Name: In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d ADN et l ADN oxydative dommages de foie de rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez le test de la comète alcaline in vivo et sa version modifiée par enzymes pour mesurer les dommages de l'ADN dans le foie de rat. Cette méthode sensible détecte les cassures et l'oxydation de l'ADN au niveau cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par la Food and Drug Administration des États-Unis. Nous tenons à souligner la publication originale de l’étude CPA par Elsevier B.V. : Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Analyse dose-réponse spécifique au sexe de la génotoxicité chez les rats F344 traités à l’acétate de cyprotérone. Recherche sur les mutations 774 : 1-7, 2014 (PMID : 25440904)

Éthique déclaration: procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) au Centre FDA / national pour la recherche toxicologique. NOTE: La conception de l&#39; étude décrite ici est basée sur le protocole développé par le Centre japonais pour la validation des méthodes alternatives (JaCVAM) pour leur validation de l&#39;essai in vivo rongeur alcaline de la comète 18, et en outre modifié en fonction des recommandations du guide de l&#39; OCDE TG489 19 . 1. Préparation <ol><li> préparation de diapositives <ol><li> Dissoudre l&#39; agarose ordinaire de fusion à 1% (p / v) dans un tampon phosphate (Ca 2+, Mg 2+ libre et sans rouge de phénol) par chauffage dans un four à micro - ondes. </li><li> Placer la solution agarose fondu 1% standard dans un bain d&#39;eau C 55 ° et équilibrer la température du bain. microscope en verre Dip glisse dans la solution d&#39;agarose, égoutter tout excess agarose et essuyez le dos des lames propres. Placer les lames à la verticale sur une surface plane et laisser les lames sécher à la température ambiante; stocker les lames dans un endroit sec. </li></ol></li><li> Préparation des solutions d&#39;essai de comète <ol><li> Préparer une solution à 0,5% d&#39;agarose à bas point de fusion. Dissoudre l&#39; agarose bas point de fusion dans un tampon phosphate (Ca 2+, Mg 2+, et sans rouge de phénol) par chauffage dans un four à micro - ondes. Gardez la solution à 37-45 ° C pendant la préparation de diapositives comète; jeter toute solution d&#39;agarose restant après. </li><li> Préparer un tampon de lyse. Faire une solution 100 mM de disodique acide éthylènediaminetétraacétique (disodique EDTA, M. 372,24 g / mol), 2,5 M de chlorure de sodium (NaCl, M. 58.44 g / mol), et 10 mM tris hydroxyméthyl aminométhane (Tris Base, M. 121.14 g / mol) dans de l&#39;eau purifiée et ajuster le pH à 10 avec 10 une solution N d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH, M. 40 g / mol). Le jour de l&#39;utilisation, ajouter le Triton X-100 et le diméthylsulfoxyde (DMSO, M. 78,13 g / mol) à la solution finale à atteindre concentrations de 1% et 10%, respectivement, et on agite à 4-10 ° C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. </li><li> Faire tampon d&#39;enzyme fraîche le jour de l&#39;utilisation. Préparer une solution contenant 40 mM d&#39;acide 2- [4- (2-hydroxyéthyl) pipérazin-1-yl] éthanesulfonique (HEPES, M. 238,3 g / mol), 100 mM de chlorure de potassium (KCI, M. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA disodique et 0,2% de sérum albumine bovine (BSA, MM 66463 g / mol) dans de l&#39;eau purifiée. Ajuster le pH à 8,0 avec une solution 10 N d&#39;hydroxyde de potassium (KOH, 56,1 g / mol). On agite à la température ambiante et vérifier la dissolution complète avant l&#39;utilisation. </li><li> Préparer une solution tampon alcaline contenant du NaOH 300 mM et 1 mM d&#39;EDTA disodique dans de l&#39;eau purifiée. Agiter à 4-10 ° C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Mesurer le pH de la solution avant l&#39;utilisation et assurez-vous que le pH est&gt; 13. </li><li> Préparer une solution de 0,4 M de Tris base dans l&#39;eau purifiée, et ajuster à pH 7,5 avec de l&#39;acide chlorhydrique (HCl, M. 36.46). Conserver la solution à 4-10 ° C. Ceci est un tampon neutralisant. </li><li> Faire frèch hachant tampon le jour de l&#39;utilisation. Préparer une solution contenant 20 mM d&#39; EDTA disodique et 10% de DMSO dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, Ca2 +, Mg 2+, et sans rouge de phénol). Stocker sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour préparer la solution de coloration, diluer la tache solution mère nucléique fluorescente d&#39;acide avec du Tris-borate-EDTA (tampon TBE) à 1: 10.000 (v / v). Protéger la solution de la lumière en utilisant une feuille d&#39;aluminium. Conserver à 2-8 ° C et utiliser avec 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de la cellule unique Suspensions de foie de rat <ol><li> Euthanasier rats avec CO 2 méthodes suivantes de gaz recommandées dans les lignes directrices American Veterinary Medical pour l&#39;euthanasie des animaux: 2013 Édition 20. <ol><li> Régler le débit de CO 2 à 2,75. Mettez le rat dans la chambre de l&#39; euthanasie (par exemple, pot de dessicateur, cage de rat avec couvercle ventilé) et tourner sur le CO 2 en ouvrant le robinet de la bouteille. Attendre 1,5 à 2,5 min jusqu&#39;à ce que larat devient inconscient. Augmenter le flux de CO 2 à sa valeur maximale. Après l&#39;arrêt de la respiration, laisser le rat dans la chambre pendant environ 1 minute pour assurer l&#39;euthanasie. Vérifier l&#39;euthanasie en palpant pour confirmer que le rat n&#39;a pas le rythme cardiaque, et pincer les orteils pour déterminer que le rat ne retire pas sa branche. </li></ol></li><li> Désinfecter le poil peau avec 70% d&#39;éthanol. Ouvrez la cavité abdominale et enlever le foie intact avec des ciseaux chirurgicaux. Après avoir retiré le foie, enlever le lobe latéral gauche du foie restant avec des ciseaux chirurgicaux. Placez le lobe latéral gauche sur une planche à découper et couper deux 3-4 mm sections transversales adjacentes d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;une lame à un seul tranchant rasoir jetable. </li><li> Placez une section transversale sur du papier filtre (pour empêcher le curling de la section), et placer la section dans 10% de formol tamponné neutre (FBN). Faire en sorte que le rapport de NBF à 10% pour les tissus est de 10: 1 ou plus. Après un temps de fixation d&#39;au moins 72 heures, procEss le foie pour l&#39;histopathologie (voir la section 7 ci-dessous). </li><li> Placez la deuxième section de foie transversale dans 5 ml glacée émincer tampon (section 1.2.6) dans une boîte de 6 cm de Pétri et rincer 3 fois pour éliminer le sang résiduel. </li><li> Transférer la section de foie dans un nouveau tube de centrifugeuse de 2 ml contenant 1 ml de tampon de hachage glacée. Émincer la section du foie bien rincé avec une paire de ciseaux fins pour libérer les cellules. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour retirer tous les morceaux de tissu. </li><li> Placez la suspension cellulaire unique sur la glace et utiliser pour faire des diapositives dans 1 h. Vérifier la concentration de cellules en comptant (par exemple, avec un hémocytomètre ou compteur de cellules électronique) pour veiller à ce que sa concentration est d&#39; environ 2 x10 6 cellules / ml. </li></ol> 3. Préparation de Comet Diapositives <ol><li> Mélanger un volume de la suspension cellulaire unique avec 10 volumes de fusion, 37 ° C, une solution d&#39;agarose à bas point de fusion à 0,5% (section 1.2.1).pipette Immédiatement 100 pi sur une lame revêtue d&#39;agarose régulière du point de fusion (section 1.1). Immédiatement placer une lamelle sur le mélange de cellules-agarose. Faire au moins 8 diapositives pour chaque échantillon. NOTE: Toutes les lames doivent être identifiées par un numéro ou un code similaire et de leur identité enregistrées, de sorte que les lames peuvent être marqués en aveugle (voir 6.2.2 ci-dessous). </li><li> Poser les diapositives plat et refroidir à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Après le gel est solidifié, retirer délicatement les lamelles et plongez les lames dans un tampon de lyse pré-refroidie (section 1.2.2). Protéger les diapositives de la lumière et de garder les lames dans le tampon de lyse à 4 ° C de 1 h (minimum) à O / N (maximum). </li></ol> 4. Traitement enzymatique de Comet Diapositives <ol><li> Retirer 6 des 8 lames préparées à partir de chaque échantillon de tissu provenant du tampon de lyse et les rincer 3x pendant 5 minutes à chaque fois avec le tampon de l&#39;enzyme (section 1.2.3) à température ambiante. Utilisez les deux lames restantes pour l&#39;essai comète alcaline without enzyme-traitement (voir 5.1, ci-dessous). Après rinçage, enlever l&#39;excès de liquide par égouttage et buvard les diapositives avec les tissus. </li><li> Et diluer hOGG1 Endo III stocks enzyme avec du tampon enzymatique à 1: 1000 (v / v). Placer sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Appliquer 200 pi des solutions suivantes aux diapositives préparées à partir de chaque groupe de traitement: 200 pi de tampon d&#39;enzyme seule (2 diapositives utilisées comme diapositives de référence), III solution Endo 200 solution ul de hOGG1 (2 lames) ou 200 pi (2 lames). </li><li> Mettre les lames dans des boîtes de Pétri doublées avec des serviettes en papier humides, couvrir les lames avec Parafilm, et incuber à 37 ° C pendant 45 min pour Endo III traités et les diapositives de référence et 30 min pour les diapositives hOGG1 traitées. </li><li> Après incubation, rincer les lames avec de l&#39;eau distillée et poursuivre le traitement comme décrit dans 5.2, ci-dessous. </li></ol> 5. Dénouement et Électrophorèse <ol><li> Pour les lames non traitées avec des enzymes, enlever les lames du tampon de lyse, Égoutter les lames et rincer une fois avec un tampon de neutralisation à froid (section 1.2.5) pendant 5 min pour éliminer les détergents et les sels résiduels. </li><li> Placer les lames de Steps 4.5 et 5.1 de façon aléatoire dans un réservoir d&#39;électrophorèse sur gel horizontal, en évitant tous les espaces. Remplir le réservoir avec fraîchement préparé pH&gt; 13 tampon d&#39;électrophorèse (section 1.2.4) jusqu&#39;à ce que le niveau de liquide ne couvre que les diapositives (éviter les bulles sur l&#39;agarose et assurez-vous que le réservoir est de niveau). Enregistrez le pH du tampon et de la température au début de l&#39;ADN de déroulement. </li><li> Laisser les lames restent dans le tampon alcalin pendant 20 min pour permettre le déroulement de l&#39;ADN et l&#39;expression des dommages en milieu alcalin responsable. </li><li> Pendant le déroulement, le programme de l&#39;alimentation pour produire 0,7 V / cm dans la cuve d&#39;électrophorèse (V / cm = Volts, divisée par la distance en cm entre les électrodes positives et négatives). </li><li> Après déroulement, appuyez sur le bouton d&#39;exécution sur l&#39;alimentation. Si nécessaire, ajuster le courant de 300 mA, en augmentant ou en abaissant le niveau de mémoire tampon. Gardez eniveau de tampon e juste au-dessus de la surface des lames. Effectuer une électrophorèse à 4 ° C pendant 20 min. Notez l&#39;emplacement de la diapositive, la température du tampon et le courant (ampères) au début et à la fin de l&#39;électrophorèse. NOTE: Trop tampon se traduira par des tensions plus faibles qui peuvent interférer avec la migration de l&#39;ADN. </li><li> Après électrophorèse, neutraliser l&#39;excès d&#39;alcali en soulevant doucement les lames de la cuve et plongeant dans un tampon de neutralisation (section 1.2.5) pendant 5 min. Égoutter les diapositives et répéter deux fois. </li><li> Fixer les lames en les immergeant dans le froid éthanol à 100% pendant 5 min. Laisser sécher les lames d&#39;air et le placer dans un endroit sec pour le stockage. </li></ol> 6. ADN Coloration, Comet visualisation et d&#39;analyse <ol><li> coloration de l&#39;ADN <ol><li> Placer les lames sur un plateau en carton ou en métal et ajouter 200 pi de solution tache de travail nucléique fluorescente d&#39;acide (section 1.2.7) à chaque diapositive et couvrir avec une lamelle de verre. Protéger les diapositives dela lumière permettent aux diapositives de rester en contact avec la solution de coloration pendant au moins 30 min avant de marquer. Colorer les lames dans des lots de 20 à la fois. </li><li> Avant de lire chaque diapositive, doucement épongez loin la solution de coloration en excès, en faisant attention à ne pas perturber le verre de protection. </li></ol></li><li> Visualisation Comet et notation <ol><li> Utiliser une caméra fixée à un microscope à fluorescence pour afficher des images en direct de la glissière comète sur le moniteur de l&#39;ordinateur. </li><li> Aléatoirement choisir un champ de microscope contenant des cellules. Utilisation d&#39;une souris, sélectionnez une cellule. Cliquez sur le centre de la «tête de comète&quot; avec le clic gauche de la souris. REMARQUE: Le logiciel calcule tous les paramètres