Biologie des systèmes de régulation métabolique par Estrogen Receptor Signaling dans le cancer du sein

L’intégration des données provenant d’expériences de séquençage à l’échelle du génome et d’expériences métabolomiques est un défi. Dans cet article, nous rapportons, pour la première fois, la génération, l’analyse et l’intégration de données sur le transcriptome, le cistrome et le métabolome de cellules cancéreuses du sein traitées à l’œstradiol.

L’objectif global de cette expérience est de comprendre la régulation métabolique directe de l’ER Alpha dans le cancer du sein, en utilisant des données sur le transcriptome, le systrome et le métabolome à l’échelle du génome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des nucléorécepteurs et de la biologie du cancer, telles que le rôle de certains facteurs de transcription dans la régulation du métabolisme pour contribuer à l’agressivité cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle donne une image globale des gènes et des nuances de régulation métabolique qui en résultent.

La démonstration de la procédure sera faite par Yiru Chen, un boursier postdoctoral de mon laboratoire. Après avoir cultivé des cellules MCF7 selon le protocole textuel, récoltez les cellules en ajoutant un millilitre de réactif d’isolement d’ARN dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, prélevez le lysat cellulaire et transférez-le dans des tubes de 1,5 millilitre.

Pour isoler l’ARN, ajoutez 200 microlitres de chloroforme à un millilitre de lysat cellulaire, et agitez pendant 10 secondes. Après une incubation à température ambiante pendant cinq minutes, centrifugez les échantillons à 16 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après la centrifugation, transférez soigneusement la phase supérieure aqueuse dans un nouveau tube.

Ajoutez 500 microlitres d’isopropanol à 100 % à la phase aqueuse et mélangez en inversant. Ensuite, incubez à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, centrifugez les échantillons à 1600 x g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Jetez le surnageant et ajoutez 750 microlitres d’éthanol sans RNase à 70 %, et faites un bref vortex. Centrifugez les échantillons à 6 000 x g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et centrifugez les échantillons à 16 000 x g et quatre degrés Celsius pendant une minute.

À l’aide d’une pointe de chargement de gel, retirez l’éthanol restant par pipetage. Et mettez les tubes à l’envers pour qu’ils sèchent à l’air libre pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 20 à 50 microlitres d’eau DEPC pour dissoudre la pastille, et purifiez et quantifiez l’ARN selon le protocole textuel.

Une fois que les cellules MCF7 ont été cultivées conformément au protocole de texte, ajoutez 250 microlitres de formaldéhyde à 16 % dans cinq millilitres de milieu aux cellules pour réticuler la chromatine et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Utilisez ensuite cinq millilitres de 1X glacé pour laver les cellules et arrêter la réaction de réticulation. Récoltez les cellules dans 250 microlitres de tampon de lyse cellulaire par plaque.

Ensuite, pour fragmenter la chromatine aux tailles requises, sonicez les cellules huit fois pendant 30 secondes chacune à un ampérage de 30. Refroidissez chaque échantillon sur de la glace après chaque sonication de 30 secondes. Ensuite, après avoir centrifugé les échantillons à 16 000 x g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, pipetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille au fond.

Appliquez une aliquote de cinq microlitres du surnageant sur un gel d’agarose à 1 % et effectuez une électrophorèse pour déterminer la taille de l’ADN. La longueur idéale des fragments doit être comprise entre 200 et 500 paires de bases. Pour effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine, enregistrez 25 microlitres de lysat cellulaire en entrée.

Ensuite, dans un tube de 50 millilitres, mélangez quatre millilitres de lysat cellulaire avec 20 millilitres de tampon IP, d’anticorps ER Alpha et de billes magnétiques codées en protéines A et G. Incuber le mélange par rotation à quatre degrés Celsius pendant la nuit, pour permettre la formation de complexes chromatine-anticorps. Après avoir utilisé des tampons de lavage pour laver les billes, selon le protocole de texte, ajoutez 500 microlitres de tampon d’élution aux billes et éluez l’ADN dans quatre tubes.

Pour les échantillons d’entrée d’ADN, éluer dans 125 microlitres de tampon d’élution. Ensuite, placez les tubes dans un bloc chauffant et couvrez-les de papier d’aluminium, puis placez un poids sur le dessus pour les empêcher de s’ouvrir. Incuber les tubes à 65 degrés Celsius pendant la nuit.

