Name: Glaucomes induisant une procédure dans un In Vivo Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Apprenez à induire un glaucome chez le rat par injection saline dans la veine épisclérale pour étudier la perte des cellules ganglionnaires rétiniennes. Cette méthode permet d'explorer les stratégies de protection neuronale.

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Toutes les procédures en utilisant des sujets animaux ont été en conformité avec les normes de l&#39;Institut de protection des animaux et l&#39;utilisation Commission (IACUC) à l&#39;Université Western Michigan. 1. Les animaux <ol><li> Utilisez rats mâles et femelles de 3 mois dans cette étude. </li><li> Garder les animaux dans un cycle de 12 heures de lumière / obscurité avec un accès libre à la nourriture et de l&#39;eau. </li></ol> 2. Préparation de KAX Cocktail pour anesthésie animale <ol><li> Dissoudre 50 mg de xylazine (20 mg / ml) dans 5 ml de kétamine (100 mg / ml) avec 1 ml d&#39;acépromazine (10 mg / ml) et 3 ml d&#39;eau distillée. Bien mélanger. </li><li> Stériliser avec un filtre à seringue et stocker cette solution dans un flacon à sérum de 10 ml. </li></ol> 3. KAX Injection <ol><li> Peser animale (g) et le retour à la cage avant d&#39;être prêt pour l&#39;injection. </li><li> Injecter 0,1 ml KAX / 100 g de poids corporel des animaux par voie intrapéritonéale, en utilisant une seringue de 1 ml d&#39;insuline avec une aiguille 28 G. </li><li> Permettrepour animaux à devenir inconscient. Vérifiez les réflexes en pinçant les pieds et la queue. </li><li> Gardez tous les animaux en toute sécurité dans le laboratoire pour la durée de la chirurgie. </li><li> Post-chirurgie, remplacer les animaux dans leurs cages et de garder à l&#39;aise dans RT jusqu&#39;à ce que la conscience est rétablie. retour Seuls les animaux de l&#39;animalerie lorsque les animaux se réveillent et reprendre un comportement normal. </li></ol> 4. Préparation pour la chirurgie et de l&#39;Assemblée Microneedle <ol><li> Faire une solution stérile 2 M de NaCl. </li><li> Utilisez un extracteur de microélectrodes (figure 1C) de tirer un 0,86 mm de diamètre intérieur norme poli lourd et mince tube de borosilicate paroi en deux microaiguilles de verre finement effilées (figure 1D, figure 1E). </li><li> Remblayer une micro - aiguille à l&#39;étape précédente avec 2 M de solution saline à l&#39; aide d&#39; une aiguille de seringue et le remblayage d&#39; une seringue de 1 ml (figure 1B). Touchez les bulles d&#39;air de la pointe de l&#39;électrode. </li><li> Remplir une deuxième seringue de 1 ml avec 2 MNaCl. Branchez une aiguille de 18 G, puis fixer une longueur (environ 10 pouces) de tubes en polyéthylène (figure 1A). Utiliser le piston de seringue pour remplir le tube de polyethylene avec une solution saline à travers l&#39;aiguille. </li><li> Lorsque les deux microaiguille et tubes sont remplis avec une solution saline, connectez soigneusement les deux. Éliminer l&#39;air dans la connexion entre eux (Figure 2). </li><li> Finement biseauter la pointe de la microaiguille en raclant très légèrement contre le grain d&#39;une serviette en papier de cours. </li><li> Vérifier la résistance de la microaiguille en poussant doucement le piston de la seringue jusqu&#39;à ce qu&#39;une fine jet de liquide peut être vu sur la serviette en papier. Le courant de liquide ne devrait pas être plus large que 0,5 mm. </li></ol> 5. Préparation des animaux <ol><li> Appliquer 1 - 2 gouttes anesthésique topique à la cornée (Proparacaine Hydrochloride Solution ophtalmique, USP, 0,5%). Attendre jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun réflexe oculaire se produit. </li><li> Coupez les moustaches avec des ciseaux. </li><li> Saturate un applicateur de pointe de coton avec une solution de bétadine et de la zone tampon autour de l&#39;œil expérimental. </li><li> En utilisant un microscope, joindre un hémostatique pour serrer la paupière inférieure à gonfler