Name: Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Découvrez l'intégration multi-omiques pour étudier la régulation métabolique par ER Alpha dans le cancer du sein. Cette méthode combine transcriptome, cistrome et métabolome pour identifier les facteurs de transcription clés impliqués.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut national de l&#39;alimentation et de l&#39;agriculture, US Department of Agriculture, récompense ILLU-698-909 (ZME) et Pfizer, Inc (ZME). Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles du Département américain de l&#39;Agriculture.

1. Préparation des échantillons d&#39;ARN-Seq <ol><li> Culture cellulaire et traitement <ol><li> La culture des cellules MCF7 par une amélioration MEM (IMEM) plus le milieu de rouge de phénol avec 10% de FBS chaleur inactive, 1% de pénicilline / streptomycine à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5%. Remarque: lignée cellulaire même et l&#39;état de culture cellulaire est utilisé tout au long de l&#39;étude. </li><li> Semences 100.000 cellules MCF7 par puits dans des plaques 6 puits. Avoir triplicats pour chaque traitement. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 2 ml de milieu frais avec ou sans puits 10 -8 M E2 à chacun. Laisser incuber les plaques pendant 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5%. </li><li> Pour récolter les cellules, ajouter 1 ml de réactif d&#39;isolement d&#39;ARN (thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme acide) dans chaque puits et incuber pendant 5 minutes à la température ambiante (TA). Ramassez ensuite le réactif de lysat cellulaire par pipetage et le dépôt en tubes de 1,5 ml </li></ol></li><li> Isolement de l&#39;ARN <ol><li> Ajouter 200 pi chloroform 1 ml de réactif de lysat cellulaire (1.1.3) et vortexer pendant 10 secondes. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger les échantillons à 16000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Après centrifugation, transférer la phase aqueuse (supérieure) dans un nouveau tube sans déranger les autres phases. </li><li> Ajouter 500 ul de 100% d&#39;isopropanol dans un nouveau tube à la phase aqueuse transférée, et mélanger par retournement. Incuber à -20 ° C pendant une nuit. Centrifuger les échantillons à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Observer un culot au fond du tube. Jeter le surnageant et laver le culot avec 750 ul de 70% d&#39;éthanol sans RNase par une brève vortex. </li><li> Centrifuger les échantillons à 6000 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et centrifuger l&#39;échantillon à 16.000 xg pendant 1 min à 4 ° C pour recueillir tout l&#39;éthanol restant. Retirer l&#39;éthanol restant par pipetage avec une pointe de gel de chargement et de fixer les tubes à l&#39;envers sécher à l&#39;air pendant 10 minutes. Dissoudre le culot dans 20-50 DEPC eau traitée ul dépending de la taille des pellets. </li></ol></li><li> Purifier l&#39;ARN en utilisant l&#39; ARN kit de nettoyage suivant le protocole 4. Mesurer la concentration d&#39;ARN en utilisant un kit de dosage par fluorimétrie à la base selon le protocole 9. REMARQUE: DO à 260 nm est prélevé pour déterminer la concentration de l&#39;ARN et le rapport de DO à 260 nm et 280 nm sont utilisés pour déterminer la pureté de l&#39;échantillon. Il est recommandé de vérifier la qualité de l&#39;ARN en utilisant un dosage Bio-analyseur. </li><li> Prenez environ 0,5 à 1 pg d&#39;ARN purifié pour le séquençage. NOTE: Centre Biotech prépare les bibliothèques de séquençage et effectue apparié-end lire le séquençage en utilisant des méthodes décrites précédemment 2. </li></ol> 2. Préparation de ChIP-Seq Sample <ol><li> Culture cellulaire et traitement <ol><li> Seed 500.000 cellules MCF7 par 10 cm plaque dans un milieu de croissance. NOTE: Pour chaque pull down 16 plaques ont été utilisées. