour séparer le rectum attenant tissu pelvien et les garnitures entourant les muscles du côlon. </li><li> Placez le côlon pleine longueur (à partir du caecum à rectum) dans un bécher contenant du sérum physiologique (précédemment oxygéné avec carbogène) et de continuer à oxygéner à la température ambiante. Retirer le caecum et le rectum à l&#39;aide des ciseaux fins de dissection et de le remplacer dans le bécher. </li><li> pelotes fécales vides / contenu intestinal à partir de préparations coliques en appliquant une pression positive en douceur à la fin par voie orale en utilisant une seringue de 5 ml fixée à une pointe de pipette 200 pi rempli avec du sérum physiologique. Afin d&#39;orienter le tissu à l&#39;avenir, utiliser une tige d&#39;insectes à l&#39;occasion de l&#39;extrémité la plus proximale du colon, où des stries de la muqueuse sont visibles. <ol><li> Modifier la pointe de la pipette en plastique pour tenir la seringue de 5 ml en enlevant environ 1 cm de l&#39;extrémité la plus large / proximale en utilisant une lame de rasoir. Pour augmenter le débit, d&#39;élargir l&#39;extrémité distale / petit en coupant sur un angle (environ 45 ° C) en utilisant une lame de rasoir. </li></ol></li><li> Grip le tissu doucement à son extrémité proximale avec une pince de dissection du côlon, insérez la pointe de la pipette dans la lumière du côlon et du sérum physiologique rincer à travers la lumière. </li></ol> 2. Préparation du côlon tissus et expérimental mis en place pour l&#39;imagerie vidéo <ol><li> Sérum physiologique Flush travers tous les tubes attachés à un bain de deux organes chambrée mis en place (Figure 1 et Figure 3), en utilisant une seringue attachée à une pointe de pipette de 200 pi. Cette étape élimine les débris dans le tube qui pourrait bloquer l&#39;écoulement de la solution. Pour les tubes spécifications se réfèrent à la table des matières. </li><li> Veiller à ce que les chambres de bain d&#39;organe sont continuellement perfusées avec du sérum physiologique barboter avec carbogène (95% O 2 et 5% de CO 2, le taux de 5 ml min -1 débit). En utilisant une sonde de température à intervalles réguliers, en sorte que la température du bain est maintenue entre 33 ° C -37 ° C. </li><li> Remplir le réservoir d&#39;entrée connectée par l&#39;intermédiaire d&#39;un robinet à trois voies dans le tube d&#39;admission à environ 20 à 30 ml de solution saline physiologique en utilisant une seringue de 50 ml. </li><li> Pendant l&#39;expérience, maintenir la pression dans le réservoir d&#39;entrée en utilisant arubber bouchon d&#39;un tube de verre (5 mm de diamètre intérieur) insérée à travers son centre. Assurez-vous que l&#39;ouverture supérieure du réservoir d&#39;entrée est correctement scellé (avec le tube de verre intérieure restant descellé). </li><li> Placez le côlon (longueur 5-7 cm) dans la chambre de bain d&#39;organe, en vous assurant qu&#39;il est complètement immergée dans du sérum physiologique. </li><li> Cathétériser chaque extrémité du segment du côlon aux deux tubes d&#39;entrée / sortie immergée (entrée / tubes de sortie ayant un diamètre différent peut être modifiée en fonction de la taille de la lumière des tissus ex. Un tissu post-natal, des souris adultes et Guinée porc) en utilisant la norme de bain coton fil à coudre. Fixer l&#39;extrémité proximale du côlon à la tubulure d&#39;entrée et lal&#39;extrémité distale du côlon dans le tube de sortie (relié par l&#39;intermédiaire d&#39;un robinet à 3 voies à un tube d&#39;écoulement vertical; 6 cm de hauteur). Assurez-vous que le tissu est pas surchargés ou trop détendu après une canule pour éviter les interférences avec les mesures et les analyses futures. </li><li> Enregistrer la longueur du côlon en mesurant la distance entre les extrémités proximale et distale à l&#39;aide de canules 15 cm règle. Ceci est important pour l&#39;interprétation des variations de longueur de contraction, la vitesse de propagation et des points d&#39;initiation de la contraction. </li><li> Assurer une pression stable base luminale (cm H 2 O) est établie avant de commencer l&#39;expérience. Calculer la pression intracavitaire en mesurant la distance verticale à partir du tissu à la surface du bain de solution saline physiologique à l&#39;intérieur du tube en verre du réservoir d&#39;entrée (par voie orale) et le tube d&#39;écoulement vertical (anal). </li><li> Maintenir les préparations de tissu à une pression intraluminale constante (par exemple, 1 à 2 cm H 2 O) en faisant en sorte que le PRESSU d&#39;étanchéité de bouchon d&#39;entréere est maintenue constante et qu&#39;aucune blocages sont présents dans la mise en place. </li><li> Laissez le côlon à l&#39;équilibre dans du sérum physiologique pendant 30 minutes avant d&#39;enregistrer les mouvements intestinaux. Vérifiez la présence de blocages qui se posent dans les tubes de flux entrants ou sortants et les supprimer en appliquant une pression dans le réservoir d&#39;entrée ou en re-canulant les extrémités orales et anales du côlon. </li></ol> 3. Capture d&#39;image et protocole expérimental <ol><li> Mouvements intestinaux records en tant que fichiers vidéo à l&#39;aide d&#39;une