l&#39;œil, exposer la veine épiscléral et de limiter le mouvement des yeux. (Figure 3, flèche) </li></ol> 6. Glaucome induisant une injection de solution saline <ol><li> Lorsque l&#39;ensemble de micro-aiguilles et l&#39;animal sont préparés, commencer injections. </li><li> Lorsque l&#39;animal est confirmé pour être insensible aux pieds / pincement de la queue, percer soigneusement la veine épiscléral avec la microaiguille en venant à un angle faible entre 10 et 20 degrés par rapport à la veine (figure 3, flèche blanche). Une ponction réussie dans la veine est apparente lorsque le sang pénètre dans la pointe de la micro - aiguille (figure 3, flèche noire). </li><li> Lentement et manuellement injecter environ 50 pi de solution saline dans la veine. Cela devrait prendre environ 10 secondes. Les veines sera blanc blanch que le sel circule through la vascularisation (figure 4, flèche). Certaines régions peuvent maintenir une apparence de sang rouge (figure 4, flèche). <ol><li> Réaliser une deuxième injection dans la veine, en face du site de la première, afin d&#39;assurer une lésion rétinienne complète à la couche complète des cellules ganglionnaires de la rétine. Note: En quelques minutes, on devrait voir un aspect trouble distinct à travers l&#39;iris de l&#39;œil que le sel circule à travers le système vasculaire. </li></ol></li><li> Laissez l&#39;œil opposé non traité pour être utilisé comme un contrôle interne. </li></ol> 7. Récupération animale <ol><li> Retirez le hémostatique. </li><li> Utiliser un applicateur en coton pour appliquer une pommade antibiotique triple (bacitracine zinc, le sulfate de néomycine, le sulfate polymysin B) sur le site serré par la pince hémostatique et de sites d&#39;injection. Les dommages aux tissus autour de l&#39;œil ne se produit pas à l&#39;aide du hémostatique. </li><li> &gt; La place anesthésié les animaux dans leurs cages sur une couverture d&#39;eau chaude circulant à prevhypothermie ent. Garder les animaux sous observation jusqu&#39;à ce que la conscience et le comportement normal sont repris. Transports animaux éveillés à la colonie des animaux. Les animaux restent dans la colonie jusqu&#39;au moment du sacrifice. </li></ol> 8. Sacrifice animal et Retina Removal <ol><li> Un mois après la procédure pour induire le glaucome, les animaux sont euthanasiés par asphyxie au CO2 et à la perforation thoracique secondaire. <ol><li> Placez l&#39;animal dans la chambre et mettre le couvercle en toute sécurité. </li><li> Ouvrir les vannes de CO 2 et régulateur de gaz pour permettre le volume de 20% / min CO 2 déplacement oxygène dans la chambre. </li><li> Prévoyez quatre à 5 min pour l&#39;animal expirer. </li><li> Éteignez les deux valves. </li><li> Enlever l&#39;animal de la chambre et effectuer une ponction thoracique secondaire avec un scalpel stérile. </li></ol></li><li> Après l&#39;euthanasie, utiliser un scalpel pour couper le tissu conjonctif dans la cavité orbitale entourant l&#39;oeil, being attention à ne pas couper dans le globe oculaire lui-même. </li><li> Soigneusement utiliser des ciseaux de bord incurvées pour couper le nerf optique et tout tissu restant à extraire le globe oculaire intact. Placez globe oculaire extrait dans une boîte de 60 mm stérile x 15 mm jetable de Pétri contenant du PBS frais. </li><li> Faire une œilleton du globe oculaire. Pour ce faire, faire une petite incision au scalpel juste en arrière de la frontière entre l&#39;iris et la sclérotique. Suivez cette incision autour de la circonférence de l&#39;œil avec de petits ciseaux de printemps pour enlever l&#39;hémisphère cornée du globe oculaire. L&#39;hémisphère relié au nerf optique reste. </li><li> Trouvez la très mince rétine rose / beige à l&#39;intérieur du œilleton de l&#39;animal euthanasié. Maintenez la couche pigmentée de la rétine avec des pinces émoussées pour stabiliser l&#39;œilleton. Utilisez une autre paire de pinces fermées pour taquiner très doucement la rétine entière intacte au