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 5 ml de milieu frais avec ou sans 10 -8 M E2 à chaqueassiette. Traiter les cellules pendant 45 min (37 ° C humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère). </li></ol></li><li> Crosslink et Cell récolte <ol><li> Ajouter 250 ul de formaldehyde à 37% dans 5 ml de milieu pour réticuler la chromatine, incuber à température ambiante pendant 15 min. Arrêtez de réticulation par lavage des cellules avec 5 ml de glace froide 1x MEM. </li><li> Récolter les cellules dans 250 ul de tampon de lyse cellulaire (10 mM d&#39;EDTA, 50 mM de Tri HCl, 1% de SDS, 0,5% de N, N-oxyde dimethyldodecan-1-amine) par plaque. </li></ol></li><li> Fragmentation de chromatine <ol><li> Soniquer les cellules pendant 30 secondes x 8 à ampli de 30 à atteindre des tailles de chromatine nécessaires. Refroidir chaque échantillon sur la glace après une sonication de 30 sec. </li><li> Centrifuger à 16 000 g pendant 10 min à 4 ° C et avec précaution, pipeter le surnageant sans perturber le culot au fond. </li><li> Prenez une aliquote de 5 ul du surnageant, et vérifier la taille de l&#39; ADN par électrophorèse sur gel d&#39; agarose à 1,5% comme décrit précédemment 10. La taille idéalede l&#39;ADN doit être compris entre 200-500 pb. </li></ol></li><li> Immunoprécipitation de la chromatine <ol><li> Économisez 25 pi de lysat cellulaire en entrée. Dans un tube de 50 ml, mélanger 4 ml de lysat cellulaire avec 20 ml de tampon IP (2 mM d&#39;EDTA, 100 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl et 0,5% de Triton X), un anticorps ERa (500 ul F10 et 500 ul HC- 20), et 500 ul ProtA et protg protéine revêtement des billes magnétiques. Incuber le mélange par rotation à 4 ° C pendant une nuit pour permettre la formation d&#39;un complexe anticorps chromatin-. </li></ol></li><li> Washes et Inverse-réticulation <ol><li> Utilisez un support magnétique pour recueillir les billes magnétiques sur le côté aimanté pour enlever le tampon de lavage. </li><li> Laver les billes magnétiques dans 25 ml de tampon de lavage I (EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X et NaCl 150 mM). Pour se laver soigneusement les billes magnétiques sans perturber complexes ADN-protéines, ajouter 25 ml de tampon de lavage lentement vers le tube le long du côté puis inverser les tubes jusqu&#39;à ce que toutes les billes magnétiques sont bien mélangés with le tampon de lavage sans apparaître comme une pastille. Comme alternative, utiliser le rotateur pour inverser le tube. Ne pas vortexer les échantillons. Laver les billes magnétiques en utilisant le même procédé dans les étapes suivantes. </li><li> Laver les billes magnétiques dans 25 ml de lavage de tampon II (EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X et NaCl 500 mM). </li><li> Laver les billes magnétiques dans 25 ml de lavage-tampon III (mM EDTA 1,6, Tris HCl 10 mM, 1% de NP-40, 1% Dexycholate et 250 mM LiCl). </li><li> Laver les billes magnétiques dans 25 ml de tampon 1 x TE (EDTA 1 mM, et Tris-HCl 10 mM) à deux reprises. </li><li> Éluer l&#39; ADN dans 500 ul de tampon d&#39;élution (SDS à 1%, et 10 mM NaHCO 3) puis répartir l&#39;élution d&#39;ADN à 500 ul dans 4 tubes. Pour l&#39;ADN à partir des entrées, éluer l&#39;ADN dans 125 ul de tampon d&#39;élution. </li><li> Incuber les tubes à 65 ° C pendant une nuit sur un bloc de chauffage. Couvrir les tubes sur le bloc de chauffage avec une feuille d&#39;aluminium pour garder la chaleur même sur tous les tubes. Placer un poids sur les tubes pour les empêcher de l&#39;ouverture. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Isolement de l&#39;ADN <ol><li> Refroidir les tubes à température ambiante pendant 5 min. Isoler l&#39;ADN à partir des échantillons déroulants en utilisant le kit d&#39;isolement ChIP ADN. Suivez les instructions du fabricant. <ol><li> Réchauffer le tampon d&#39;élution à 65 ° C. Ajouter 625 ul de tampon de liaison à chaque tube. Si le précipité se forme, ajouter un autre tampon de liaison 250 pi jusqu&#39;à ce que la solution soit limpide. </li><li> Charger l&#39;échantillon sur la colonne et centrifuger à 16 000 g pendant 30 secondes. Laver l&#39;échantillon avec 250 pi de tampon de lavage. Pensez à ajouter de l&#39;éthanol dans le tampon de lavage lors de la première fois à l&#39;utiliser. Répétez le lavage. </li><li> Éluer l&#39;ADN dans 15 ul de tampon d&#39;élution. Combinez l&#39;ADN de même tirer vers le bas à partir de 4 tubes pour atteindre environ 55 ul d&#39;ADN. </li></ol></li><li> Isoler l&#39;ADN d&#39;entrée en utilisant un kit de purification d&#39;ADN. <ol><li> Réchauffer le tampon d&#39;élution à 65 ° C. Ajouter un tampon de liaison 625 pl dans chaque tube et on incube pendant 10 min. Chargez