Multi-cible chromogénique totalité montage
31 janvier 2016
Nous décrivons un montage entier hybridation in situ (MC-WISH) procédure chromogène multi-cible dans embryons de drosophile intactes permettant la détection simultanée et spécifique de trois modes de distribution de l'ARNm différents en comparant précipités de couleur.
L'objectif général de l'ISH chromogène multiplexe est de faciliter la cartographie des profils de distribution des ARNm au sein d'embryons entiers de Drosophila. Grâce à cette méthode, les localisations des ARNm de trois gènes différents peuvent être directement comparées au sein d'un même embryon. L'ISH multicolore peut être utilisée pour générer des cartes d'expression génique chez des organismes en développement de manière rapide et fiable. Cela peut fournir des indices importants sur les interactions régulatrices des gènes, le développement embryonnaire ou l'organogenèse. Le principal avantage de cette technique réside dans la visualisation des profils d'expression des ARNm de différents gènes à l’aide de couleurs distinctes et contrastées. Ainsi, les sites d’expression uniques et superposés peuvent être mis en évidence avec une grande précision. À l’aide de protocoles standard, collectez, déchorionnez, fixez et dévitellinisez les embryons nécessaires. Conservez-les dans du méthanol au congélateur jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Commencez maintenant avec les embryons à température ambiante. Placez un insert dans le premier puits d’une plaque de 12 puits et ajoutez deux millilitres de méthanol. Transférez la quantité souhaitée d’embryons dans l’insert, qui servira à transporter les embryons tout au long de la procédure. Réhydratez ensuite les embryons par des incubations de trois minutes dans une série décroissante de méthanol. Commencez par 75 % de méthanol dans du PBS, suivez par 50 % de méthanol dans du PBS-T, puis utilisez 25 % de méthanol dans du PBS-T et terminez par deux incubations dans du PBS-T pur. Préfixez ensuite les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Éliminez le fixateur par quatre lavages dans du PBS-T. Pendant les étapes de lavage, décongelez et préparez les solutions de travail de la protéinase K et de la glycine. Après les lavages, perméabilisez les embryons dans de la protéinase K fraîchement préparée pendant trois minutes à température ambiante. Arrêtez la réaction par deux lavages d’une minute chacun dans la glycine fraîchement préparée. Postfixez ensuite les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % préparé dans du PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Éliminez le paraformaldéhyde par quatre lavages de trois minutes chacun dans du PBS-T. Transférez ensuite les embryons dans le tampon de préhybridation. Ils peuvent être conservés au congélateur jusqu’à utilisation. Commencez par répartir les embryons dans le tampon de préhybridation dans des tubes de deux millilitres. Répartissez environ 15 microlitres d’embryons sédimentés dans chaque tube. Incubez maintenant les embryons à 65
Aperçu
Cet article présente une procédure d'hybridation in situ chromogénique sur tout l'organisme à cibles multiples (MC-WISH) pour des embryons de Drosophila. La méthode permet la détection simultanée de trois profils de distribution d'ARNm différents à l'aide de précipités colorés contrastés.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Analyse de l'expression génique
Contexte
- La cartographie des profils de distribution des ARNm est essentielle pour comprendre les interactions régulatrices des gènes.
- MC-WISH permet la comparaison de l'expression génique au sein du même embryon.
- Cette technique met en évidence avec une grande précision les sites d'expression uniques et superposés.
- Elle s'applique à l'étude du développement embryonnaire et de l'organogenèse.
Objectif de l'étude
- Faciliter la cartographie des profils de distribution des ARNm dans des embryons entiers de Drosophila.
- Fournir une méthode rapide et fiable pour générer des cartes d'expression génique.
- Approfondir la compréhension des interactions géniques durant le développement.
Méthodes utilisées
- Prélèvement et fixation des embryons de Drosophila.
- Réhydratation par une série progressive de méthanol décroissante.
- Perméabilisation à l’aide de la protéinase K.
- Postfixation et hybridation dans le tampon de pré-hybridation.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des profils d'expression des ARNm en couleurs distinctes.
- Capacité à comparer simultanément l'expression de trois gènes différents.
- Grande précision dans l'identification des sites d'expression superposés.
