Name: Détermination du photorécepteur cellulaire Sensibilité spectrale dans un modèle Insecte de In Vivo intracellulaires Recordings (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Apprenez l'enregistrement intracellulaire pour déterminer la sensibilité spectrale des photorécepteurs dans l'œil composé d'un papillon in vivo. Cette méthode permet de prédire la vision des couleurs de l'insecte.

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Nous remercions la fin Rudy Limburg pour fabriquer le périmètre de bras articulés, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, et Raju Metherate pour nous prêter le matériel, et Almut Kelber et Kentaro Arikawa, pour l&#39;encouragement. Ce travail a été soutenu par une Fondation (NSF) Graduate Research Fellowship National Science à KJM et subvention NSF IOS-1257627 à la BAD

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

l&#39;enregistrement intracellulaire peut être une technique difficile à maîtriser en raison des nombreuses étapes techniques impliquées. Pour les expériences réussies de plusieurs points importants doivent être pris en considération. Tout d&#39;abord, il est important d&#39;avoir une table bien vibrationally isolé sur lequel l&#39;expérience est réalisée. De nombreux chercheurs utilisent des tables d&#39;air, qui séparent complètement le dessus de table de la base, ce qui donne l&#39;isolation des vibrations de qualité...

Les propriétés électriques des cellules telles que les neurones sont observées en mesurant le flux d&#39;ions à travers les membranes cellulaires comme un changement de tension ou de courant. Une variété de techniques électrophysiologiques ont été développés pour mesurer des événements bioélectriques dans les cellules. Neurones trouvés dans les yeux des animaux sont accessibles et leurs circuits sont souvent moins complexes que dans le cerveau, ce qui rend ces cellules de bons candidats pour l&#39;étude électrophysiologique. Les applications courantes de l&#39; électrophysiologie dans l&#39;œil comprennent électrorétinogramme (ERG) 1,2 et microélectrodes enregistrement intracellulaire. ERG consiste à placer une électrode dans ou sur l&#39;oeil d&#39;un animal, l&#39; application d&#39; un stimulus lumineux et en mesurant la variation de la tension en tant que somme des réponses de toutes les cellules voisines 3-6. Si l&#39;on est particulièrement intéressé à la caractérisation des sensibilités spectrales des cellules photoréceptrices individuelles, souvent plusieurs types de cellules répondent simultanément à des forces différentes à un stimulus donné; ainsipeut être difficile de déterminer la sensibilité des types cellulaires spécifiques à partir des données ERG surtout s&#39;il y a plusieurs types de cellules photoréceptrices spectralement similaires dans l&#39;œil. Une solution potentielle est de créer transgénique Drosophila avec le gène photorécepteur (opsine) d&#39;intérêt exprimé dans les cellules majorité R1-6 dans l&#39;œil, puis effectuer ERG 7. Les inconvénients potentiels de cette méthode non à faible expression de la protéine de photorécepteur 8, et la longue période de temps pour la génération et le dépistage des animaux transgéniques. Pour les yeux avec moins de types de photorécepteurs spectralement distinctes, l&#39; adaptation de l&#39;œil avec des filtres colorés peut aider à abaisser la contribution de certains types de cellules à l&#39;ERG, ce qui permet une estimation de la sensibilité spectrale maxima 9. l&#39;enregistrement intracellulaire est une autre technique où une électrode fine empale une cellule et un stimulus est appliqué. Les enregistrements d&#39;électrodes seulement que indivLa réponse de la cellule idual de telle sorte que l&#39; enregistrement à partir et à l&#39; analyse de plusieurs cellules individuelles peut donner des sensibilités spécifiques des types cellulaires 10-14 physiologiquement différents. Bien que notre protocole se concentre sur l&#39;analyse de la sensibilité spectrale, les principes de base de l&#39;enregistrement intracellulaire avec des électrodes pointues sont modifiables pour d&#39;autres applications. À l&#39;aide d&#39;une autre préparation d&#39;un échantillon, par exemple, et en utilisant des électrodes de quartz acérées, on peut enregistrer de plus profondément dans le lobe optique ou d&#39;autres régions du cerveau, en fonction de la question