l&#39;échantillon sur la colonne dans un 2 ml collectisur le tube. </li><li> Laver l&#39;échantillon avec 750 pi de tampon de lavage, centrifuger à 16 000 xg pendant 1 min. Répétez centrifuger pour éliminer tout tampon restant. Éluer l&#39;ADN dans 30 ul d&#39;EB. </li></ol></li><li> Mesurer la concentration d&#39;ADN en utilisant un Commercial Fluor Assay avec Modification 11. <ol><li> On dilue le tampon TE 20x dans 1 x TE comme le tampon d&#39;essai pour la dilution des échantillons et des réactifs ADN. Prenez 5 ul d&#39;ADN isolé et diluer dans 50 pi de TE 1x. </li><li> De solution mère / ml d&#39;ADN de 2 pg faire une norme d&#39;ADN allant de blanc à 1, 10, 100, 1000 pg / ml. Dans une plaque de 96 puits, d&#39;allouer 25 pi de chaque norme ainsi que l&#39;ADN de dilution en double exemplaire. (Triplicate pour la norme est recommandée.) </li><li> Préparer le réactif de travail en faisant une dilution de 200 fois de réactif dsDNA dans un tampon 1x TE dans un tube en plastique. Couvrir la solution de travail du réactif avec du papier d&#39;aluminium pour éviter la lumière. Ajouter 200 pi de réactif de travail dans chaque échantillon. Danscubate à la température ambiante pendant 5 min. Couvrir la plaque avec une feuille d&#39;aluminium pour éviter la lumière. </li><li> Mesurer la fluorescence des échantillons en utilisant un lecteur de plaque de fluorescence (excitation à 480 nm, émission 520 nm). Générer la courbe standard ADN de florescence fonction de la concentration de l&#39;ADN. Déterminer les concentrations des échantillons en fonction de la courbe étalon de l&#39;ADN généré. </li></ol></li></ol></li><li> Vérification de ChIP Experiment Utilisation de qPCR <ol><li> Prendre 2 pl isolés ADN et dilués dans 20 ul dans l&#39;eau. Mettre en place la réaction qPCR en triple en mélangeant 2,5 ul de dilution de l&#39;ADN, 5 pi Green I PCR master mix, 1 ul d&#39;amorce, et 1,5 eau exempte de nucléase ul. </li><li> Exécutez le qPCR avec le système PCR en temps réel rapide en utilisant le programme suivant: Etape 1: 95 ° C pendant 60 secondes, Etape 2: 95 ° C pendant 10 secondes, 60 ° C pendant 60 secondes, répétez l&#39;étape 2 39 fois. </li></ol></li><li> Envoyer 10 ng échantillon d&#39;ADN au centre Biotech pour le séquençage. NOTE: Le bioteccentre h prépare l&#39;ADN ChIP dans les bibliothèques selon l&#39;instruction, et effectue le séquençage simple lecture en utilisant des méthodes décrites précédemment 2. </li></ol> 3. Metabolomics Assay Préparation d&#39;échantillons <ol><li> Culture cellulaire et traitement <ol><li> Seed 400.000 cellules MCF7 par 10 cm plaque dans un milieu de croissance. Pour chaque traitement préparer trois échantillons. Utilisez deux plaques dans chaque échantillon pour recevoir suffisamment de cellules pour la détection. Le jour 3, éliminer le milieu et ajouter 5 ml de milieu frais avec ou sans 10 -8 M E2 aux cellules. Traiter les cellules pendant 24 heures (37 ° C humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère). </li></ol></li><li> Collecte d&#39;échantillons <ol><li> Ajouter 5 ml glacé 1x PBS à la plaque, aspirez le PBS après basculement brièvement la plaque à plusieurs reprises. Répéter deux fois, et enlever le plus PBS que possible après le dernier lavage. </li><li> Ajouter 750 ul d&#39;acétone pré-froid à chaque plaque et gratter les cellules. Combiner les cellules dans de l&#39;acétone à partir de deux plaques endans un tube de 2 ml sur de la glace. </li><li> Nombre de cellules pour la normalisation <ol><li> Pour chaque traitement, en utilisant deux plaques supplémentaires pour la quantification des cellules. Pour dé-fixer les cellules de la plaque, ajouter 2 ml de HE tampon (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% NaHCO 3, et 1 mM EDTA) dans chaque plaque et incuber pendant 5 min. </li><li> Recueillir et bien mélanger les cellules par pipetage des cellules dans le tampon HE. Utilisez total de 20 solution de cellules pi pour compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. </li></ol></li></ol></li><li> Conserver les échantillons à -80 ° C avant de l&#39;envoyer au centre métabolomique pour identifier et quantifier les métabolites par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS) analyse. </li></ol> 4. Analyse intégrative <ol><li> ARN-Seq Analyse de