caméra vidéo (30 images / s, 640 x 840 pixels) positionnés 10-15 cm au-dessus du bain d&#39;organe sur une réplique de laboratoire standard support (Figure 1). </li><li> Ouvrez Virtual Dub (logiciel de capture vidéo) à partir de l&#39;icône sur le bureau. Dans l&#39;onglet «Fichier», sélectionnez «capture AVI&quot; pour afficher l&#39;image de la caméra. Sur la &#39;Audio&#39; onglet désélectionner «permettre la capture audio &#39;pour désactiver le son. <ol><li> Dans l&#39;onglet vidéo sélectionnez «compression» et «DivX6.9.2. Codec &amp; #39; pour compresser des fichiers vidéo pour minimiser l&#39;utilisation de l&#39;espace de stockage. Cette fonction sera disponible sur l&#39;installation du logiciel de compression «DivX». </li></ol></li><li> Régler manuellement la position de la caméra de sorte que l&#39;ensemble du segment du côlon canule est visible (avec les régions canule immédiatement adjacentes aux bords verticaux de l&#39;image vidéo) via la fenêtre du logiciel de capture vidéo (voir Figure 1). Afin d&#39;améliorer la qualité de l&#39;image et de minimiser les réflexions, attacher un bouclier papier / carton sur le support de la caméra pour bloquer la lumière parasite sur le bain d&#39;organe. Optimiser la qualité vidéo en ajustant les paramètres de luminosité, contraste et l&#39;exposition en utilisant l&#39;interface du logiciel de la caméra. <ol><li> Avant l&#39;enregistrement, définir un nom de fichier spécifique; dans l&#39;onglet «Fichier», sélectionnez «fichier de capture Set &#39;et indiquez un nom unique pour la vidéo. </li><li> Commencer la capture vidéo en appuyant sur «fichier de capture&quot; de la &#39;capture&#39; barre d&#39;outils. Pour arrêter recording sélectionnez le bouton «Stop capture» ou la touche «Esc» sur le clavier. </li></ol></li><li> Remplacer le sérum physiologique contenue dans le réservoir d&#39;entrée avec une solution saline physiologique fraîche toutes les 30 min. <ol><li> pression luminale d&#39;enregistrement (voir 2.9) et en utilisant une sonde de température, de prendre note de la température du bain d&#39;organe. Répéter ces étapes tout au long de l&#39;expérience (par exemple, toutes les 30 min) afin d&#39;assurer que ces variables sont constantes. </li></ol></li><li> activité colique fiche au total pendant 3 heures (y compris l&#39;application de la drogue et de la durée de lavage). À des fins de stockage de données, les données d&#39;enregistrement de 15 min segments vidéo. Une expérience complète sera généralement composé d&#39;enregistrements vidéo 12 x 15 min. <ol><li> Fiche activité pendant 1 heure dans des conditions témoins (sérum physiologique). </li><li> Appliquer le médicament (superfusées soit dans le bain ou administré dans la lumière par l&#39;intermédiaire du réservoir d&#39;entrée) pendant 30 min à 1 h. Remarque: Différentes voies d&#39;administration peuvent yield effets différents 23. </li><li> Appliquer une solution saline physiologique fraîche au bain ou de la lumière pendant une période de sevrage de 1 h. </li></ol></li></ol> Traitement 4. Les données et génération de cartes spatiotemporelles <ol><li> Traiter chaque déconnecté d&#39;enregistrement vidéo en utilisant le logiciel en interne écrit en MATLAB (R2012a, Version 7.4, disponible sur demande) afin de produire des cartes spatio-temporels illustrant la motilité colique. <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;analyse de l&#39;icône sur le bureau. </li><li> Dans la fenêtre de commande, entrez &quot;Analyse2&quot; afin d&#39;ouvrir le panneau de contrôle de l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Utiliser la fonction de détection de bord pour générer des cartes spatio-temporelles en cliquant sur &quot;détection de bord pour les fichiers .avi&quot; dans la fenêtre du panneau de commande. Cette fonction permettra au logiciel d&#39;analyse de lire les vidéos recodé Audio Video Interleaved (AVI). </li><li> Effectuer les étapes suivantes de manière séquentielle pour générer des cartes spatio-temporelle en utilisant un adaalgorithme de détection de bord ptive. <ol><li> Ouvrez les fichiers vidéo enregistrés en sélectionnant l&#39;onglet &quot;Ajouter des fichiers&quot;, sélectionnez &quot;Open video &#39;et sélectionnez l&#39;emplacement des fichiers vidéo. </li><li> Des fichiers vidéo figurant dans le logiciel d&#39;analyse, sélectionnez le fichier d&#39;intérêt. </li><li> Sélectionner une région rectangulaire d&#39;intérêt dans le cadre de la vidéo, par exemple, sur toute la longueur du côlon, du point où le côlon est canulée par voie orale à la canulation anal. Faire en sorte que les points de canulation proximale et distale sont contiguës aux limites verticales de la région d&#39;intérêt. lignes de détection de bord (rouge et vert) seront automatiquement apparaissent en surimpression sur l&#39;image en temps réel. </li><li> Faire en sorte que les lignes de seuil de détection de bord sont à proximité immédiate du côlon à la fois des limites supérieures et inférieures du tissu du côlon (ce qui peut être optimisée pour chaque vidéo en modifiant des valeurs de seuil de détection sur le panneau de commande). Veiller à ce que le bord de détection