large de l&#39;arrière de l&#39;œil. Évitez de pincer, tirer, ou tirant la rétine directement. </li><li> Utilisez de petits ciseaux à ressort pour couper lezone où le nerf optique est encore attachée à la rétine. </li><li> Assurez-vous de couper tout épithélium pigmentaire résiduel ou le tissu scléral de la rétine. </li><li> En utilisant une pipette de transfert, transférer très doucement la rétine isolée à un Sylgard propre enduit 35 mm boîte de Pétri x 10 mm contenant du PBS frais. </li></ol> 9. Retina Whole-Mount Préparation <ol><li> Une fois dans le plat Sylgard, utilisez une pince et une aiguille de cactus à la broche de la rétine en place. Gardez la couche de cellules ganglionnaires de la rétine vers le haut et vers le bas du nerf optique. forme hémisphérique de la rétine est notable même après fixation. La courbure de la rétine se courber vers le plafond lorsque la couche de cellules ganglionnaires de la rétine est dans l&#39;orientation souhaitée. </li><li> Utilisez de petits ciseaux pour couper la rétine en quatre quadrants, ce qui rend la forme d&#39;un trèfle à quatre feuilles rayonnant à partir de la tête du nerf optique. </li><li> Epingler les quadrants de la rétine avec des aiguilles de cactus supplémentaires pour rendre la rétine aussi plat que possible without étirement (figure 5). </li><li> Fixer les rétines épinglées dans le plat de Sylgard avec 3 ml de paraformaldéhyde 4% O / N à la température ambiante. </li></ol> 10. coloration des anticorps de la rétine Remarque: Tache rétines fixes avec des anticorps primaires et secondaires pour visualiser les neurones de la rétine (figure 6). <ol><li> Rincer, rétines plates montées fixes trois fois pendant 2 minutes chacun dans du PBS. </li><li> Perméabiliser les rétines avec 1% de Triton X-100 avec 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBS pendant 60 min. </li><li> Rincer rétines trois fois, 2 min chacun, dans du PBS. </li><li> Rincer deux fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS, 5 min par lavage. </li><li> Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage. </li><li> Incuber avec 1% de Triton X-100 et 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBS à température ambiante pendant 45 min. </li><li> Rincer deux fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS, 5 min par lavage. </li><li> Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage. </li><li> Incuber chaque rétine dans 3 ml de 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBSavec la souris purifié anti-rat CD90 / souris CD90.1 (dilution 1: 300) O / N à la température ambiante. </li><li> Rincer rétines une fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min. </li><li> Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage. </li><li> Incuber chaque rétine dans 3 ml de PBS (pas de FBS) avec Alexa Fluor 594 de chèvre anti-IgG de souris secondaire (1: 300) O / N à la température ambiante. </li><li> Laver rétines avec du PBS généreusement. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, enlever soigneusement les aiguilles de cactus de la rétine. </li><li> transférer doucement rétines sur des lames de microscope avec une pipette de transfert. Assurez-vous de maintenir l&#39;orientation avec la couche rétinienne des cellules ganglionnaires face au plafond. forme hémisphérique de la rétine est notable même après fixation. La courbure de la rétine se courber vers le plafond lorsque la couche de cellules ganglionnaires de la rétine est dans l&#39;orientation souhaitée. </li><li> Absorber tout excès de PBS avec Kimwipe ou tout autre matériau absorbant. Veillez à ne pas absorber la rétine. </li><li> Ajouter 5 gouttes de ½ glycérol et ½ PBS en poids modmédias ontage. </li><li> Couvrir la rétine avec la lamelle, en évitant les bulles d&#39;air. </li><li> lamelle sécurisée à l&#39;aide de vernis à ongles clair, colle ou autre adhésif. </li></ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt conflictuel ou concurrent à divulguer.