posée. Par exemple, le temps de cellules photoréceptrices individuelles 15 de réaction, l&#39; activité cellulaire dans l&#39;optique lobes 16 (lamina rachidien ou lobula 17), du cerveau 18 ou d&#39; autres noyaux 19 peuvent également être enregistrées avec des techniques similaires, ou des stimuli de couleur peut être remplacée par une polarisation 20 -22 ou le mouvement des stimuli 23,24. Phototransduction, le processus par lequel la lumièrel&#39; énergie est absorbée et convertie en un signal électrochimique, est un trait commun à l&#39; ancienne presque tous nos jours phylums animaux 25. Le pigment visuel trouve dans les cellules photoréceptrices et responsable de l&#39;initiation est rhodopsine cycle visuel. Rhodopsine chez tous les animaux sont constitués d&#39;une protéine opsine, un membre de la famille des récepteurs de G couplé à la protéine transmembranaire 7 et un chromophore associé qui est dérivé de la rétine ou une molécule similaire 26,27. Opsine séquence d&#39;acides aminés et la structure chromophore affecter l&#39;absorbance de la rhodopsine à différentes longueurs d&#39;onde de la lumière. Lorsqu&#39;un photon est absorbé par le chromophore de la rhodopsine est activé, initiant une cascade de protéine G dans la cellule qui conduit finalement à l&#39;ouverture des canaux ioniques liés à la membrane 28. Contrairement à la plupart des neurones, les cellules photoréceptrices subissent des changements potentiels graduées qui peuvent être mesurés comme un changement par rapport à l&#39;amplitude de la réponse à l&#39;évolution des stimulus lumineux. Typiquement, une donnéetype de photorécepteur exprime un seul gène opsin (bien que des exceptions existent 8,10,29-31). Sophisticated vision des couleurs, du type trouvé dans de nombreux vertébrés et des arthropodes, est atteint d&#39;un œil complexe de centaines ou des milliers de cellules photoréceptrices exprimant chacun un ou parfois les types de rhodopsine plus. L&#39;information visuelle est capturé en comparant les réponses sur la mosaïque de photorécepteur via la signalisation neuronale aval complexe dans l&#39;œil et le cerveau, ce qui entraîne la perception d&#39;une image complète avec la couleur et le mouvement. Après avoir mesuré les réponses d&#39;une cellule premières photorécepteur à différentes longueurs d&#39;onde de la lumière par enregistrement intracellulaire, il est possible de calculer la sensibilité spectrale. Ce calcul est basé sur le principe de Univariance, qui stipule que la réponse d&#39;une cellule de photorécepteur dépend du nombre de photons qu&#39;elle absorbe, mais pas sur les propriétés particulières des photons qu&#39;il absorbe 32. Tout photon qui est absorbed par rhodopsine induira le même genre de réponse. Dans la pratique, cela signifie que première amplitude de la réponse d&#39;une cellule augmentera en raison soit une augmentation de l&#39; intensité lumineuse (plus de photons à absorber), ou à un changement de longueur d&#39; onde vers son pic de sensibilité (probabilité plus élevée de rhodopsine absorber cette longueur d&#39; onde). Nous faisons usage de ce principe dans les réponses cellulaires relatives à l&#39;intensité connue et la même longueur d&#39;onde à des réponses à différentes longueurs d&#39;onde et la même intensité, mais la sensibilité relative inconnue. Les types de cellules sont souvent identifiées par la longueur d&#39;onde à laquelle leurs pics de sensibilité. Ici, nous montrons une méthode pour l&#39;enregistrement et l&#39;analyse de sensibilité spectrale des photorécepteurs dans l&#39;œil d&#39;un papillon intracellulaire, avec un accent sur qui rend cette méthode plus accessible à la communauté de recherche plus large. Bien que l&#39;enregistrement intracellulaire reste courante dans la littérature, notamment en ce qui concerne la vision des couleurs chez les insectes, nous avons trouvé that descriptions de matériaux et de méthodes sont généralement trop courte pour permettre la reproduction de la technique. Nous présentons cette méthode dans le format vidéo dans le but de permettre sa réplication plus facile. Nous décrivons également la technique en utilisant un équipement facile à obtenir et abordable. Nous nous adressons à des mises en garde communes qui sont souvent pas signalés, qui ralentissent la recherche lors de l&#39;optimisation d&#39;une technique nouvelle et complexe.