lines sont continues sur toute la longueur de l&#39;image du côlon en ajustant le contraste et la luminosité à l&#39;aide du panneau de commande. </li><li> Entrez la longueur du côlon (mm) dans la boîte de dialogue largeur (comme enregistré dans l&#39;étape 2.7). Ensuite, sélectionnez &quot;Générer carte de chaleur&quot;. </li><li> Dans la fenêtre pop-up, sélectionnez un emplacement pour le fichier à enregistrer et spécifier un nom de fichier pour le plan spatio-temporel. </li><li> Sélectionnez le format &#39;.su2 »et sélectionnez« Ajouter à la liste&#39;. Remarque: format .su2 compresse les données à une taille de fichier et de plusieurs fichiers vidéo peuvent être ajoutés à la file d&#39;attente. </li><li> Sélectionnez &#39;Commencez détection »pour générer des cartes spatio-temporelles. </li></ol></li></ol> 5. Analyse des Plans spatiotemporelles <ol><li> Utiliser des cartes spatio-temporelle pour estimer les paramètres tels que la fréquence, la vitesse de propagation, la longueur et la durée de CMMCs, le diamètre de l&#39;intestin et le point de l&#39;initiation et la direction de contraction. <ol><li> Pour commencer à analyser spatio-temporellecartes, type &#39;analyse2 »dans la fenêtre de commande tel que décrit dans la section précédente. Au lieu de &quot;détection de Edge&quot;, sélectionnez le bouton «carte thermique d&#39;analyse&quot;. </li><li> Ouvrir la carte fichiers spatio-temporelles (fichiers .su2) en sélectionnant l&#39;onglet «Ajouter des fichiers» et en précisant l&#39;emplacement des fichiers obtenus précédemment .su2. </li><li> Une fois le plan spatio-temporel est visible à l&#39;écran, spécifier une plage de couleur sur le panneau de commande, veiller à ce que le minimum est fixé à 1. A noter que le maximum peut varier de 5 à 10 en fonction de la contractilité du tissu. </li><li> Sélectionnez &#39;Lock gamme de couleurs »pour assurer toutes les cartes à partir d&#39;une seule expérience sont analysés dans les mêmes conditions. </li><li> Assurez-vous que les paramètres de la zone de temps sont constants pour toutes les cartes spatio-temporelles d&#39;une expérience donnée. </li></ol></li><li> Afin de déterminer la fréquence CMMC, compter manuellement les contractions qui traversent plus de 50% de la longueur du côlon. Ces contractions peuvent être visualisée comme des stries rouge / orange (index standard de couleur HSV) sur la carte spatio-temporelle (voir la figure 2 pour un exemple). Autres contractions qui sont plus ou ne se propagent pas peuvent également être identifiés et quantifiés. </li><li> Si vous le souhaitez, effectuer une analyse plus approfondie à une résolution supérieure à partir de ces cartes. Par exemple, les propriétés détaillées, la vitesse et la durée de chaque contraction peuvent être examinées. <ol><li> Afin de mesurer la vitesse et la durée, sélectionnez le bouton &quot;Annoter ondes de contraction&quot; sur le panneau de contrôle de l&#39;analyse de la carte de chaleur. </li><li> Ensuite, un zoom sur chaque CMMC en cliquant sur le bouton &quot;Zoom&quot; et en sélectionnant la zone d&#39;intérêt. Puis cliquez sur le bouton &quot;annoter manuellement&quot; pour annoter chaque contraction en utilisant la souris pour dessiner une ligne à partir de la position la plus initiale à la fin de chaque contraction. Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la vitesse de propagation apparent et la durée de dilatations qui semblent se propager (par exemple, voir unefin al de cartes de la figure 2A, 2B). Remarque: Les données pour la vitesse et la durée apparaît sous la fenêtre de résultats. Ces valeurs peuvent être transférées à une feuille de calcul d&#39;intérêt en sélectionnant l&#39;onglet &quot;Données d&#39;exportation&quot;. annotations indésirables peuvent être supprimés en cliquant sur le bouton &quot;Supprimer annotations sélectionnés&quot;. </li></ol></li><li> Si l&#39;on désire utiliser les coordonnées x et y des cartes spatio-temporelles (temps et position le long du côlon, respectivement) pour déterminer la position d&#39;ouverture de petites contractions ou CMMCs. </li><li> De même, afin de déterminer les intervalles entre les contractions, utilisez la fonction &quot;Annoter&quot; pour mesurer la durée entre les contractions. Comme précédemment, ces résultats peuvent être exportés vers un tableur en sélectionnant l&#39;onglet &quot;Données d&#39;exportation&quot;. </li><li> Afin de mesurer la largeur de l&#39;intestin au repos, sélectionnez le bouton «Prendre section&quot; sur le panneau d&#39;analyse de la carte de chaleur. <ol><li> Sélectionnez &#39;Ajouter9; sur le panneau de sections temporelle. Double-cliquez à tout endroit de la carte afin de générer une ligne horizontale superposée sur la carte de chaleur. les données de diamètre Gut seront désormais affichés dans une nouvelle fenêtre. </li><li> Pour mesurer le diamètre du tube digestif, placez le curseur sur un pic et le creux adjacent à obtenir largeur moyenne de l&#39;intestin pour une condition expérimentale spécifique. Changements de diamètre du tube digestif peuvent être comparés entre les conditions expérimentales. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