Ce protocole décrit un procédé pour induire des conditions de glaucome analogue dans un modèle in vivo chez le rat. Cette procédure utilise une injection de solution saline hypertonique pour induire une cicatrisation dans le trabéculum 29, 32. Le développement du tissu cicatriciel obture l&#39;écoulement de l&#39; humeur aqueuse qui augmente la pression dans la chambre antérieure. Avec une diminution des sorties et l&#39;accumulation de pression, la lentille suspendue par des ligaments élastiques rep...

Le glaucome est un groupe de maladies oculaires affectant les neurones de la rétine, en particulier, les cellules ganglionnaires de la rétine 1-2. Les axones de ces cellules convergent pour devenir le nerf optique portant des informations visuelles au cerveau où la vision est perçue. Dommages à RGC et leurs axones provoque donc des défauts visuels. Les principales caractéristiques associées à des troubles du glaucome sont RGC la dégénérescence et la mort, augmentation de la pression intraoculaire (PIO) et optique de coupe de disque et une atrophie. Ces caractéristiques conduisent à la perte du champ visuel ou complète, une cécité irréversible. À l&#39; heure actuelle, le glaucome a causé la cécité dans 70 millions de personnes à travers le monde 3. En tant que tel, il est le troisième cause mondiale de cécité 4. Le mécanisme exact de RGC la mort dans le glaucome demeure inconnue. Beaucoup de recherches ont été faites pour résoudre le mystère. Il est connu, cependant, que le principal facteur de risque de glaucome est une augmentation in pression intraoculaire due à la circulation irrégulière de l&#39;humeur aqueuse (AH) dans la chambre antérieure de l&#39;oeil. AH agit comme un substitut transparent et incolore pour le sang dans la chambre antérieure de l&#39;oeil avasculaire. Il nourrit les cellules environnantes, élimine les déchets sécrétés des processus métaboliques, transporte les neurotransmetteurs, et permet la circulation des médicaments et des cellules inflammatoires dans l&#39;oeil pendant les états pathologiques 1. Le maintien de la circulation aqueuse de l&#39;humour implique le corps ciliaire et le trabéculum. L&#39;humeur aqueuse est produite par le corps ciliaire. Il circule alors dans la chambre antérieure pour maintenir la santé globale du tissu oculaire. 75-80% d&#39;humeur aqueuse est activement sécrétés par la non-pigmentaire épithélium ciliaire lorsque le fluide est filtré à travers trois couches de tissu spongieux dans le muscle ciliaire. Les sorties de fluide à travers le trabéculum et à travers le canal de Schlemm qui empts dans le système sanguin 5 .La restante de 20 - 25% du débit contourne le trabéculum et passivement sécrétées par ultrafiltration et la diffusion à travers la voie de uveo-sclérale. Cette voie semble être relativement indépendante de la pression intraoculaire 1. Lorsque la production d&#39;humeur aqueuse et de sortie sont hors d&#39;équilibre, la pression augmente dans l&#39;œil. Comme indiqué, cette augmentation de la pression intra-oculaire est le principal facteur de risque pour le développement du glaucome. Une telle pression provoque des dommages aux couches complexes de neurones de la rétine à l&#39;arrière de l&#39;œil. Les dommages aux axones des cellules ganglionnaires de la rétine du nerf optique provoque le cerveau pour ne plus recevoir de l&#39;information visuelle précise. En conséquence, la perception de la vision est perdue et la cécité complète peut se produire. À ce jour, il n&#39;y a pas de remède pour le glaucome. Différentes méthodes de traitement existent qui visent principalement à réduire la pression intraoculaire. Ceux-ci comprennent topiqueclasses de médicaments tels que les bloqueurs des récepteurs beta1-adrénergiques, ou analogues de prostaglandines topiques. Les bêta - bloquants réduisent la pression intra - oculaire en diminuant la production d&#39;humeur aqueuse 7. Les prostaglandines fonctionnent pour diminuer la PIO en augmentant l&#39;écoulement de l&#39; humeur aqueuse 8-14. Alpha-adrénergiques et des inhibiteurs de l&#39;anhydrase carbonique sont également utilisées comme méthodes de traitement secondaire. Alpha agonistes adrénergiques augmentent sortie par la voie uvéoscléral 15-17. Les inhibiteurs de l&#39; anhydrase carbonique réduisent la production de AH par inhibition enzymatique 18. Une grande partie des procédures plus invasives sont également utilisés pour traiter le glaucome. Trabéculoplastie au laser est utilisé pour augmenter l&#39;écoulement de l&#39; humeur aqueuse 19. Une autre thérapie chirurgicale, appelée trabéculectomie, crée un autre site de drainage pour filtrer AH lorsque la voie trabéculaire traditionnelle est bloqué 20-21. Ces options de traitement ont été connus pour effcacement réduire la PIO. Toutefois, jusqu&#39;à 40% des patients atteints de glaucome montrent des niveaux de PIO normales indiquant un besoin de méthodes thérapeutiques plus complètes. 22,23 De plus, la rétine la mort des cellules ganglionnaires vu dans le glaucome est irréversible une fois qu&#39;il commence et les traitements actuels ne pas arrêter la progression de la maladie 24-28. Cela a mis en évidence la nécessité pour les thérapies neuroprotectrices efficaces qui ciblent la survie des neurones eux-mêmes. Développement de modèles de glaucome est crucial pour ce développement. Dans cette étude , nous démontrons une méthode d&#39;induction des effets du glaucome comme chez les rats adultes Long Evans en utilisant une procédure modifiée initialement décrite par Morrison 29. Dans cette procédure, les injections de 2 M solution saline hypertonique dans le plexus veineux épiscléral induit des conditions de glaucome comme par le tissu des cicatrices pour réduire humeur aqueuse dans le trabéculum conduisant à une augmentation de la pression intra-oculaire et une perte importante de RGC wSEIN d&#39; un mois de la procédure 30-31. procédures de Glaucome induisant, telles que celle décrite ici, peut être la clé pour débloquer de nouveaux développements dans les traitements du glaucome.

