Détermination du photorécepteur cellulaire Sensibilité spectrale dans un modèle Insecte de In Vivo intracellulaires Recordings

L’objectif global de cette méthode d’enregistrement intracellulaire est de déterminer la sensibilité spectrale des cellules photoréceptrices individuelles dans un œil composé d’insecte in vivo. Cette méthode peut nous dire si les longueurs d’onde de la lumière auxquelles une cellule est sensible sont affectées par les pigments filtrants. Le principal avantage de cette technique est qu’en connaissant les sensibilités spectrales des photorécepteurs individuels, nous pouvons prédire la gamme de couleurs qu’un animal peut voir.

Pour préparer l’enregistrement, allumez la lampe au xénon au moins 45 minutes avant l’expérience et allumez l’extracteur de microélectrodes au moins 30 minutes avant de tirer les électrodes en verre. Ensuite, allumez tout l’équipement d’enregistrement. Assurez-vous que l’obturateur est fermé par défaut, afin qu’aucune lumière ne passe à travers le câble à fibre optique.

Ensuite, tirez de fines microélectrodes en verre borosilicaté à l’aide de l’extracteur de microélectrodes. Remplissez les électrodes avec trois molaires de chlorure de potassium. Pour préparer l’échantillon, au microscope, fixez un papillon individuel à l’intérieur d’un petit tube en plastique avec de la cire chaude, de sorte que la tête soit immobile et saillante d’une extrémité du tube.

Ensuite, fixez la trompe, les antennes et les ailes avec de la cire. Après cela, maintenez l’abdomen avec un morceau de cire sèche. Gardez le tube humidifié en plaçant un mouchoir humide à l’intérieur, derrière l’abdomen de l’échantillon.

Assurez-vous que l’échantillon est complètement immobile. Ensuite, montez le tube à l’aide d’un petit morceau de cire sur une petite plate-forme avec une rotule fixée à une base magnétique. Sous un microscope à dissection, insérez un fil d’argent dans la tête via la partie buccale, comme électrode de référence.

Avant l’expérience, fixez définitivement le fil à la plate-forme. Ensuite, découpez un petit trou dans la cornée gauche à l’aide d’une lame de rasoir et scellez le trou avec de la vaseline pour éviter la dessiccation. Une fois la cornée coupée, insérez l’électrode d’enregistrement dans l’œil le plus rapidement possible, car l’hémolymphe dans l’œil durcira rapidement et rendra impossible l’insertion d’une électrode.

Si possible, effectuez la dissection dans le rig où l’enregistrement aura lieu. Ensuite, connectez le fil de terre de l’étage de tête à l’électrode de référence sur la plate-forme de l’échantillon, à l’aide des pinces crocodiles. Montez l’électrode sur le porte-électrode.

Ensuite, insérez le fil d’argent dans la solution de chlorure de potassium dans la microélectrode. Utilisez une source lumineuse avec des attaches en col de cygne pour éclairer l’échantillon sous un stéréoscope tout en abaissant l’électrode dans l’œil. Ajustez le porte-électrode de manière à ce que la microélectrode soit directement au-dessus du trou précédemment découpé dans la cornée.

Ensuite, abaissez la microélectrode dans l’œil à l’aide du micromanipulateur, jusqu’à ce qu’un circuit soit terminé. Une fois dans l’œil, balancez le stéréoscope à l’extérieur de la cage de Faraday. Éteignez la source lumineuse qui éclaire l’échantillon et laissez l’insecte dans l’obscurité pendant 10 à 20 minutes pour l’adapter à l’obscurité.

Vérifiez la résistance de l’électrode en appliquant un courant de l’ordre de l’ordre de l’ordre de l’ordre de l’ordre et en notant le changement de tension. La résistance doit généralement se situer entre 100 et 250 mégaohms. Ensuite, activez le générateur d’impulsions pour qu’il délivre un flash de lumière pendant la durée de l’expérience, et dirigez le câble à fibre optique vers l’œil.

Vérifiez que l’oscilloscope ne change pas de tension à chaque clignotement lumineux. Une variation négative de la tension signifie que l’électrode n’est pas encore entrée dans la cellule. Déplacez le câble à fibre optique autour de l’échantillon jusqu’à ce qu’une réponse de tension maximale soit observée.