données: <ol><li> Effectuer une vérification de la qualité des fichiers FASTQ utilisant FastQC: Lire QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Sélectionnez FastQC: Lire sous l&#39;outil de NGS: QC et la manipulation. Téléchargez le fichier de données brutes du histor couranty. NOTE: Il est recommandé de donner un titre pour le fichier de sortie pour vous rappeler ce que le travail était pour car il pourrait y avoir plusieurs sorties. </li></ol></li><li> Exécuter et le fichier de sortie apparaîtra sous l&#39;Histoire. Répétez la même procédure pour chaque fichier de séquence. adaptateurs compensateurs à l&#39;aide de clip sous NGS: FASTX Toolkit. </li><li> Aligner la lecture à l&#39; aide de hg19 Tophat2 avec génome de référence RefSeq annotation 12 (valeurs par défaut). <ol><li> Sélectionnez Tophat2 sous outil de NGS: analyse de l&#39;ARN. Indiquez la bibliothèque de type jumelé (single-end vs apparié-end). </li><li> Téléchargez le fichier d&#39;entrée FASTQ de l&#39;histoire actuelle. Sélectionnez le génome de référence. Choisissez paramètres par défaut. Ou utiliser la liste complète des paramètres à modifier. </li><li> Exécuter et il produira deux fichiers de sortie: l&#39;une est UCSC BED trace de jonctions; un autre est une liste des alignements de lecture au format BAM. </li></ol></li><li> Télécharger des fichiers BAM séquençage outil d&#39;analyse de données. Calculer les valeurs d&#39;expression en utilisant Quantification Tool. </li><li> Identifier les gènes différentiellement régulés à la hausse en utilisant Expression Analysis Tool en utilisant les valeurs par défaut et plier le changement&gt; 2 et p &lt;0,05. De même, d&#39;identifier les gènes différentiellement régulés à la baisse en utilisant Expression Analysis Tool en utilisant les valeurs par défaut et plier le changement &lt;0,5 et p &lt;0,05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Analyse des données: <ol><li> Alignez FASTQ Lit à hg19 utilisant Bowtie2 13 (valeurs par défaut) dans le Galaxy. <ol><li> Sélectionnez Bowtie2 sous l&#39;outil de NSC: Mapping. Vérifiez si la bibliothèque est partenaire appariées (single-end vs apparié-end). Téléchargez le fichier FASTQ de l&#39;histoire actuelle. </li><li> Sélectionnez le génome de référence. Utilisez les paramètres par défaut. Exécuter et il va produire le fichier de sortie avec la séquence cartographiée lit comme fichier BAM. Répétez la procédure pour chaque fichier de séquence. </li></ol></li><li> Identifier les pics en utilisant MACS 14 Une coupure de 6.0E-7 p-valeur et de FDR de 0,01, comme décrit précédemment 2. </li></ol&gt; </li><li> Metabolomics Analyse des données: <ol><li> Convertir les noms chimiques des métabolites à KEGG_IDs. </li><li> Identifier les métabolites différentiellement régulés en comparant les niveaux détectés dans le véhicule vs. E2 traités échantillons (2 fois coupure a été utilisé dans cette étude). </li></ol></li><li> Analyse intégrative: <ol><li> Identifier les gènes qui ont des sites de liaison ERa en utilisant l&#39;outil d&#39;analyse de données de séquençage. Traduire les régions à la fonction des gènes en utilisant 20 kb que la distance de coupure. </li><li> Identifier les gènes différentiellement haut et bas-régulé de l&#39; analyse de données ARN-Seq utilisant un facteur de changement&gt; 2 et plier le changement &lt;0,5, respectivement avec la valeur de p &lt;0,05 coupée. Comparer à la liste des sites de liaison contenant des gènes ERa utilisant la comparaison de diagramme de Venn. </li><li> Utilisez cette liste pour identifier E2 voies métaboliques modulées utilisant Metscape 15 module Cytoscape. <ol><li> En sélectionnant le module Metscape à partir d&#39;applications, choisissez Générer réseau et puis voie-basl&#39;option ed. </li><li> Sélectionnez le Organism (Human). Sélectionnez le fichier de données E2 liste composé non réglementée (KEGG ID) ainsi E2 régulée à la hausse la liste des gènes. </li><li> Choisissez Composé -réaction -Enzyme-Gene comme type de réseau. Choisissez composés / gènes comme la requête. </li><li> Construire réseau. Répéter en utilisant l&#39;E2 régulé à la baisse composé et les gènes. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-regulated+transcriptomes%3A+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li>
</ol>