<table><tbody><tr><td>Chlorhydrate de xylazine, Minimum 99 %</td> <td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine injectable, USP, 100mg/ml&nbsp ;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>Flacon de 10 ml</td></tr><tr><td>Maléate d’acépromazine, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 Flacon de</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Flacon de sérum, 10 ml</td><td>Verre 16171319</td><td>borosilicate</td><td>VWR</td></tr><tr><td>1 ml Seringue à insuline&nbsp ;</td><td>Aiguille VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes&nbsp ;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Tube en borosilicate standard poli lourd et à paroi mince</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td> sans filament, aiguille de seringue Microfil <td>de 0,86 mm</td></tr><tr><td>pour le remplissage de micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille Luer-Lock de calibre 18</td><td>Fisher Scientific</td><td>Aiguille</td> de <td>seringue</td>1130421</tr><tr><td>Tube flexible en polyéthylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0,034 pouce de diamètre, environ 10 pouces</td></tr><tr><td>Solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne, USP, 0,5 %</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp ; flacon stérile&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux courbés</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Pince Hémostatique&nbsp ;</td><td>Outils de science fine</td><td>1310912</td><td>bord incurvé</td></tr><tr><td>Pommade antibiotique triple.</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel</td><td>Fine Science Tools&nbsp ;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp ;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri jetable 60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&nbsp ;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Outils scientifiques fins&nbsp ;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Pince (2), Dumont # 5</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert de 3 ml, polyéthylène, non stériles</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 ou 52947-948</td><td>Graduations de 1 et 2 ml</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Boîte de Pétri Easy Grip&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles</td><td></td><td></td><td></td>de cactus</tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>EMD Millipore&nbsp ;</td><td>PX0055-3 ou 818715.0100</td><td>Transformé en une solution à 4 %&nbsp ;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Transformé en solution à 1 % et à 0,1 %.</td></tr><tr><td>Sérum de Bovin Fœtal&nbsp ;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Souris Purifiée Anti-Rat CD90/souris CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Chat 554892</td><td>dilution 1:300&nbsp ;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti-souris&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ;</td><td>A11005</td><td>Dilution 1:300</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G5516-100 ml&nbsp ;</td><td>50 % de glycérol pour 50 % de PBS, en poids.</td></tr><tr><td>Couvre-vis ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>2975-225</td><td>Epaisseur 1 22 x 50 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon²nbsp ;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucomes induisant une procédure dans un<em&gt; in vivo</em&gt; modèle de rat et whole-mount retina préparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Le glaucome est une maladie du système nerveux central affectant les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). axones RGC constituant le nerf optique portent entrée visuelle au cerveau pour la perception visuelle. Dommages à RGC et leurs axones conduit à la perte et / ou la cécité vision. Bien que la cause spécifique du glaucome est inconnue, le principal facteur de risque de la maladie est une pression intraoculaire élevée. procédures de Glaucome induisant dans des modèles animaux sont un outil précieux pour les chercheurs qui étudient le mécanisme de RGC mort. De telles informations peuvent conduire au développement de traitements neuroprotecteurs efficaces qui pourraient aider à la prévention de la perte de vision. Le protocole dans le présent document décrit un procédé d&#39;induction du glaucome - comme conditions dans un modèle de rat in vivo où 50 ul de 2 M solution saline hypertonique est injecté dans le plexus veineux épiscléral. Blanchir des navires indique injection réussie. Cette procédure entraîne une perte de RGC pour simuler le glaucome. Un mois aprèsinjection, les animaux sont sacrifiés et les yeux sont enlevés. Ensuite, la cornée, le cristallin et vitreux sont enlevés pour faire un œilleton. La rétine est ensuite détachée de l&#39;arrière de l&#39;œil et le tombé sur des boîtes Sylgard en utilisant des aiguilles de cactus. A ce stade, les neurones de la rétine peuvent être colorées pour l&#39;analyse. Les résultats de ce laboratoire montrent que 25% environ de RGC sont perdus dans le mois de la procédure par rapport aux contrôles internes. Cette procédure permet une analyse quantitative de la rétine la mort des cellules ganglionnaires dans un modèle in vivo d&#39; un glaucome chez le rat.