En utilisant cette technique d&#39;imagerie vidéo, la fréquence CMMC a été mesurée comme une indication de la motilité du côlon dans le type sauvage et les souris NL3 R451C, un modèle de souris de troubles du spectre autistique 17. Nos résultats indiquent une réduction du nombre de CMMCs chez les souris mutantes NL3 R451C par rapport aux souris de type sauvage en présence de l&#39;antagoniste du récepteur 5-HT 04/03 Tropisetron suggérant que les souris NL3 R451C pré...

Le système nerveux entérique (ENS) est le réseau neuronal intrinsèque du tractus gastro-intestinal et module diverses fonctions telles que la digestion du contenu intestinal, l&#39;absorption de nutriments et la sécrétion et la réabsorption d&#39;eau. Les neurones de l&#39;ENS sont situés dans les myentériques et la sous-muqueuse plexus. Le plexus myentérique joue un rôle majeur dans la régulation de la motilité gastro-intestinale 1 alors que le plexus sous-muqueux est principalement impliquée dans le contrôle de la sécrétion 2,3. Le plexus myentérique est située entre les couches musculaires longitudinales et circulaires de la paroi gastro-intestinale. L&#39;activité contractile des couches de muscles lisses de la paroi intestinale facilite les fonctions principales du tractus gastro-intestinal et en mélangeant le contenu intestinal propulsion sur toute la longueur de l&#39;intestin 3. Bien que l&#39;innervation extrinsèque au tractus gastro-intestinal du CNS contribue à la fonction gastro-intestinale in vivo, L&#39;ENS est capable de réguler la fonction gastro-intestinale indépendamment. Cette caractéristique unique permet à l&#39;exploration fonctionnelle des circuits neuronaux entériques et leur contribution à la motilité gastro-intestinale ex vivo. Les complexes du côlon qui migrent à moteur (CMMCs) sont des événements spontanés neurogènes qui sont le motif du moteur prédominant observé dans le côlon de souris isolé en l&#39;absence de boulettes fécales 4-9. CMMCs sont définis comme des contractions rythmiques qui se propagent sur ​​une distance horizontale qui est au moins la moitié de la longueur totale du côlon (par exemple, à partir du caecum au rectum) 10. La relation entre CMMCs et les motifs contractiles qui propulsent pelotes fécales est pas encore clairement établie, cependant quelques différences pharmacologiques ont été signalés 11. Néanmoins, la capacité de l&#39;ENS de fonctionner indépendamment du système nerveux central ainsi que l&#39;existence de motifs de neurones moteurs à médiation dans le SIcôlon olated fournit un système de dosage idéal pour étudier des troubles de la motilité résultant d&#39;un dysfonctionnement ENS sous-jacent. La spontanéité de la motricité gastro-intestinaux fonctionnels permet des changements en réponse à des stimuli pharmacologiques pour être évalués. L&#39;utilisation de l&#39;imagerie vidéo et la cartographie spatio-temporelle a été développé afin d&#39;examiner quantitativement faible péristaltisme intestinal chez des cobayes 12. Ici, une technique ex vivo est décrite qui permet l&#39;étude des schémas de la motilité du côlon de souris en utilisant l&#39;imagerie et l&#39;analyse de ces enregistrements vidéo sur la construction à haute résolution (~ 100 um, de 33 msec) des cartes du diamètre du côlon en fonction de la position le long du côlon et de temps (cartes spatio-temporelles). En utilisant un logiciel interne de détection de bord (Analyse2; disponible sur demande), les données de pleine longueur segments coliques contractantes en temps réel sont traitées pour générer des cartes spatio-temporelles pour chaque expérience. Dans cette étape, vidéo (AVI) sont summarisée et convertis en cartes spatio-temporelles en utilisant Analyse2. Cartes spatio-temporelles (figure 2) représentent la contractilité dans le temps et permettent la mesure de plusieurs paramètres, dont la vitesse de propagation, l&#39;ampleur, la durée et la durée. diamètre de l&#39;intestin est également enregistrée pendant toute la durée de l&#39;expérience en tant que mesure de la contractilité globale du segment de tissu. Cette méthode peut être appliquée pour identifier les différences de point d&#39;initiation de complexes contractiles qui pourrait indiquer altérée connectivité neurale entérique. Un protocole d&#39;imagerie vidéo similaire conçu pour évaluer culot propulsion chez le cobaye a été rapporté 13 mais ici, nous présentons l&#39;application de l&#39;approche d&#39;imagerie vidéo pour la quantification de la motilité colique spontanée (ie, en l&#39;absence de pellets). Nous fournissons également des informations détaillées pour aider à la dissection et la préparation de tissu gastro-intestinal de l&#39;approche d&#39;imagerie vidéo. Ceprotocole fournit aux chercheurs un outil accessible et facile à reproduire pour l&#39;analyse de contrôle neural entérique de la fonction gastro-intestinale chez des modèles animaux de la maladie, y compris les modèles génétiques de souris. La technique d&#39;imagerie vidéo permet l&#39;analyse de la motricité colique en réponse à divers agents pharmacologiques. Les médicaments peuvent être administrés par l&#39;intermédiaire de la lumière intestinale ou du bain d&#39;organes externes de la préparation du côlon. Différentes régions du tractus gastro-intestinal de souris présentent des schémas de la motilité spécifiques tels que les petits segmentation CMMCs intestinal et dans le côlon. Cette technique a été utilisée pour identifier les différences de contrainte en petite fonction intestinale; la sensibilité différentielle pour 5-HT3 et 5-HT4 antagonistes ont été observés dans le jéjunum de Balb / c et des souris C57 / BL6 en raison de la nature polymorphique du gène TPH2 exprimée dans les deux souches 6. L&#39;effet de la 5-HT inhibition sur la motilité reste concontroversée, car les données contradictoires a été rapporté sur l&#39;importance d&#39;un développement endogène 5-HT sur le péristaltisme du côlon et CMMCs 14,15. Modifications de la motilité avant et pendant le développement postnatal 7, ainsi que les effets de mutations géniques sur motilité gastro-intestinale chez des modèles animaux de maladie 10 peuvent également être examinés par imagerie en utilisant vidéo. Ici, nous illustrons l&#39;utilisation du procédé à une étude de la motilité du côlon dans le modèle de souris NL3 R451C de l&#39;autisme, qui exprime une mutation faux-sens dans le gène codant pour la protéine NLGN3 d&#39;adhérence synaptique Neuroligin 3-16. Cette mutation a été identifiée pour la première chez les patients diagnostiqués avec un trouble du spectre autistique (TSA) 17, qui est fortement associée à un dysfonctionnement de GI 18-22. Nous avons examiné si la mutation R451C synaptique NL3 affecte sorties de neurones dans l&#39;ENS en utilisant la technique d&#39;imagerie vidéo. Nous présentons des données caractérisant CMMCs au départ et en réponse à la 5H sérotoninergiqueT 3/4 antagoniste du récepteur tropisétron dans le modèle de souris NL3 R451C de l&#39;autisme.