Université de l&#39;Illinois a reçu une subvention de chercheur initié de Pfizer Inc. ZME et YCZ reçu un soutien salarial de cette subvention.

Dans cet article, nous avons décrit la génération et l&#39;analyse intégrative de l&#39;ARN-Seq, ChIP-Seq et les données de métabolomique de cellules MCF-7 qui sont traités avec E2. Nous avons développé un ensemble de protocoles d&#39;élaboration de stratégies à utiliser les méthodes les plus efficaces et les utilisateurs marchandises douce amicales qui produisent la découverte biologiquement pertinente. À notre connaissance, la nôtre est la première étude à intégrer -omique les données de trois différentes analyses et ...

Les estrogènes sont des régulateurs importants de nombreux processus physiologiques chez les femmes et les hommes , y compris les tissus reproducteurs, les tissus métaboliques, le cerveau et les os 1. En plus des effets bénéfiques dans ces tissus, les œstrogènes conduisent aussi des cancers qui découlent de mammaires et les tissus reproducteurs. Les estrogènes travaillent principalement par RÉ pour induire des effets spécifiques de type cellulaire. séquençage profond des transcrits régulés par ERa en utilisant l&#39;ADN ERa analyse des sites de liaison ARN-Seq et l&#39;ensemble du génome en utilisant ChIP-Seq avéré être utile de comprendre comment fonctionne ERa dans différents tissus et les cancers qui en découlent. Nous et d&#39; autres ont publié des profils de gènes d&#39;expression associés aux différents récepteurs (ERa vs ERß) 2,3, différents ligands 3-5 et différents corégulateurs 2,4,6,7. ARN-Seq est la principale méthode pour examiner le transcriptome, offrant une précision et une plus grande efficacité par rapport à ba microarraygène sed analyse de l&#39; expression 8. ARN obtenu à partir des lignées cellulaires 2-4,7, des tissus ou des échantillons de tumeur sont séquences, mis en correspondance avec les ensembles génomiques disponibles et les gènes régulés de manière différentielle sont identifiés. Immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est utilisé pour disséquer le facteur de transcription et de co-régulateur se liant à des sites de liaison connus de régulation de la chromatine. ChIP-Seq (ChIP suivi par séquençage à haut débit) fournit une détection impartiale des sites de liaison mondiaux. La métabolomique est une autre approche de la biologie des systèmes de plus en plus utilisé, ce qui quantitativement les mesures, la réponse multiparamétrique dynamique des systèmes vivants à divers stimuli, y compris les produits chimiques et les perturbations génétiques. En effectuant le profilage métabolique global, une lecture fonctionnelle peut être obtenue à partir de cellules, les tissus et le sang. En outre, des informations à partir d&#39;expériences de transcriptome ne reflètent pas toujours les changements réels dans le niveau des enzymes qui contribuent à des voies biochimiques. Combinéanalyse des données de transcriptome et métabolome nous permet d&#39;identifier et de corréler les changements dans l&#39;expression des gènes avec des changements de métabolites réels. Exploiter l&#39;information de tous ces grands ensembles de données à grande échelle fournissent les détails mécanistiques pour comprendre le rôle des facteurs de transcription régulant les systèmes biologiques complexes, en particulier ceux qui ont trait au développement humain et des maladies comme le cancer et le diabète. La nature complexe du génome de mammifère, il est difficile d&#39;intégrer et pleinement interpréter les données obtenues à partir des expériences transcriptomiques, cistrome et métabolome. L&#39;identification des événements de liaison fonctionnels qui conduisent à des changements dans l&#39;expression des gènes cibles est important parce que les sites de liaison une fois fonctionnels sont identifiés; qui a suivi l&#39;analyse, y compris la liaison transcription (TF) analyse de motif, pourrait être réalisée avec une plus grande précision. Cela conduit à l&#39;identification des cascades et des mécanismes de TF biologiquement significatives. comparis Aussi directssur des expériences d&#39;ARN-Seq et ChIP-Seq ne sont pas toujours possible, car les données de chaque expérience ont différentes échelles et des bruits et dans certains cas des signaux significatifs sont obscurcis par le bruit de la population. Nous ne sommes pas au courant d&#39;aucune étude qui a intégré les informations de ces trois approches distinctes, mais pour comprendre la régulation métabolique directe par ERa dans le cancer du sein. Par conséquent, notre objectif global de cet article est de rapporter des événements de liaison productifs à l&#39;expression des gènes et des changements de métabolites. Afin d&#39;atteindre cet objectif, nous avons intégré des données à partir d&#39;ARN-Seq, ChIP-Seq et métabolomique expériences et identifié les œstrogènes induite ERa événements qui conduirait à des changements d&#39;expression des gènes dans les voies métaboliques de liaison. Pour la première fois, nous fournissons un ensemble complet de protocoles (figure 1) pour générer ChIP-Seq, ARN-Seq et métabolomique profilage et effectuer une analyse intégrative des données pour découvrir de nouveaux circuits de gènes régulant le métabolisme du cancer du seindes lignées cellulaires de cancer.