Cette section illustre les composants de l&#39; appareil et la procédure utilisée pour induire des conditions de glaucome comme dans un modèle in vivo de glaucome chez le rat. Nous montrons les différents outils et l&#39;équipement utilisés pour effectuer une injection de solution saline hypertonique qui provoque une augmentation de la pression intraoculaire. Nous montrons l&#39;injection dans le plexus veineux épiscléral avec son effet de blanchiment caractéristique et l&#39;as...

<classe p='jove_content'>Le glaucome se caractérise par des lésions des cellules ganglionnaires rétiniennes. L’induction du glaucome dans des modèles animaux peut donner un aperçu de l’étude de cette maladie. Ici, nous décrivons une procédure qui induit une perte de CGR dans un modèle de rat in vivo et démontrons la préparation de rétines entières pour l’analyse.

Glaucomes induisant une procédure dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

L'objectif général de cette procédure est de provoquer une perte importante de cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine du rat en induisant des conditions semblables à celles du glaucome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans les domaines du glaucome et de la protection neuronale. Le principal avantage de cette technique est qu'elle entraîne une perte progressive des cellules ganglionnaires rétiniennes, similaire à celle observée dans le glaucome humain.Pour commencer cette procédure, tirez deux microlames en verre finement effilées à partir d'un tube en borosilicate standard à paroi mince et fortement poli à l'aide d'un tireur d'électrodes. Ensuite, remplissez une microlame avec du sérum physiologique à deux molaire à l'aide d'une seringue d'un millilitre. Éliminez les bulles d'air présentes à l'extrémité de l'électrode en tapotant.Ensuite, remplissez une deuxième seringue d'un millilitre avec du NaCl à deux molaire. Fixez-la à une aiguille de calibre 18, puis reliez l'aiguille à un tube en polyéthylène de 10 pouces. Utilisez le piston de la seringue pour remplir le tube en polyéthylène de sérum physiologique par l'intermédiaire de l'aiguille.Lorsque l'aiguille microscopique et le tube sont tous deux remplis de solution saline, reliez-les soigneusement. Éliminez tout air présent dans la connexion en tapotant pour faire sortir les bulles. Ensuite, grattez légèrement la pointe de l'aiguille microscopique contre une serviette en papier afin de l'affûter finement.Vérifiez la résistance de l'microneedle en appuyant doucement sur le piston de la seringue jusqu'à ce qu'un fin filet de liquide soit visible sur le papier essuie-tout. Le filet de liquide ne doit pas dépasser 0,5 millimètre de largeur afin de garantir l'intégrité adéquate de l'extrémité de l'aiguille. Dans cette procédure, après avoir anesthésié l'animal avec le cocktail KAX, vérifiez les réflexes en pinçant ses pattes ou sa queue pour vous assurer que l'animal est inconscient.Ensuite, coupez les poils avec des ciseaux. Imbibez ensuite un applicateur en coton de solution de bétadine et passez-le sur la zone autour de l'œil expérimental. Sous le microscope, utilisez un hémostat pour pincer la paupière inférieure afin de faire saillir l'œil, exposer la veine épisclérale et limiter les mouvements oculaires.Ensuite, percer soigneusement la veine épisclérale avec l'aiguille microscopique selon un angle compris entre 10 et 20 degrés par rapport à la veine. La ponction de la veine est réussie lorsque l'on observe le sang pénétrer dans l'extrémité de l'aiguille microscopique. Injecter lentement 50 microlitres de solution saline dans la veine.Les veines deviennent blanches par blanchiment lorsque le sel circule dans le système vasculaire, mais certaines régions peuvent conserver une apparence rouge sang. L'étape la plus critique de cette procédure se produit lors de l'injection de la solution