<table><tbody><tr><td><Réactifs >forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (MW : 58,44)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>KCl (MW : 74,55)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.2H2O (MW : 156,01)</td><td>Chem Supply</td><td>471-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 .7H20 (MW : 246,48)</td><td>Chem Supply</td><td>MA048</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O (MW : 147,02)</td><td>Chem Supply</td><td>CA033</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose anhydre (MW : 180,16)</td><td>Chem Supply</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (MW : 84,01)</td><td>Chem Supply</td><td>GA018-500G</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain d’orgue à deux chambres Dimensions : 14 cm x 8 cm x 3 cm</td><td>Laboratoire</td><td></td> de <td>contact sur mesure directement&nbsp ;</td></tr><tr><td>&nbsp ; 732 MASTIC MULTI-USAGE TRANSPARENT</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1890573</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 KIT D’ÉLASTOMÈRE DE SILICONE&nbsp ;</td><td>Dow Corning Australia Pty Ltd</td><td>1064291</td><td></td></tr><tr><td>STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>0912-2006</td><td></td></tr><tr><td>SERINGES avec embouts Luer Lock 50 ml, 20 ml, 10 ml</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1,57 mm (ID) x 3,16 mm (OD) - Tube Silastic</td><td>Masterflex</td><td>508-008</td><td></td></tr><tr><td>1,02 mm (ID) x 2,16 mm (OD) - Tube Silastic</td><td>Masterflex</td><td>508-005</td><td></td></tr><tr><td>1,50 mm (ID) x 2,50 mm (OD) - Tube Silastic</td><td>Masterflex</td><td>508-007</td><td></td></tr><tr><td>1,60 mm (ID) - Tube en silicone durci au platine&nbsp ;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 14</td><td></td></tr><tr><td>4,40 mm (ID) - Tube en silicone durci au platine&nbsp ;</td><td>Masterflex</td><td>96410 - 15&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>3,10 mm (ID) - Tube en silicone durci au platine&nbsp ;</td><td>Masterflex</td><td>96410 -16</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de laboratoire gradués en verre - 500 ml&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp ;</td><td>100-400</td><td></td></tr><tr><td>BOUCHON EN CAOUTCHOUC CHIMIQUE 57 x 65 mm&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOUCHON EN CAOUTCHOUC CHIMIQUE 29 mm x 32 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-eau&nbsp ; (thermorégulateur)&nbsp ;</td><td>Ratek&nbsp ;</td><td>TH7000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Logitech Webcam</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Société</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virtual Dub - 1.9 11</td><td>virtualdub.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2012a&nbsp ;</td><td>Graph Pad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logitech Webcam Logiciel</td><td>Logitech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles d&#39;analyser motilité gastro-intestinale chez la souris