<table><tbody><tr><td>Mélange de triglycérides</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Acide oléique-Poudre soluble dans l’eau&nbsp ;</td></tr><tr><td>Technologies de la vie</td> <td>des réactifs TRIzol</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life technologies&nbsp ;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologies&nbsp ;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification</td><td>Kit QIAGEN</td><td>28106</td><td>Isolement de l’ADN de l’échantillon d’entrée&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit d’isolement ZYMO ChIP-DNA ;</td><td>Zymo Research&nbsp ;</td><td>D5205</td><td>ChIP ADN Propre & Concentrateur</td></tr><tr><td>Quant-iT&ordf ; PicoGreen&uml ; Kit de dosage de l’ADNdb</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>P7589</td><td>Quantification de l’ADN</td></tr><tr><td>DNase sans RNase</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Purification de l’ARN</td></tr><tr><td>Eau traitée DEPC&nbsp ;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase</td></tr><tr><td>Free Modèle 120 Démembreur sonique</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>FB120110</td><td>avec sonde 1/8</td></tr><tr><td>&nbsp ; Fisher Scientific Enceinte sonore</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>FB-432-A</td><td>Pour la réduction du bruit</td></tr><tr><td>&nbsp ; Eppendorf Tubes 5.0 ml</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubes (2 sacs de 100 ch.)</td></tr><tr><td>Mélange d’amorce aléatoire&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Transcriptase Inverse</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>BP160100</td><td>gel d’agarose à 1,5 %&nbsp ;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Life technologies&nbsp ;</td><td>Q32852</td><td>Quantification de l’ARN (100 dos)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase comprimés&nbsp ;</td><td>Roche ;</td><td>4693116001</td><td>Chaque comprimé est suffisant pour 10 ml de tampon de lyse</td></tr><tr><td>PhosSTOP Inhibiteur de la phosphatase Comprimés Roche</td><td>&nbsp ;</td><td>4906845001</td><td>Chaque comprimé suffit pour 10 ml de tampon de lyse</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td>Q32850</td><td>Pour 100 dosages</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>tube Rotator&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Lecteur de plaques multiples&nbsp ;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Pied magnétique</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Système PCR rapide en temps réel</td><td>Applied Science&nbsp ;</td><td></td><td></td>4351405</tr></tbody></table>

biologie des systèmes de régulation métabolique par estrogen receptor signaling dans le cancer du sein

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Avec l&#39;avènement des -omiques approches notre compréhension des maladies chroniques comme le cancer et le syndrome métabolique est améliorée. Cependant, l&#39;exploitation minière efficace de l&#39;information dans les ensembles de données à grande échelle qui sont obtenus à partir des microarrays d&#39;expression des gènes, des expériences de séquençage profondes ou le profilage métabolique est indispensable pour découvrir et cibler efficacement les régulateurs critiques de phénotypes cellulaires malades. Estrogen Receptor α (ERa) est l&#39;un des facteurs de transcription maître régissant les programmes de gènes qui sont importants pour les cancers du sein sensibles aux œstrogènes. Afin de comprendre au rôle du ERa de signalisation dans le métabolisme du cancer du sein, nous avons utilisé des données transcriptomiques, cistromic et métabolomique de MCF-7 cellules traitées avec l&#39;estradiol. Dans ce rapport, nous avons décrit la génération d&#39;échantillons pour l&#39;ARN-Seq, ChIP-Seq et expériences de métabolomique et l&#39;analyse informatique intégrative des données obtenues. Cette approche est utile pour délimiter roman taupemécanismes culaire et circuits de gènes de régulation qui sont réglementés par un facteur de transcription particulier qui a une incidence métabolisme des cellules normales ou malades.

transcriptomique Pour analyser les gènes exprimés de manière différentielle par traitement E2, nous avons choisi de réaliser une expérience d&#39;ARN-Seq. En plus de fournir des informations sur les niveaux d&#39;ARNm, les données d&#39;ARN-Seq peuvent également être utilisés pour suivre l&#39;évolution de (longs ARN non codants, microARN) non codantes de l&#39;ARN et des événements d&#39;épissage alternatif. Nous ne fournissons des informations sur l&#39;analyse des gènes non cod...

L’intégration des données provenant d’expériences de séquençage à l’échelle du génome et d’expériences métabolomiques est un défi. Dans cet article, nous rapportons, pour la première fois, la génération, l’analyse et l’intégration de données sur le transcriptome, le cistrome et le métabolome de cellules cancéreuses du sein traitées à l’œstradiol.

Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

L'objectif général de cette expérience est de comprendre la régulation métabolique directe de l'ER Alpha dans le cancer du sein, à l'aide de données transcriptomiques, systromiques et métabolomiques à l'échelle du génome entier. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie des récepteurs nucléaires et du cancer, telles que le rôle de certains facteurs de transcription dans la régulation du métabolisme contribuant à l'agressivité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une vue d'ensemble globale des nuances de régulation génique et métabolique qui en découle.La procédure sera démontrée par Yiru Chen, chercheuse postdoctorale de mon laboratoire. Après avoir cultivé les cellules MCF7 selon le protocole décrit, récolter les cellules en ajoutant un millilitre de réactif d'isolement d'ARN dans chaque puits, puis incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Utiliser une pipette pour recueillir le lysat cellulaire et le transférer dans des tubes de 1,5 millilitre.Pour isoler l'ARN, ajouter 200 microlitres de chloroforme à un millilitre de lysat cellulaire et vortexer pendant 10 secondes. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, centrifuger les échantillons à 16 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après la centrifugation, transférer soigneusement la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.Ajouter 500 microlitres d'isopropanol à 100 % à la phase aqueuse, puis mélanger par retournement. Incuber ensuite à moins 20 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le lendemain matin, centrifuger les échantillons à 1600 × g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Jetez le surnageant et ajoutez 750 microlitres d'éthanol à 70 % sans RNase. Vortexez brièvement. Centrifugez les échantillons à 6 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et centrifugez les échantillons à 16 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant une minute.À l’aide d’une pipette munie d’une pointe pour chargement de gel, éliminer l’éthanol restant par aspiration. Placer ensuite les tubes à l’envers pour les faire sécher à l’air pendant 10 minutes. Ajouter ensuite 20 à 50 microlitres d’eau DEPC pour dissoudre le culot, puis purifier et quantifier l’ARN selon le protocole indiqué dans le texte.Une fois que les cellules MCF7 ont été cultivées selon le protocole indiqué, ajoutez 250 microlitres de formaldéhyde à 16 % dans cinq millilitres de milieu aux cellules afin de réticuler la chromatine, puis incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez cinq millilitres de tampon 1X froid pour laver les cellules et interrompre la réaction de réticulation. Récupérez les cellules dans 250 microlitres de tampon de lyse cellulaire par plaque.Ensuite, pour fragmenter la chromatine à la taille requise, soniquez les cellules huit fois pendant 30 secondes chacune à une amplitude de 30. Refroidissez chaque échantillon sur de la glace après chaque sonication de 30 secondes. Puis, après avoir centrifugé les échantillons à 16 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, prélève délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette, sans perturber le culot au fond du tube.Appliquez un aliquot de cinq microlitres du surnageant sur un gel d'agarose à 1 %, puis réalisez l'électrophorèse afin de déterminer la taille de l'ADN. La longueur idéale du fragment doit se situer entre 200 et 500 paires de bases. Pour effectuer l'immunoprécipitation de la chromatine, conservez 25 microlitres du lysat cellulaire comme témoin d'entrée.Ensuite, dans un tube de 50 millilitres, mélanger quatre millilitres de lysat cellulaire avec 20 millilitres de tampon IP, l'anticorps ER Alpha et des billes magnétiques codées pour les protéines A et G. Incuber le mélange par rotation à quatre degrés Celsius toute la nuit, afin de permettre la formation de complexes chromatine-anticorps. Après avoir lavé les billes à l’aide de tampons de lavage, conformément au protocole décrit, ajouter 500 microlitres de tampon d’élution aux billes et éluer l’ADN dans quatre tubes.Pour les échantillons d'ADN témoins, éluer dans 125 microlitres de tampon d'élution. Ensuite, placer les tubes dans un bloc chauffant, les recouvrir de papier d'aluminium et poser un poids dessus afin d'empêcher qu'ils ne s'ouvrent. Incuber les tubes à 65 degrés Celsius toute la nuit.Pour isoler l'ADN des échantillons de pulldown à l'aide d'un kit d'isolement d'ADN ChIP, refroidir les tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant ce temps, préchauffer le tampon d'élution à 65 degrés Celsius. Ajouter 625 microlitres de tampon de liaison à chaque tube.Si un précipité se forme, ajouter encore 250 microlitres de tampon de liaison jusqu'à ce que la solution soit claire. Appliquer l'échantillon sur la colonne et centrifuger à 16 000 x g pendant 30 secondes. Ensuite, utiliser 250 microlitres de tampon de lavage pour laver la colonne deux fois.Éluer l'ADN avec 15 microlitres de tampon d'élution. Combiner l'ADN provenant des quatre tubes du même captage afin d'obtenir 55 microlitres d'ADN. Mesurer la concentration en ADN et réaliser une QPCR conformément au protocole indiqué dans le texte.À l'aide de cellules MCF7 cultivées selon le protocole indiqué dans le texte, ajouter cinq millilitres de PBS 1X glacé dans la plaque. Incliner ensuite la plaque plusieurs fois avant de retirer le PBS. Répéter deux fois supplémentaires, en éliminant autant que possible le PBS après le dernier lavage.Ajouter 750 microlitres d'acétone pré-refroidie dans chaque plaque, puis gratter les cellules. Ensuite, combiner les cellules provenant de deux plaques dans un tube de deux millilitres placé sur de la glace. Pour compter les cellules en vue de la normalisation, utiliser deux plaques supplémentaires par traitement afin de quantifier les cellules.Ensuite, pour détacher les cellules des plaques, ajouter deux millilitres de tampon HE et incuber pendant cinq minutes. Mélanger soigneusement les cellules par pipetage dans le tampon HE. Puis, utiliser 20 microlitres de la solution cellulaire dans un hémositomètre pour dénombrer le nombre de cellules au microscope.Conserver les échantillons à moins 80 degrés Celsius avant d'effectuer une analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse afin d'identifier et de quantifier les métabolites. Réaliser l'analyse intégrative conformément au protocole décrit dans le texte. Cette figure montre l'intégrité et la qualité globale des échantillons d'ARN purifiés pour une expérience de RNA-Seq.L'analyse montre que tous les échantillons présentent des bandes nettes et bien définies d'ARNr 18S et 28S, indiquant l'intégrité et la pureté des échantillons. Un nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) de 10 indique un ARN intact. Une valeur de six correspond à un ARN partiellement dégradé, et une valeur de trois indique un échantillon fortement dégradé.Dans ces expériences, toutes les échantillons d'ARN ont obtenu des valeurs RIN comprises entre 9,6 et 9,9. La réalisation d'un séquençage à haut débit a produit environ 18 millions de lectures de séquençage de haute qualité par échantillon. Un rapport représentatif de contrôle rapide de qualité (fast QC), qui analyse la qualité globale des données brutes, est présenté ici.Pour chaque lecture, le score de qualité était compris entre 32 et 34 pour les cinq premières paires de bases, et entre 36 et 38 pour les positions six à cent. Parmi les 17 990 863 lectures générées à partir de cet échantillon, la plupart présentaient un score de qualité supérieur à 34. Cette figure montre un aperçu d'environ 100 métabolites représentés par des pics qui montrent des variations dans les cellules MCF7 suite à un traitement par l'estradiol.Les 10 principaux métabolites présentant des changements significatifs après le traitement par E2 sont présentés dans ce tableau. Ce tableau énumère les voies qui ont été régulées à la hausse et à la baisse suite au traitement par E2. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prêter attention à la santé des cellules et à la qualité des échantillons qui seront analysés. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage de l'exome ou la GRO-Seq, qui reposent sur des données de séquençage, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, comme l'identification d'ARNm supplémentaires, d'ARNm d'enhancer ou d'ARN non codants longs dont la transcription est induite par des traitements. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine des récepteurs nucléaires pour explorer la régulation métabolique par les récepteurs nucléaires dans des systèmes de culture cellulaire ou chez la souris.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser et d'intégrer des données provenant de plusieurs approches « Omics ». N'oubliez pas que le travail avec du Trizol, du formaldéhyde et du méthanol peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle, comme des gants et des blouses de laboratoire, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Cette vidéo décrit une technique de préparation d’échantillons de cellules cancéreuses du sein pour le profilage des métabolites. Les cellules cancéreuses du sein sont traitées avec de l’œstradiol, qui se lie au récepteur alpha des œstrogènes et provoque une modification de la composition des métabolites.