de mesure pour la cellule et ajoute les données dans un fichier de données. </li><li> Note toutes les cellules dans le champ en cours (voir étape 6.2.4), puis utiliser les commandes de scène du microscope et la vidéo à l&#39;écran pour trouver un autre ensemble de cellules. Note ces cellules comme décrit dans 6.2.2. </li><li> Note la diapositive fdroit rom à gauche et vers le bas vers le haut. Choisissez environ 10 champs au hasard. Au cours de ce processus, toute cellule comète appropriée qui apparaît dans le champ de vision doit être marqué sans parti pris. REMARQUE: Ne pas marquer une comète si une des conditions suivantes est remplie: 1) il est situé sur l&#39;un des bords de la lame; 2) deux ou plusieurs comètes se chevauchent; 3) il y a des débris dans la queue; 4) le logiciel ne peut pas différencier entre la tête et la queue; ou 5) la coloration du noyau et / ou la queue diffère grandement des autres comètes sur la diapositive. NOTE: Les comètes avec la quasi-totalité de leur fluorescence d&#39;ADN dans la queue sont souvent désignés comme des comètes «hérisson». comètes hérisson ne devraient pas être marqués, mais le nombre de hérissons détectés au cours de la notation de diapositives doivent être enregistrées et déclarées en pourcentage des comètes totales. </li><li> Analyser au moins 75 comètes par diapositive, à la lecture de deux diapositives par organe / tissu pour obtenir au moins 150 cellules / comète échantillon total. Après que le nombre requis de cellules à partir d&#39;une lame ont soiten a reçu, le résultat est enregistré dans un fichier tableur pour l&#39;analyse ultérieure des données. </li></ol></li></ol> 7. histopathologie Analyse <ol><li> Après un minimum de 72 heures de fixation dans 10% FBN, suivie par le tissu de rognage 21, traiter systématiquement et intégrer le lobe du foie latéral gauche des échantillons dans une paraffine cire à base de support 22. Section des échantillons à environ 5 microns et de recueillir sur des lames de verre. </li><li> Colorer les sections avec hématoxyline &amp; éosine (H &amp; E): <ol><li> Chauffer les lames avec les sections de tissu de paraffine dans un four à 60 ° C pendant 2 heures avant la procédure de coloration. </li><li> Utilisez xylène pour Déparaffiner les côtés. Réhydrater les lames avec de l&#39;éthanol gradué (EtOH) à une course rinçage à l&#39;eau du robinet. </li><li> Placer les lames dans 450 ml d&#39;hématoxyline pendant 2 min et 40 sec. Rincer les lames avec de l&#39;acide (acide acétique glacial 2 ml à 450 ml d&#39;eau déminéralisée) pour 4 sec suivant par 5 min en cours d&#39;exécution l&#39;eau du robinet de rinçage. </li><li> Placez le glissées dans 450 ml d&#39;EtOH à 70% contenant 1 ml d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium pendant 2 min, puis rinçage à l&#39;eau courante du robinet pendant 2 minutes et 30 secondes, et 70% d&#39;EtOH rinçage pendant 1 min. </li><li> Incuber les lames avec 450 ml de solution d&#39;éosine Y contenant de l&#39;acide acétique glacial 4 ml pendant 3 min. </li><li> Déshydrater les lames avec EtOH gradué. Effacer les diapositives avec du xylène (trois fois 1 min chaque), et maintenir les lames dans le xylène jusqu&#39;à ce que des lamelles sont placées sur les lames. </li></ol></li><li> Examiner les lames par microscopie optique, les résultats records, et des lésions non néoplasiques qualité de la gravité comme 1 (minimal), 2 (légère), 3 (modéré), ou 4 (marqué). NOTE: Le degré de sévérité appliquée pour une lésion spécifique est basée sur la proportion relative du foie avec la lésion (= minimum &lt;1-15%; légère = 16-35%, modérée = 36-60%, et marqué = 61- 100%). </li></ol> Analyse 8. Données <ol><li> L&#39;animal est considéré comme l&#39;unité expérimentale pour les évaluations statistiques. endommagement de l&#39;ADN est exprimée en% DNA dans la queue. </li><li> dommages oxydatifs à l&#39;ADN est calculé comme suit: les diapositives de référence (pas de traitement enzymatique) fournissent une estimation des pauses ADN de fond brin (SB). REMARQUE: Les lames d&#39;enzymes traitées fournissent une mesure de cassures et de bases oxydées (SB + OX). En supposant une dose - réponse linéaire pour l&#39; ADN% dans la queue en fonction des dommages de l&#39; ADN, la soustraction de SB de SB + OX donne une estimation des ruptures de brins d&#39; ADN de oxydées pyrimidines / purines modifiées 23. </li><li> Analyser l&#39;ADN% dans la queue en fonction de la dose par une ANOVA, suivie d&#39;un test de Dunnett pour des comparaisons par paires des réponses chez les animaux traités au contrôle du véhicule. NOTE: Tous les tests sont une queue et une valeur p inférieure à 0,05 est fixé comme critère de signification statistique. </li></ol>