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Le système nerveux entérique (ENS) joue un rôle important dans la régulation gastro-intestinal (GI), la motilité et peut fonctionner indépendamment du système nerveux central. Changements dans la fonction ENS sont une cause majeure de symptômes gastro-intestinaux et les maladies et peuvent contribuer à des symptômes gastro-intestinaux signalés dans les troubles neuropsychiatriques, y compris l&#39;autisme. Il est bien établi que les segments isolés du côlon génèrent, contractions rythmiques spontanées appelées colique Migration Motor Complexes (CMMCs). Une procédure pour analyser la régulation neurale entérique des CMMCs en ex vivo de préparations colon de la souris est décrite. Le côlon est disséqué de l&#39;animal et rincée pour enlever le contenu fécale avant d&#39;être une canule dans un bain d&#39;organe. Les données sont acquises par une caméra vidéo placée au-dessus du bain d&#39;organe et converti en cartes spatio-temporelles à haute résolution via un logiciel interne. Grâce à cette technique, les modes de contraction de base et les effets pharmacologiques sur la fonction ENS en colon segments peuvent être comparés sur 3-4 heures. En outre, la durée de propagation et la vitesse de CMMCs peuvent être enregistrées ainsi que les changements de diamètre de l&#39;intestin et de la fréquence de contraction. Cette technique est utile pour déterminer les caractéristiques de la motilité gastro-intestinaux chez des modèles de souris transgéniques (et dans d&#39;autres espèces, y compris le rat et le cochon Guinée). De cette manière, les changements induits dans pharmacologiquement CMMCs sont enregistrées chez les souris de type sauvage et dans le modèle de l&#39;autisme R451C Neuroligin-3 de la souris. En outre, cette technique peut être appliquée à d&#39;autres régions du tractus gastro-intestinal y compris le duodénum, ​​le jéjunum et l&#39;iléon et à différents âges de développement chez la souris.