Pour isoler l’ADN des échantillons pulldown à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN ChIP, refroidissez les tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Pendant ce temps, réchauffez le tampon d’élution à 65 degrés Celsius. Ajoutez 625 microlitres de tampon de liaison dans chaque tube.

Si un précipitant se forme, ajoutez encore 250 microlitres de tampon de liaison jusqu’à ce que la solution soit claire. Chargez l’échantillon sur la colonne et centrifugez-le à 16 000 x g pendant 30 secondes. Utilisez ensuite 250 microlitres de tampon de lavage pour laver la colonne deux fois.

Avec 15 microlitres de tampon d’élution, élue l’ADN. Combinez l’ADN des quatre tubes du même pulldown pour arriver à 55 microlitres d’ADN. Mesurer la concentration d’ADN et effectuer une QPCR selon le protocole texte.

À l’aide de cellules MCF7 cultivées selon le protocole textuel, ajoutez cinq millilitres de PBS 1X glacé dans la plaque. Inclinez ensuite la plaque plusieurs fois avant de retirer le PBS. Répétez deux fois de plus, en enlevant autant de PBS que possible après le dernier lavage.

Ajoutez 750 microlitres d’acétone pré-réfrigérée dans chaque assiette et grattez les cellules. Ensuite, combinez les cellules de deux plaques dans un tube de deux millilitres sur de la glace. Pour compter les cellules à normaliser, pour chaque traitement, utilisez deux plaques supplémentaires pour la quantification cellulaire.

Ensuite, pour détacher les cellules des plaques, ajoutez deux millilitres de tampon HE et incubez pendant cinq minutes. Mélangez soigneusement les cellules en pipetant dans le tampon HE. Ensuite, utilisez 20 microlitres de la solution cellulaire dans un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules au microscope.

Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius avant d’utiliser l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse pour identifier et quantifier les métabolites. Effectuez une analyse intégrative selon le protocole texte. Cette figure montre l’intégrité et la qualité globale d’échantillons d’ARN purifiés pour une expérience de séquençage d’ARN.

L’analyse montre que tous les échantillons ont des bandes nettes et nettes d’ARNR 18S et 28S, indiquant l’intégrité et la pureté des échantillons. Un nombre d’intégrité de l’ARN, ou RIN, de 10 indique un ARN intact. Six représente un ARN partiellement dégradé, et trois indique un échantillon fortement dégradé.

Dans ces expériences, tous les échantillons d’ARN ont reçu des valeurs RIN comprises entre 9,6 et 9,9. La réalisation d’un séquençage à très haut débit a permis d’obtenir environ 18 millions de lectures de séquençage de haute qualité par échantillon. Un rapport de contrôle qualité rapide représentatif, qui analyse la qualité globale des données brutes, est présenté ici.

Pour chaque lecture, le score de qualité était de 32 à 34 pour les cinq premières paires de bases, et de 36 à 38 pour six à 100 paires de bases. Parmi les 17 990 863 lectures générées à partir de cet échantillon, la plupart d’entre elles avaient un score de qualité supérieur à 34. Cette figure montre une vue d’ensemble d’environ 100 métabolites représentés par des pics qui montrent des changements dans les cellules MCF7 dus au traitement à l’œstradiol.

Ce tableau présente les 10 principaux métabolites pour lesquels des changements significatifs ont été observés par suite du traitement à l’E2. Et ce tableau répertorie les voies qui ont été régulées à la hausse et à la baisse lors du traitement E2. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de faire attention à la santé des cellules et à la qualité des échantillons qui seront analysés. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de l’exome ou le GRO-Seq qui reposent sur des données de séquençage peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identité d’ARNM supplémentaires, d’ARNM amplificateurs ou d’ARN non codants longs dont la transcription est induite par les traitements. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des récepteurs nucléaires pour explorer la régulation métabolique par les récepteurs nucléaires dans les systèmes de culture cellulaire ou chez la souris.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser et d’intégrer des données provenant de plusieurs approches omiques. N’oubliez pas que travailler avec du trizol, du formaldéhyde et du méthanol peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’équipements de protection individuelle tels que des gants et des blouses de laboratoire doivent toujours être portées lors de l’exécution de cette procédure.