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<li>Dusinska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+COMET+ASSAY%2C+modified+for+detection+of+oxidised+bases+with+the+use+of+bacterial+repair+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Dusinska+Protocol+%5BInternet%5D%22%5BJournal%5D)">THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases.</a> Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: 
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<li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li>
<li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases%3A+characteristics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a d’intérêts concurrents ou conflictuels. Les informations contenues dans ces documents ne constituent pas une diffusion formelle d’informations par la FDA et ne représentent pas la position ou la politique de l’agence.

Ce protocole décrit la mesure concurrente de dommages à l&#39;ADN et à l&#39;oxydation directe dans le foie de rat au niveau de la cellule unique. Le protocole général est applicable à tout tissu à partir duquel les cellules ou les noyaux individuels peuvent être isolés avec un minimum de lésions de l&#39; ADN induites par le traitement ( à savoir, des lésions de l&#39; ADN induites et non par l&#39;agent d&#39;essai, mais la manipulation et le traitement des tissus d&#39;origine animale). Dans notre recherche,...

Le test des comètes alcalines mesure les ruptures d&#39;ADN au niveau d&#39;une seule cellule. Les suspensions de cellules individuelles sont noyées dans agarose sur une lame de microscope et les cellules ont été lysées pour former nucléoïdes, qui contiennent des boucles surenroulées de l&#39;ADN. Electrophorèse à pH&gt; 13 résultats dans la perte de surenroulement dans des boucles d&#39;ADN contenant la rupture des brins, les brins d&#39;ADN libérés migrent vers l&#39;anode, la création de structures de comète qui peuvent être observées par microscopie à fluorescence. ADN Fragmenté migre de la «tête» de la comète dans la «queue» en fonction de la taille du fragment, et la fluorescence relative de la queue de la comète par rapport à l&#39;intensité totale (de la tête et de la queue) peut être utilisé pour quantifier l&#39; ADN rupture 1 , 2. Le test est simple, sensible, polyvalent, rapide et relativement peu coûteux 1. La détection d&#39;ADN fragmenté causées par des agents endommageant l&#39;ADN est utilisé un dosage pour la quantification des lésions de l&#39;ADN dans les cellules ou les noyaux isolés à partir individeux tissus d&#39;animaux traités avec le matériau (x) potentiellement génotoxiques. En raison de ses avantages, le test in vivo de la comète est recommandé comme un second test in vivo de génotoxicité (jumelé avec le test du micronoyau in vivo) pour effectuer des évaluations de sécurité des produits en cours Conférence internationale sur l&#39; harmonisation (ICH) 3 et Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA ) 4 lignes directrices réglementaires. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé le test pour évaluer des dommages de l&#39; ADN in vivo induite par les ingrédients alimentaires, les produits pharmaceutiques et les nanomatériaux 5-10. Rat foie sera utilisé comme exemple dans ce protocole, mais le test des comètes peut être réalisée avec d&#39;autres tissus / organes d&#39;animaux de laboratoire, aussi longtemps que des cellules individuelles intactes peuvent être isolées à partir du tissu. Certains types de dommages à l&#39;ADN sont difficiles à détecter que les ruptures d&#39;ADN sans modifier le test des comètes alcalines de base. Dans le cas des dommages oxydatifs à l&#39;ADN, brin breaks peuvent être créés au niveau des lésions oxydatives de l&#39;ADN par digestion avec des enzymes de réparation tels que la 8-oxoguanine ADN-N glycosylase humaine 1 (hOGG1, ce qui crée des pauses à la 8-oxoguanine (8 oxoGua) et la méthyl-fapy-guanine 11. en outre, l&#39; endonucléase III (endo III) crée des sauts principalement à pyrimidines oxydées 1. Ainsi, l&#39;addition d&#39;une étape enzymatique digestion permet le dosage d&#39; une méthode spécifique et sensible pour mesurer les dégâts oxydatifs de l&#39; ADN in vivo 12. en utilisant ces tests, nous avons démontré les dommages oxydatifs à l&#39;ADN induite par la substance toxique dans le foie des rats et des souris 6-8 et dans le cœur des rats 10. Le test des comètes alcalines a de nombreuses applications en toxicologie génétique et la biosurveillance humaine: 1) en tant que suivi dans l&#39; essai in vivo pour génotoxiques identifiés par sensibles tests in vitro 3,13, 2) pour évaluer les mécanismes de lésions de l&#39; ADN xénobiotiques-induite dans plusieurs tissus 14, 3) pour examiner si unecancérogène fonctionne à l&#39; aide d&#39; un génotoxique ou un mode non génotoxique d&#39;action (MOA) 7, 4) pour évaluer l&#39; ADN réparation des dommages 15, 5) pour étudier les maladies humaines et les expositions professionnelles 16 et 6) comme un test de criblage à haut débit potentiel de spécifique d&#39; un organe de génotoxicité 17.

<table><tbody><tr><td>Lamelles (n° 1, 24 x 50 mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Disodium</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1x Solution saline équilibrée Hanks (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free)</td><td>HyClone</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion ( LMP)</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG Agarose</td></tr><tr><td>à fusion normale (NMA)&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Bandelettes en papier pour tester le pH (pH 7,5-14)</td><td>Fisher</td><td>M95873</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Étiquettes pour lames (0,94 x 0,5 po)</td><td>Fisher</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade ; Or&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger microcentrifugation de 2,0 ml</td><td>Fisher</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à cellules (40 &micro ; m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Endonuclease III (Nth)&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0268S</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>hOGG1&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0241S</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr></tbody></table>

in vivo alkaline comet assay et enzyme modifiée alkaline comet assay pour mesurer breaks brin d&#39; adn et l&#39; adn oxydative dommages de foie de rat

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Des dommages à l’ADN non réparés peuvent entraîner une instabilité génétique, ce qui peut à son tour favoriser le développement du cancer. Par conséquent, l’identification des agents potentiellement dommageables de l’ADN est importante pour protéger la santé publique. Le test in vivo sur les comètes alcalines, qui détecte les dommages à l’ADN sous forme de ruptures de brins, est particulièrement pertinent pour évaluer les dangers génotoxiques des xénobiotiques, car ses réponses reflètent l’absorption, la distribution tissulaire, le métabolisme et l’excrétion in vivo (ADME) des produits chimiques, ainsi que le processus de réparation de l’ADN. Comparé à d’autres tests in vivo sur les dommages à l’ADN, le test est rapide, sensible, visuel et peu coûteux, et, en convertissant les dommages oxydatifs à l’ADN en cassures de brins à l’aide d’enzymes de réparation spécifiques, le test peut mesurer les dommages oxydatifs à l’ADN de manière efficace et relativement exempte d’artefacts. La mesure des dommages à l’ADN avec le test de la comète peut être effectuée à l’aide de plans d’étude toxicologique aigus et subchroniques, et en intégrant le test de la comète à d’autres évaluations toxicologiques, le test répond aux exigences de bien-être animal en utilisant au maximum les ressources animales. Un autre avantage majeur des tests est qu’ils ne nécessitent qu’une petite quantité de cellules et que les cellules n’ont pas besoin d’être dérivées de populations cellulaires en prolifération. Les tests peuvent également être effectués avec une variété d’échantillons humains obtenus auprès de personnes cliniquement ou professionnellement exposées.