- Applications potentielles dans l'étude des mécanismes régulateurs des gènes.
Conclusions
- MC-WISH est une méthode efficace pour analyser la distribution des ARNm dans les embryons.
- La technique fournit des informations sur la dynamique de l'expression génique pendant le développement.
- Elle peut constituer un outil précieux pour les chercheurs en biologie du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'hybridation in situ chromogénique multiplex sur embryons entiers (MC-WISH) permet la comparaison spatiale directe de plusieurs profils d'expression génique au sein d'embryons intacts, facilitant ainsi la détection mécanistique des risques lors de la validation des cibles en précisant les relations de co-expression et régulatrices. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive en phase de découverte précoce en fournissant des signaux de lecture à haute résolution et reproductibles de l'activité transcriptionnelle dans des systèmes développementaux pertinents pour les maladies. L'application de cette méthode aux embryons de Drosophila et de poisson-zèbre en fait un outil évolutif pour l'analyse de voies biologiques et le criblage phénotypique dans des modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en cartographiant les relations spatiales entre les domaines d'expression génique afin de clarifier les interactions des voies.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à la visualisation directe des sites d'ARNm uniques et superposés avec une grande précision.
- Valeur prédictive : Améliore le tri des portefeuilles en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les réseaux de régulation génique durant le développement embryonnaire et l'organogenèse.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des procédés en aval en générant des cartes d'expression génique multiplexées et fiables.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à la détection simultanée de trois espèces d'ARNm en couleurs contrastées.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme et l'évaluation fiable de composés en fournissant des lectures spatiales quantitatives sur des échantillons intacts.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique en conservant le contexte spatial de l'expression génique au cours des étapes de développement.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller/arrêt en définissant des sites d'expression précis qui orientent l'alignement des biomarqueurs et la pertinence pathologique.
- Réduction du risque mécanistique : Se concentre sur la valeur prédictive en permettant une comparaison directe des dynamiques transcriptionnelles dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
MC-WISH s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur des cibles jusqu'à l'identification de composés actifs, en fournissant des données transcriptionnelles spatialement résolues qui éclairent la compréhension mécanistique précoce et la préparation des tests.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses et de clarifier les voies biologiques en facilitant la comparaison directe des profils de distribution des ARNm dans des embryons intacts.
- Criblage : Offre une prête-à-l'emploi pour les tests grâce à des signaux colorimétriques reproductibles et multiplexés, permettant la comparaison parallèle de l'expression génique.
- Analyse : Produit des mesures spatiales quantitatives par précipitation chromogène, facilitant la comparaison entre conditions et l'analyse de co-expression.
- Recherche translationnelle : Préserve le contexte développemental depuis la phase de découverte jusqu'aux étapes précliniques, soutenant l'alignement des biomarqueurs dans les modèles d'organogenèse.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité réutilisable dans plusieurs projets en raison de son applicabilité à divers systèmes modèles (Drosophila, poisson-zèbre) et de son adaptabilité à différents panels de gènes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'incertitude liée aux interactions de co-expression génique et régulatrices.
- Valeur opérationnelle : Assure standardisation et évolutivité grâce à une détection chromogénique normalisée et à des protocoles d'embryons stockables au congélateur.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une détection précoce des risques associés aux cibles grâce à une cartographie spatiale de haute précision.
- Impact sur le portefeuille : Guide la priorisation ajustée au risque en fournissant des données visuelles claires sur le chevauchement et l'unicité d'expression pour les décisions d'avancement ou d'abandon.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en embryologie, en hybridation des acides nucléiques et en techniques de détection chromogénique.
- Dépend d'un équipement colorimétrique basé sur la phosphatase alcaline et d'une infrastructure standard en biologie moléculaire.
- Exige une standardisation inter-équipes en matière de conception des sondes, de marquage par haptène et de protocoles de développement de la couleur.
- Implique des adaptations lors du transfert entre embryons de Drosophila et de poisson-zèbre, en raison de différences de perméabilité et de fixation.
- Les limitations pratiques incluent la profondeur de pénétration des sondes dans les embryons de stades tardifs et la multiplexion des signaux, limitée par les teintes de chromogènes disponibles.