saline deux molaire. Il est impératif que le blanchiment du système vasculaire se produise afin d'assurer un résultat satisfaisant.Il est essentiel de maintenir une aiguille stable et un angle de 20 degrés pour cette procédure. Ensuite, effectuez une seconde injection dans la veine afin de garantir une lésion complète de la couche des cellules ganglionnaires de la rétine. En quelques minutes, on doit observer une apparence nettement trouble à travers l’iris de l’œil, au fur et à mesure que le sel circule dans le système vasculaire.Utilisez maintenant un scalpel pour sectionner le tissu conjonctif de la cavité orbitaire entourant l'œil, en prenant soin de ne pas entamer le globe oculaire lui-même. Ensuite, sectionez délicatement le nerf optique et tout tissu résiduel afin d'extraire le globe oculaire intact à l'aide de ciseaux à bord courbé. Placez le globe oculaire extrait dans une boîte de Pétri stérile contenant du PBS frais.Ensuite, fabriquez une cupule oculaire à partir du globe oculaire en pratiquant une petite incision avec le scalpel juste en arrière de la limite entre l’iris et la sclérotique. Poursuivez l’incision tout autour de la circonférence de l’œil afin de retirer l’hémisphère cornéen du globe oculaire. En tenant la couche pigmentée de la rétine avec une pince pour stabiliser la cupule oculaire, utilisez une autre paire de pinces pour décoller délicatement la rétine entière, de couleur rose-beige, de l’arrière de l’œil.Ensuite, découpez ou pincez la zone où le nerf optique est attaché à la rétine. Veillez à éliminer tout épithélium pigmentaire résiduel ou tissu scléral de la rétine. Puis, transférez délicatement la rétine isolée dans une boîte de Pétri propre recouverte de Sylgard et contenant du PBS frais.Une fois dans la boîte de Sylgard, fixez la rétine en place. Gardez la couche des cellules ganglionnaires rétiniennes orientée vers le haut et le nerf optique vers le bas. Ensuite, découpez la rétine en quatre quadrants, en formant la forme d’un trèfle à quatre feuilles, rayonnant à partir de la tête du nerf optique.Ensuite, fixez les quadrants de la rétine avec des aiguilles de cactus supplémentaires afin de rendre la rétine aussi plate que possible sans l'étirer. Par la suite, fixez la rétine pincée dans la boîte de Sylgard avec trois millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à température ambiante avant de réaliser les procédures standards de coloration. Voici une comparaison entre l'œil témoin non traité et l'œil expérimental, un mois après une injection de solution saline induisant un glaucome.Les cellules ganglionnaires de la rétine sont marquées avec un anticorps dirigé contre Thy 1.1. La procédure entraîne une réduction du nombre de CGR, une défasciculation des axones par rapport aux faisceaux axonaux principaux et une altération de la circularité des CGR restantes. Il s'agit d'axones défasciculés caractéristiques résultant de l'injection de solution saline.Un vaisseau sanguin est visible dans la rétine, et ce sont les faisceaux d'axones. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours utiliser une microaiguille fraîche, aiguisée et biseautée.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunocytochimie, les immunotransferts (Western Blots), l'hybridation in situ, le séquençage de l'ARNm ou l'analyse comportementale peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires liées au glaucome, comme la manière dont la perte des cellules ganglionnaires de la rétine affecte l'acuité visuelle des animaux. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du glaucome pour explorer des stratégies neuroprotectrices chez le rat. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'induire une perte importante de cellules ganglionnaires de la rétine chez le rat, en utilisant une injection de solution saline hypertonique dans la veine épisclérale.