Le test des comètes alcalines in vivo a été réalisée conjointement avec le test des comètes enzyme modifiée pour mesurer les dommages de l&#39; ADN direct et oxydatif dans le foie des rats traités avec de l&#39; acétate de cyprotérone (CPA) 5. CPA est un médicament hormonal synthétique qui provoque des tumeurs du foie de rat d&#39;une manière spécifique du sexe, avec cinq fois plus fortes doses nécessaires pour induire des tumeurs du foie chez les rats mâles par rappo...

Le test des comètes alcalines mesure les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. En ajoutant une étape de digestion de l’endonucléase III ou de la 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase humaine, le test peut détecter efficacement les dommages oxydatifs à l’ADN. Nous décrivons les méthodes d’utilisation de ces tests pour détecter les dommages à l’ADN dans le foie du rat.

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d&#39; ADN et l&#39; ADN oxydative dommages de foie de rat

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

L'objectif général de l'essai comet alcalin in vivo et de l'essai comet alcalin modifié par enzyme est de mesurer simultanément les dommages directs et oxydatifs de l'ADN au niveau de la cellule unique. Cette méthode a été initialement proposée comme outil réglementaire pour l'analyse de sécurité des produits réglementés par la FDA. Elle peut aider à répondre à des questions clés dans des domaines allant de l'évaluation réglementaire de la sécurité à l'épidémiologie moléculaire, en passant par la recherche fondamentale sur le cancer.Cette technique est sensible et polyvalente, et en outre relativement peu coûteuse. Elle est capable de détecter les lésions de l'ADN dans pratiquement tout tissu animal. En général, les chercheurs savaient que cette méthode aurait du mal à préparer rapidement des suspensions de cellules individuelles à partir de divers tissus, ce qui peut poser un défi.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car elle exige une certaine dose d’art, tout autant que de science. Après avoir euthanasié les rats au gaz de dioxyde de carbone, conformément au protocole décrit, palper afin de confirmer l’absence de battements cardiaques chez le rat, puis pincer les orteils pour vérifier que le rat ne retire pas son membre. Utiliser de l’éthanol pour désinfecter la peau, puis utiliser des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la cavité abdominale, avant de retirer le foie intact.Avec des ciseaux, séparer le lobe latéral gauche du reste de l'organe et le placer sur une planche à découper. Ensuite, à l’aide d’un rasoir jetable à lame simple, couper deux sections transversales adjacentes de 3 à 4 millimètres d'épaisseur. Placer une section transversale sur du papier filtre, puis dans du formol tamponné neutre à 10 %, ou NBF.Placer la deuxième section de foie dans cinq millilitres de tampon de hachage glacé dans une boîte de Pétri de six centimètres de diamètre et rincer trois fois pour éliminer le sang résiduel. Ensuite, transférer la section de foie dans un nouveau tube centrifuge de deux millilitres contenant un millilitre de tampon de hachage glacé. À l’aide de ciseaux fins, hacher la section afin de libérer les cellules, puis filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un tamis cellulaire de 40 micromètres pour éliminer tous les agrégats tissulaires.Placer la suspension monocellulaire sur de la glace et, à l’aide d’un hématimètre, vérifier que la concentration est d’environ deux fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre. Pour préparer les lames à comètes, mélanger un volume de la suspension monocellulaire avec 10 volumes d’une solution d’agarose à bas point de fusion à 0,5 % fondue à 37 degrés Celsius. Prélever immédiatement 100 microlitres et les déposer sur une lame préalablement recouverte d’agarose, puis recouvrir le mélange agarose-cellules avec une lame à couvrir.Placer les lames à plat et les refroidir à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois le gel solidifié, retirer délicatement les lamelles et plonger les lames dans un tampon de lyse pré-refroidi. Incuber à l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant une heure à toute la nuit.Après l'incubation, retirez six des huit lames préparées pour chaque échantillon tissulaire du tampon de lyse, puis rincez-les