Pour générer une réponse lumineuse dépolarisante, faites pivoter le micromanipulateur d’avant en arrière, ce qui entraîne de petits mouvements verticaux de l’électrode, tout en tapotant légèrement la base du porte-électrode ou en utilisant la fonction buzz du préamplificateur. Continuez à effectuer de petits ajustements jusqu’à ce qu’une réponse lumineuse dépolarisante apparaisse sur l’oscilloscope. Ensuite, ajustez le câble à fibre optique pour trouver le signal de dépolarisation le plus important.

Faites de petits ajustements avec un micromanipulateur et utilisez la fonction de bourdonnement de l’amplificateur si nécessaire, pour vous assurer que l’électrode enregistre de manière stable la cellule. Un enregistrement stable devrait avoir peu ou pas de changement de potentiel de repos, un faible bruit de fond et une réponse dépolarisante constamment importante. Il est essentiel d’avoir un enregistrement stable où le potentiel de membrane au repos n’est pas bruyant et ne change pas avec le temps.

Les réponses doivent être importantes et positives, sans hyperpolarisation. Une fois la configuration stable, ouvrez le logiciel et fermez la boîte de dialogue appelée Galerie d’expériences pour ouvrir une fenêtre contextuelle avec quatre canaux. Réglez l’échelle de tension dans le coin supérieur droit de la fenêtre du logiciel sur 500 millivolts.

Ensuite, cliquez sur Démarrer dans le coin inférieur droit pour commencer l’enregistrement. Minimisez les canaux trois et quatre et ajustez les échelles X et Y. Laissez ensuite le logiciel s’exécuter pendant toute la durée de l’expérience.

Pour la stimulation par la lumière blanche, enregistrez jusqu’à 10 réponses individuelles, avec la roue à filtres ND réglée sur le DO le plus élevé qui suscite tout de même une réponse. Ici, la variation de la réponse est indiquée à 3,0 OD et 2,0 OD. Ensuite, enregistrez le même nombre de réponses de 3,5 à 0,0 OD, dans chaque combinaison, afin de fournir une courbe d’intensité logarithmique des réponses. Avant d’enregistrer la réponse de la cellule à toutes les longueurs d’onde à l’aide des filtres d’interférence, trouvez d’abord rapidement la longueur d’onde de crête.

Sans filtre ND dans le trajet de la lumière, placez-y un filtre transmettant les UV et observez brièvement l’amplitude de la réponse. Répétez la procédure avec un filtre émetteur bleu, un filtre émetteur vert et un filtre émetteur rouge, qui devraient donner une idée de l’endroit où se situera la réponse maximale. Enregistrez sous la longueur d’onde du filtre qui donne la réponse maximale avant de passer à un autre filtre d’interférence.

Entre les enregistrements avec les filtres suivants, laissez la cellule répondre à un à deux éclairs de lumière blanche sans aucun filtre sur le trajet lumineux, afin de surveiller si la réponse maximale se dégrade au fil du temps. Ensuite, enregistrez avec d’autres filtres d’interférence et autorisez jusqu’à 10 réponses par filtre. Il s’agit d’un exemple de changement de tension négative important qui est observé juste avant d’entrer dans une cellule.

On voit ici un enregistrement propre, qui a peu de bruit de fond, et une grande réponse dépolarisante, généralement d’au moins 40 millivolts. Et voici un exemple d’enregistrement médiocre, dû à la variation de potentiel négative après le pic principal. C’est un autre exemple d’un mauvais enregistrement.

Le potentiel de repos subit de grandes fluctuations, et la grande quantité de bruit de fond peut masquer l’amplitude de la réponse. Il s’agit d’un exemple représentatif de sensibilité spectrale dérivée d’un seul enregistrement. Les types de cellules sont classés en fonction de la sensibilité maximale à une longueur d’onde similaire et de la forme globale du spectre de sensibilité.

La moyenne des mêmes types de cellules est ensuite calculée et la sensibilité moyenne est tracée à l’aide de barres d’erreur standard à chaque longueur d’onde. Ce graphique montre les sensibilités spectrales de trois types de cellules typiques d’un insecte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures environ.

À la suite de cette procédure, des expériences comportementales peuvent être effectuées afin de déterminer si tous les types de cellules photoréceptrices contribuent ou non à la discrimination des couleurs.