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JoVE Journal

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Source : Bosco, A., et al.  In vivo Dynamique de l’activation microgliale rétinienne au cours de la neurodégénérescence : imagerie ophtalmoscopique confocale et morphométrie cellulaire dans le glaucome de souris. J. Vis. Exp. (2015) Cette vidéo montre l’imagerie in vivo de la microglie rétinienne dans un modèle murin de glaucome. Une souris transgénique avec une microglie rétinienne exprimant des protéines fluorescentes est positionnée sous un ophtalmoscope. L’éclairage infrarouge est utilisé...

Imagerie in vivo de la microglie rétinienne dans un modèle murin de glaucome

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

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Ici, nous présentons un protocole pour induire une hypertension oculaire dans l'oeil murin qui se traduit par la perte des cellules ganglionnaires de la rétine comme observé dans le glaucome. microbilles magnétiques sont injectés dans la chambre antérieure et attirés par l'angle irido utilisant un aimant pour bloquer l'écoulement de l'humeur aqueuse.

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Le rapport suivant décrit comment reproduire le modèle de rongeur de la neuropathie optique ischémique antérieure non artéritique (rNAION), en utilisant les paramètres appropriés de colorant, de lentille de contact et de laser. Nous révélons également les étapes appropriées pour évaluer la lésion de rNAION in vivo.

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Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour étudier une forme de neurostimulation chimique de wholemount rat rétines in vitro avec le neurotransmetteur glutamate. Neurostimulation chimique est une alternative prometteuse à la neurostimulation électrique conventionnelle des neurones de la rétine pour traiter la cécité irréversible causée par des maladies dégénératives de photorécepteurs.

Méthodologie pour la chimie biomimétique Neuromodulation des rétines de Rat avec le neurotransmetteur Glutamate In Vitro

Nous montrons trois techniques de préparation de tissus différents pour la visualisation d’immunohistochemical des péricytes microvasculaire rétine de rat, c'est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.

Rétiniennes Cryo-sections, ensemble-montages et préparations hypotonique vaisseaux isolés pour la visualisation d’Immunohistochemical des péricytes microvasculaire

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Un modèle de glaucome induit par la Suture Circumlimbal chez le rat et la souris

La rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) peut être utilisée pour modéliser les maladies rétiniennes ischémiques telles que la rétinopathie de la prématurité et la rétinopathie diabétique proliférative et pour servir de modèle pour des études de preuve de concept dans l’évaluation des médicaments antiangiogéniques pour les maladies néovasculaires. OIR induit une néovascularisation robuste et reproductible dans la rétine qui peut être quantifiée.

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La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. L’histologie, le test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne et l’angiographie par fluorescence sont des techniques précieuses pour comprendre la physiopathologie de la rétine, ce qui pourrait améliorer encore le dépistage efficace des médicaments contre la rétinopathie diabétique.

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L’objectif de ce protocole est de caractériser un nouveau modèle de neurodégénérescence glaucomateuse basé sur une cautérisation thermique à 360° du plexus vasculaire limbique, induisant une hypertension oculaire subaiguë.

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Glaucomes induisant une procédure dans un

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