<table><tbody><tr><td>Plusieurs</td><td></td><td></td><td>espèces locales disponibles, nécessitent des permis USDA pour l’expédition. Carolina Bio Supply propose plusieurs espèces d’insectes qui peuvent être commandées aux États-Unis sans avoir besoin de permis supplémentaires</td></tr><tr><td>Grand cylindre</td><td></td><td></td> en plastique <td>Toute chambre qui reste humidifiée fonctionnera</td></tr><tr><td>Pinles à insectes, taille 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100 % Desert Mesquite Honey Trader</td><td>Joe’s</td><td></td><td>Toute solution de miel ou de saccharose fonctionnera</td></tr><tr><td>Lampe à arc au xénon</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel fait désormais partie de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel</td><td>Instruments 68805</td><td>Oriel fait désormais partie de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel</td><td>Instruments 11190</td><td>Oriel fait désormais partie de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel fait désormais partie de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Transporteur ferroviaire, petit (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel fait maintenant partie de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Adaptateur de filetage, 8-32 mâle à 1/4-20 mâle, paquet de 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Poteau de montage optique, 1,0 po, 0,5 po de diamètre inoxydable, 8-32 & 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>Support de poteau optique antidérapant, 2 po, 0,5 po. Diamètre des poteaux, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Monture d’objectif fixe, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Monture d’objectif fixe, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de lentille à condenseur</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Lentille convexe en silice, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Roue à filtres à six positions, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Moyeu à montage sur roue à filtres</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Lentille concave en silice, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Support de collimateur</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Sonde à faisceau de collimation</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Convertisseur de virole, terminaison SMA à virole standard de 11 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Cet adaptateur permet à la fibre optique de s’insérer dans le support du collimateur.</td></tr><tr><td>600 &mu ; Câble obtique à fibre UV-vis de diamètre</td><td>m Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel fait désormais partie de Newport Corporation</td></tr><tr><td>Shutter avec unité d’entraînement</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr> UV <tr><td>Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ND métallique en silice fondue UV, 1.0 OD</td> Filtre ND métallique en silice fondue UV <td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr>, <tr><td>2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ND métallique en silice fondue UV, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lampe</td><td>Ocean Optics</td><td>Spectromètre LS-1-Cal</td><td></td></tr> Ocean <tr><td>Optics</td><td></td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td> Filtre passe-bande d’interférence, <td></td><td></td></tr><tr><td>300 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 310 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 320 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 330 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 340 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 350 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 360 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 370 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 380 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 390 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 400 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 410 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 420 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 430 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 440 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 450 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 460 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 470 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 480 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 492 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande interférentiel, 500 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 510 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande interférentiel, 520 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 532 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 540 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande interférent, 550 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 560 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 570 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 580 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 589 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 600 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 610 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 620 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 632 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 640 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 650 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 660 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 671 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande interférentiel, 680 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 690 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande d’interférence, 700 nm&nbsp ;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr>Cage <td></td><td></td><td>de Faraday</td><td>Toute structure métallique qui peut être mise à la terre et qui s’adapte à la configuration expérimentale fonctionnera.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope, grossissement 6X, 12X, 25X, 50X</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>N’importe quel stéréomicroscope fera l’affaire</td></tr><tr><td>Support de microscope avec bras oscillant et base lourde</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>N’importe quelle base lourde avec bras</td></tr><tr><td>fera l’affaire Bras</td><td></td><td></td> à cardan <td>Construit sur mesure, Voir Figure 4</td></tr><tr><td>Illuminateur haute intensité Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>Pour l’échantillon d’éclairage</td></tr><tr><td>Guide de lumière à col de cygne Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>N’importe quel guide de lumière à col de cygne fera l’affaire</td></tr><tr><td>Table en marbre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table en bois</td><td></td><td></td> surélevée <td>Un trou doit être percé à travers cette table afin que le bac à sable puisse reposer sur la table en marbre en dessous</td></tr><tr><td>Boîte en bois remplie de sable</td><td></td><td></td><td>construite sur mesure, n’importe quelle boîte avec du sable</td></tr><tr><td>Manipulateur</td><td>Carl Zeiss - Iéna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porte-électrode</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platine</td><td></td><td></td><td></td>d’échantillon</tr><tr><td>Fils à pince crocodile pour la mise à la terre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil</td><td></td><td></td><td></td>de cuivre isolé</tr><tr><td>Fil d’argent, 0,125 mm de diamètre</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>câbles</td> <td>BNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Préamplificateur avec tête</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Réducteur de bruit</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope, 30 MHz, 2 canaux, Dual Trace, Alt-triggering, sans sonde</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC Adaptateur</td><td></td><td></td><td></td>en T</tr><tr><td>Matériel Powerlab 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Labchart</td><td>Instruments ADI</td><td>Chart 5</td><td></td></tr><tr><td>Générateur d’impulsions 10 MHz</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipettes en verre</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilliqué avec filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Tube <td></td><td></td><td></td><td>en plastique fendu</td></tr><tr><td>Cire</td><td></td><td></td><td></td>à basse température</tr><tr><td>de fusion Fer à souder</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme avec base magnétique à rotule</td><td>photo et vidéo</td><td></td><td></td>Hama double</tr><tr><td>tranchant en acier au carbone, lame de rasoir cassable</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détermination du photorécepteur cellulaire sensibilité spectrale dans un modèle insecte de<em&gt; in vivo</em&gt; intracellulaires recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