Jusqu&#39;à 90% des patients atteints de TSA profiter d&#39;une gamme de troubles gastro-intestinaux, notamment la diarrhée et la constipation 18,24,25. Cependant, les causes sous-jacentes de ces problèmes gastro-intestinaux sont inconnus. Beaucoup de mutations identifiées chez des patients atteints de TSA sont associés à des protéines synaptiques contribuant à des modifications et des perturbations dans la transmission ou la fonction synaptique. Une telle mutation dans le gèn...

Cet article décrit une technique d’imagerie vidéo et de cartographie spatio-temporelle à haute résolution pour identifier les changements dans la régulation neuronale de la motilité colique chez les souris adultes. Des effets subtils sur la fonction gastro-intestinale (GI) peuvent être détectés à l’aide de cette approche dans des préparations de tissus isolés pour faire progresser notre compréhension de la maladie gastro-intestinale.

Imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles d&#39;analyser motilité gastro-intestinale chez la souris

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

L'objectif général de cette technique est d'identifier les modifications de la régulation neuronale de la motilité colique chez la souris à l'aide d'un enregistrement vidéo. Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences entériques, telles que savoir si des mutations génétiques subtiles dans des gènes neuronaux affectent la motilité colique. Le principal avantage de cette méthode est que le tissu est isolé, sans influence du système nerveux central, ce qui permet d'étudier le rôle du système nerveux entérique dans le contrôle de la motilité gastro-intestinale.Cette technique s'étend à la thérapie des maladies neurodéveloppementales telles que l'autisme, car des mutations génétiques modifiant la fonction synaptique dans le cerveau pourraient également altérer la motilité intestinale. Commencez par utiliser des pinces chirurgicales et des ciseaux pour pratiquer une incision à travers l'épiderme recouvrant les couches musculaires abdominales inférieures. Ouvrez la cavité abdominale en suivant la ligne médiane jusqu'au sternum.Humidifiez le tissu avec du sérum physiologique et utilisez la pince pour soulever délicatement le cæcum de quatre à cinq centimètres au-dessus de l'abdomen. Ensuite, à l’aide de ciseaux fins pour dissection, retirez le mésentère en prenant soin de ne pas toucher, étirer ou couper le tissu gastro-intestinal. Retirez la vessie, les testicules et tout autre tissu excédentaire.Ensuite, à l’aide de ciseaux de dissection grossiers, effectuez deux incisions verticales d’environ 0,5 centimètre du côté médian dans l’os pelvien de chaque côté du côlon, puis utilisez les ciseaux fins pour détacher le rectum des tissus pelviens adjacents. Retirez le mésentère du côlon et rincez le tissu colique en longueur complète dans un bécher contenant une solution saline physiologique. Pour éliminer les granulés fécaux et autres contenus intestinaux, coupez d’abord environ un centimètre à l’extrémité d’une pipette de 200 microlitres et fixez la pipette à une seringue de cinq millilitres remplie de solution saline physiologique.Ensuite, après avoir retiré le caecum et le rectum, insérez une épingle à insecte à l'extrémité la plus proximale du côlon, là où les stries de la muqueuse sont visibles, afin d'orienter le tissu. Maintenant, saisissez délicatement le tissu à l'extrémité proximale et insérez la pointe de la pipette dans la lumière, puis faites passer la solution saline à travers le côlon dans un récipient de déchets. Ensuite, à l'aide de la même seringue et de la même pointe de pipette, rincez tout débris présent dans le tube relié à un bain d'organes à deux chambres à l'aide d'une solution saline physiologique fraîche.Régler le bain d'organes de manière à ce que les chambres soient continuellement perfusées avec une solution saline physiologique saturée en carbogène, et utiliser une sonde de température pour vérifier régulièrement que la température de la solution saline reste comprise entre 33 et 37 degrés Celsius. Utiliser un bouchon en caoutchouc traversé au centre par un tube en verre de cinq millimètres de diamètre intérieur afin de maintenir la pression dans le réservoir d'entrée. Ensuite, plonger complètement un fragment de colon mesurant cinq à sept centimètres dans la chambre du bain d'organes, puis utiliser une pince et du fil de coton standard pour canuler l'extrémité proximale du colon sur le tube d'entrée et l'extrémité distale du colon sur le tube de sortie.Après avoir déterminé la distance de base entre les canulations proximale et distale du côlon, équilibrez le tissu dans une solution saline physiologique pendant 30 minutes. Pour enregistrer les mouvements intestinaux, pendant que le côlon s'acclimate, placez une caméra vidéo à 10 à 15 centimètres au-dessus du bain d'organe sur un support universel de laboratoire standard, puis configurez le logiciel approprié d'acquisition vidéo. Lorsque la caméra est prête, enregistrez quatre segments vidéo de 15 minutes chacun du côlon dans des conditions de contrôle.Ensuite, perfuser le médicament d'intérêt dans le bain d'organe pendant 30 à 60 minutes, en capturant quatre nouveaux segments vidéo de 15 minutes chacun. Enfin, remplacer la solution de traitement par du sérum physiologique frais et enregistrer quatre autres segments vidéo de 15 minutes chacun pendant la période de lavage d'une heure. Des cartes spatiotemporelles du côlon, en réponse aux différentes périodes de traitement, peuvent alors être générées.Pour évaluer si des mutations synaptiques modifient les complexes moteurs migrants coliques, ou CMMC, lorsque le système nerveux entérique est perturbé pharmacologiquement, dans cette expérience, l'antagoniste des récepteurs 5-HT3 et 4, la tropisetron, a été ajouté à la chambre de bain d'organe contenant la préparation colique. En présence de tropisetron, les souris NL3R451C ont présenté une diminution de la fréquence des CMMC par rapport à leurs congénères de type sauvage. Bien qu'aucune différence significative n'ait été observée entre la contractilité des souris de type sauvage et celle des souris NL3R451C dans des conditions contrôlées, la tropisetron a réduit de manière significative la fréquence des CMMC chez les souris de type sauvage comme chez celles de génotype NL3R451C.De plus, le tropisétron a exercé un effet plus marqué sur la fréquence des CMMC chez les souris NL3R451C par rapport aux animaux de type sauvage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette technique, veillez à ce que le bain d'organes soit maintenu à une température constante, qu'il reçoive un apport continu de carbogène et que le débordement de solution saline physiologique soit évité grâce à un système sous vide.Après avoir suivi cette procédure, d'autres techniques telles que l'immunocytochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la présence de modifications dans les proportions neuronales ou le nombre de cellules chez des souris présentant une motilité colique altérée. Depuis son développement, cette méthode a permis une variété d'études sur la motilité intestinale chez le cobaye et le lapin, le rat et d'autres espèces, et plus particulièrement dans ce cas chez la souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier les modifications dans la régulation neuronale de la motilité colique à l'aide de l'imagerie vidéo.