Préparation d’échantillons pour la métabolomique : méthode de préparation d’échantillons cellulaires pour le profilage de métabolites

Cette vidéo décrit un test de rapporteur cellulaire pour déterminer l’activité œstrogénique de composés d’origine végétale. Un composé ayant une activité semblable à celle des œstrogènes imite sa liaison aux récepteurs d’œstrogènes et entraîne la transcription en aval des gènes de l’enzyme rapporteure. L’enzyme rapporteure génère une bioluminescence dans une réaction, indiquant l’activité œstrogénique du composé.

Dosage de l’activité récepteur-rapporteur d’œstrogène pour cribler l’activité œstrogénique des phytoestrogènes

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L'œstrogène active les récepteurs d'oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l'expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Nous avons développé un nouveau modèle ex vivo pour étudier l'action des hormones dans le sein humain. Il est basé sur les microstructures de tissu isolé à partir d'échantillons de tissus mammaires chirurgicales qui conservent l'architecture des tissus, des interactions intercellulaires, et la signalisation paracrine.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

Cliniquement, l'insuffisance d'oestrogène dans les femmes ménopausiques peut aggraver l'incidence de la perturbation de lipide et de l'athérosclérose. Nous avons établi un modèle in vivo d'insuffisance d'oestrogène par ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une double incision dorsal-latérale dans apoE-/- souris. Le modèle de souris est applicable pour le dépistage des traitements exogènes exogènes de dysfonctionnement cardio-vasculaire après la ménopause.

Un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène pour le criblage des traitements exogènes exogènes de la dysfonction cardio-vasculaire après ménopause

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Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein

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