l&#39;enregistrement intracellulaire est une technique puissante utilisée pour déterminer comment une seule cellule peut répondre à un stimulus donné. Dans la recherche de la vision, l&#39;enregistrement intracellulaire a été historiquement une technique couramment utilisée pour étudier la sensibilité des cellules photoréceptrices individuelles à différents stimuli de lumière qui est encore utilisé aujourd&#39;hui. Cependant, il reste un manque de méthodologie détaillée dans la littérature pour les chercheurs qui souhaitent reproduire des expériences d&#39;enregistrement intracellulaire dans les yeux. Nous présentons ici l&#39;insecte comme un modèle pour l&#39;examen de la physiologie de l&#39;œil plus généralement. cellules photoréceptrices insectes sont situés près de la surface de l&#39;œil et sont donc faciles à atteindre, et bon nombre des mécanismes impliqués dans la vision sont conservés à travers embranchements des animaux. Nous décrivons la procédure de base pour l&#39; enregistrement in vivo intracellulaire de cellules photoréceptrices dans l&#39;œil d&#39;un papillon, avec le but de rendre cette technique plus accessible aux chercheurs ayant peu d&#39; expérience dans l&#39; electrophysiology. Nous introduisons l&#39;équipement de base nécessaire, comment préparer un papillon vivant pour l&#39;enregistrement, comment insérer une microélectrode de verre dans une seule cellule, et, enfin, la procédure d&#39;enregistrement lui-même. Nous expliquons également l&#39;analyse de base de données de réponse premières pour la détermination de la sensibilité spectrale de types de cellules individuelles. Bien que notre protocole met l&#39; accent sur ​​la détermination de la sensibilité spectrale, d&#39; autres stimuli (par exemple, la lumière polarisée) et les variations de la méthode sont applicables à cette configuration.

Pour de nombreux éléments de la configuration de l&#39; enregistrement, une description écrite ne fournit pas assez de détails. Figure 1 est un schéma des composants impliqués dans la configuration d&#39;enregistrement complet. Dans la figure 2, les spectres sont tracés pour la lumière blanche et chaque filtre d&#39;interférence pour donner une idée de la raison pour laquelle un facteur de correction est nécessaire et ce qui est nécessaire pour calculer cette correction. La <st...

La technique électrophysiologique de l&#39;enregistrement intracellulaire est démontrée et utilisée pour déterminer les sensibilités spectrales des cellules photoréceptrices unique dans l&#39;œil composé d&#39;un papillon.