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Neurosciences

Evaluation de la motilité colique dans le côlon distal de porc Guinée avec le moniteur motilité gastro-intestinale (Gimm) est une approche simple et facile à apprendre à évaluer quantitativement la motilité propulsive dans le tractus gastro-intestinal.

Surveiller la motilité gastro-intestinale (Gimm)

Cette vidéo montre la visualisation des lymphocytes intra-épithéliales (IEL) γδ chez des souris transgéniques à l’aide de la microscopie confocale. L’intervention chirurgicale consiste à créer une ligne de perforation et à faire une incision longitudinale pour exposer la muqueuse intestinale et les villosités. Les souris transgéniques expriment des protéines rapporteures exclusivement dans des IEL γδ, ce qui permet leur suivi. L'imagerie intravitale capture le mouvement dynamique des IEL γδ...

Visualisation intravitale des lymphocytes intra-épithéliales gamma delta

La mesure in vivo des contractions des muscles lisses le long du tractus gastro-intestinal d’animaux de laboratoire reste une technique puissante, bien que sous-utilisée. Les jauges de contrainte flexibles à deux éléments ne sont pas disponibles dans le commerce et nécessitent une fabrication. Ce protocole décrit la construction de jauges de contrainte fiables et peu coûteuses pour une implantation aiguë ou chronique chez les rongeurs.

Fabrication et implantation de miniatures à double élément jauges de contrainte pour mesurer<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastro contractions chez les rongeurs.

En utilisant des souris rapporteures transgéniques et des marqueurs fluorescents injectables, la microscopie confocale à disque rotatif intravital à long terme permet de visualiser directement le comportement des cellules myéloïdes dans l’adénome intestinal dans le modèle de cancer colorectal ApcMin/+.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique Apc Min / + Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Nous décrivons des méthodes de surveillance longitudinale de l’efficacité des traitements pour le traitement des pathologies du côlon chez la souris à l’aide d’un endoscope rigide. Ce protocole peut être facilement utilisé pour la caractérisation de la réponse thérapeutique d’une tumeur individuelle chez des souris vivantes et également pour le suivi d’une rechute potentielle de la maladie.

Évaluation non invasive de l&#39;efficacité de nouveaux traitements pour les pathologies intestinales en utilisant l&#39;imagerie endoscopique de série de souris vivantes

Les techniques d’enregistrement vidéo et de cartographie spatio-temporelle (STmap) récemment disponibles permettent de visualiser et de quantifier à la fois les modèles de propagation et de mélange de la motilité intestinale. L’objectif de ce protocole est d’expliquer la génération et l’analyse de STmaps à l’aide du système de surveillance de la motilité gastro-intestinale (GIMM).

Cartographie spatio-temporelle de la motilité<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Préparation des intestins

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Pour étudier comment l’intestin grêle traite les particules de différentes tailles, nous avons modifié une méthode in vivo établie pour déterminer le transit de l’intestin grêle.

Étude de la mécanodétection de l’intestin grêle murin des particules luminales

Ce protocole décrit une méthode d’immunocoloration de l’estomac entier modifiée à partir de la technique du « Swiss roll » initialement développée pour l’intestin murin.

Cartographie spatiale améliorée des couches de muscles gastriques de souris à l’aide d’une technique modifiée du Swiss roll

Une méthode de transfert de gènes dans le cerveau de souris en développement est décrit en utilisant une méthode unique de chirurgie et la forme particulière des électrodes. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique temporellement et spatialement, ce qui aidera de nombreux neuroscientifiques à étudier le développement du cerveau.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

Découvrez une technique d'imagerie vidéo pour cartographier la motilité colique chez la souris. Cette méthode permet d'étudier le système nerveux entérique et ses effets sur la fonction gastro-intestinale.

Imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles d'analyser motilité gastro-intestinale chez la souris

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