Détermination du photorécepteur cellulaire Sensibilité spectrale dans un modèle Insecte de<em&gt; In Vivo</em&gt; intracellulaires Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

L'objectif général de cette méthode d'enregistrement intracellulaire est de déterminer la sensibilité spectrale de cellules photoréceptrices individuelles dans l'œil composé d'un insecte in vivo. Cette méthode permet de déterminer si les longueurs d'onde de la lumière auxquelles une cellule est sensible sont influencées par des pigments filtrants. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, connaissant les sensibilités spectrales des photorécepteurs individuels, nous pouvons prédire la gamme de couleurs que l'animal est capable de percevoir.Pour vous préparer à l'enregistrement, allumez la lampe au xénon au moins 45 minutes avant l'expérience, et allumez l'étireuse de microélectrodes au moins 30 minutes avant d'étirer les électrodes en verre. Ensuite, allumez tout l'équipement d'enregistrement. Assurez-vous que l'obturateur est fermé par défaut, afin qu'aucune lumière ne traverse le câble en fibre optique.Ensuite, tirez des microélectrodes en verre borosilicaté fines à l’aide du tireur de microélectrodes. Remplissez les électrodes par l’arrière avec une solution de chlorure de potassium à trois molarités. Pour préparer l’échantillon, sous le microscope, fixez un papillon individuel à l’intérieur d’un petit tube en plastique à l’aide de cire chaude, de sorte que la tête soit immobilisée et dépasse par une extrémité du tube.Ensuite, fixez le rostre, les antennes et les ailes avec de la cire. Après cela, maintenez l'abdomen en place à l'aide d'un morceau de cire sèche. Gardez le tube humidifié en plaçant un morceau de tissu humide à l'intérieur, derrière l'abdomen de l'échantillon.Veillez à ce que l'échantillon soit complètement immobile. Ensuite, fixez le tube à l'aide d'un petit morceau de cire sur une petite plateforme munie d'une articulation sphérique attachée à une base magnétique. Sous un microscope stéréoscopique, insérez un fil d'argent dans la tête par la partie buccale, qui servira d'électrode de référence.Avant l'expérience, fixez définitivement le fil à la plateforme. Ensuite, faites une petite incision dans la cornée gauche à l'aide d'une lame de rasoir, puis scellez l'ouverture avec de la vaseline afin d'éviter la dessiccation. Une fois la cornée incisée, insérez l'électrode d'enregistrement dans l'œil le plus rapidement possible, car l'hémolymphe présente dans l'œil durcit rapidement et rend impossible l'insertion d'une électrode.Si possible, effectuez la dissection sur le dispositif où aura lieu l’enregistrement. Ensuite, reliez le fil de masse de la tête d’enregistrement à l’électrode de référence sur la plateforme de l’échantillon à l’aide des pinces crocodile. Fixez l’électrode sur le porte-électrode.Insérez ensuite le fil d'argent dans la solution de chlorure de potassium contenue dans la microélectrode. Utilisez une source lumineuse équipée d'un bras flexible pour éclairer l'échantillon sous un stéréomicroscope tout en abaissant l'électrode dans l'œil. Ajustez le porte-électrode afin que la microélectrode se trouve directement au-dessus du trou préalablement découpé dans la cornée.Ensuite, abaisser la microélectrode dans l'œil à l'aide du micromanipulateur jusqu'à ce qu'un circuit soit complété. Une fois à l'intérieur de l'œil, déplacer le stéréoscope à l'extérieur de la cage de Faraday. Éteindre la source lumineuse qui éclaire l'échantillon et laisser l'insecte dans l'obscurité pendant 10 à 20 minutes pour l'adaptation à l'obscurité.Vérifiez la résistance de l'électrode en appliquant un courant d'un nanoampère et en notant la variation de tension. La résistance doit généralement se situer entre 100 et 250 mégaohms. Ensuite, activez le générateur d'impulsions pour délivrer un éclair de lumière pendant toute la durée de l'expérience, et orientez le câble en fibre optique vers l'œil.Vérifiez sur l'oscilloscope la variation de tension à chaque éclair lumineux. Une diminution de la tension indique que l'électrode n'est pas encore entrée dans la cellule. Déplacez le câble à fibre optique autour de l'échantillon jusqu'à ce qu'une réponse maximale de tension soit observée.Pour générer une réponse lumineuse dépolarisante, déplacez le micromanipulateur d'avant en arrière, ce qui provoque de petits mouvements verticaux de l'électrode, tout en tapotant légèrement la base du porte-électrode ou en utilisant la fonction de vibration sur le préamplificateur. Continuez à effectuer de petits ajustements jusqu'à ce qu'une réponse lumineuse dépolarisante apparaisse sur l'oscilloscope. Ensuite, ajustez le câble en fibre optique pour obtenir le signal dépolarisant maximal.Effectuez de petits ajustements à l’aide d’un micromanipulateur et utilisez la fonction de vibration sur l’amplificateur au besoin, afin de vous assurer que l’électrode enregistre de façon stable la cellule. Un enregistrement stable doit présenter peu ou pas de variation du potentiel de repos, un bruit de fond faible et une réponse dépolarisante constamment importante. Il est essentiel d’obtenir un enregistrement stable dont le potentiel de membrane au repos n’est pas bruité et ne varie pas dans le temps.Les réponses doivent être importantes et positives, sans hyperpolarisation. Une fois le dispositif stabilisé, ouvrez le logiciel et fermez la boîte de dialogue appelée « Experiments Gallery » pour ouvrir une fenêtre contextuelle avec quatre canaux. Réglez l'échelle de tension dans le coin supérieur droit de la fenêtre du logiciel sur 500 millivolts.Ensuite, cliquez sur Démarrer dans le coin inférieur droit pour commencer l'enregistrement. Réduisez les canaux trois et quatre, puis ajustez les échelles X et Y. Laissez ensuite le logiciel s'exécuter pendant toute la durée de l'expérience.Pour la stimulation par lumière blanche, enregistrez jusqu'à 10 réponses individuelles, avec la roue de filtres neutres densité (ND) réglée sur la densité optique (OD) la plus élevée qui provoque encore une réponse. Ici, la variation de la réponse est illustrée à 3,0 OD et 2,0 OD. Ensuite, enregistrez le même nombre de réponses de 3,5 à 0,0 OD, pour chaque combinaison, afin d'obtenir une courbe logarithmique d'intensité-réponse. Avant d'enregistrer la réponse de la cellule à toutes les longueurs d'onde à l'aide des filtres interférentiels, déterminez d'abord rapidement la longueur d'onde maximale.Sans filtre ND dans le trajet de la lumière, placez un filtre transmettant les UV et observez brièvement l'amplitude de la réponse. Répétez la procédure avec un filtre transmettant le bleu, un filtre transmettant le vert et un filtre transmettant le rouge, ce qui devrait donner une indication de l'endroit où se situe la réponse maximale. Enregistrez sous la longueur d'onde du filtre qui donne la réponse maximale avant de passer à un autre filtre interférentiel.Entre les enregistrements avec filtres ultérieurs, laissez la cellule répondre à un ou deux éclairs de lumière blanche sans aucun filtre sur le trajet de la lumière, afin de surveiller si la réponse maximale se dégrade au fil du temps. Ensuite, enregistrez avec d'autres filtres interférentiels et prévoyez jusqu'à 10 réponses par filtre. Ceci est un exemple d'une importante variation de tension négative observée juste avant l'entrée dans une cellule.Voici un enregistrement propre, présentant peu de bruit de fond et une réponse dépolarisante importante, généralement d'au moins 40 millivolts. Et voici un exemple d'enregistrement de mauvaise qualité, dû au changement de potentiel négatif après le pic principal. Ceci est un autre exemple d'enregistrement défectueux.Le potentiel de repos présente de grandes fluctuations, et la quantité importante de bruit de fond peut masquer l'amplitude de la réponse. Il s'agit d'un exemple représentatif de la sensibilité spectrale obtenue à partir d'un enregistrement unique. Les types cellulaires sont classés selon leur sensibilité maximale à une longueur d'onde similaire, ainsi que d'après la forme générale du spectre de sensibilité.Les mêmes types cellulaires sont ensuite moyennés, et la sensibilité moyenne est tracée avec des barres d'erreur standard à chaque longueur d'onde. Ce graphique montre les sensibilités spectrales de trois types cellulaires typiques présents chez un insecte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures.Après cette procédure, des expériences comportementales peuvent être réalisées afin de déterminer si tous les types de cellules photoréceptrices contribuent ou non à la discrimination des couleurs.

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