trois fois avec le tampon enzymatique à température ambiante, cinq minutes à chaque fois. Ensuite, utilisez des tissus pour absorber l'excès de solution. Puis, diluez les stocks d'enzymes hOGG1 et Endo III dans le tampon enzymatique, au un sur mille, et placez la solution sur de la glace.Placer les lames dans des boîtes de Pétri tapissées de papier essuie-tout humide, puis appliquer 200 microlitres des solutions suivantes sur les lames de chaque groupe de traitement. Appliquer le tampon enzymatique seul sur deux lames, la solution hOGG1 sur deux lames et la solution Endo III sur deux lames, puis recouvrir les lames de Parafilm. Incuber ensuite les lames à 37 degrés Celsius, en traitant les lames avec Endo III et les lames de référence pendant 45 minutes, et les lames traitées avec hOGG1 pendant 30 minutes.Après l'incubation, égouttez les lames et, pour les lames de référence, utilisez un tampon de neutralisation froid pour éliminer le détergent résiduel et les sels. Rincez ensuite les lames traitées par l'enzyme avec de l'eau distillée. Placez les lames aléatoirement dans un réservoir horizontal d'électrophorèse sur gel, en évitant tout espace vide.Ensuite, ajoutez du tampon d'électrophorèse fraîchement préparé dans le réservoir, en évitant les bulles, jusqu'à ce qu'il recouvre légèrement les lames. Réglez l'alimentation électrique à 0,7 volt par centimètre et incubez les lames dans le tampon alcalin pendant 20 minutes, afin de permettre le déroulement de l'ADN et l'expression des lésions alcali-labiles. Notez la position des lames, la température du tampon et le courant.Après l'incubation pour le déroulement, placez le réservoir d'électrophorèse à quatre degrés Celsius. Ensuite, appuyez sur le bouton Démarrer de l'alimentation électrique, et si nécessaire, ajustez le courant à 300 milliampères en augmentant ou en diminuant le niveau du tampon, en le maintenant légèrement au-dessus des lames. Faites migrer les échantillons pendant 20 minutes, puis enregistrez à nouveau la position des lames, la température du tampon et le courant.Après l'électrophorèse, retirer délicatement les lames du réservoir et les plonger dans un tampon de neutralisation afin de neutraliser l'excès d'alcali. Égoutter ensuite les lames et répéter la neutralisation deux fois supplémentaires. Fixer les lames pendant cinq minutes avec de l'éthanol à 100 % froid.Laisser sécher les lames à l'air libre et les conserver dans un environnement sec. Pour colorer l'ADN, placer les lames sur un plateau en carton ou en métal, ajouter 200 microliters de solution de travail du colorant fluorescent pour acides nucléiques sur chaque lame, puis recouvrir d'une lamelle. Protéger les lames de la lumière et incuber pendant au moins 30 minutes.Ensuite, pour lire les lames, éliminer délicatement l'excès de solution de coloration en veillant à ne pas déranger le coverslip. Puis, placer la lame à comètes sur la platine d'un microscope à fluorescence équipé d'une caméra vidéo, et choisir aléatoirement un champ contenant des cellules. Après avoir ouvert le logiciel d'analyse des comètes, utiliser la souris pour sélectionner une cellule, puis cliquer avec le bouton gauche sur le centre de la tête de la comète de la cellule.Le logiciel calculera les paramètres pour la cellule et les ajoutera à un fichier de données. Une fois que toutes les cellules auront été comptabilisées dans le champ actuel, passez à un autre champ et répétez l'évaluation de toute cellule-comète appropriée qui apparaît, sans biais. Évaluez 10 champs aléatoires et au moins 75 comètes par lame.Enfin, enregistrez les données dans un tableur pour une analyse ultérieure. Comme mentionné précédemment, l'acétate de cyprotérone (CPA) est un médicament hormonal synthétique qui induit des tumeurs hépatiques chez le rat de manière spécifique au sexe, une dose cinq fois plus élevée étant nécessaire pour induire des tumeurs hépatiques chez les rats mâles par rapport aux femelles. Comme illustré ici, le test de la comète alcalin in vivo et le test de la comète modifié par enzyme ont montré qu'une dose de CPA cinq fois plus élevée était nécessaire pour induire une augmentation significative des dommages de l'ADN dans le foie des mâles, par rapport aux femelles.La sulfotransférase des hydroxystéroïdes, ou HST, est exprimée à des niveaux 15 fois plus élevés chez les rats adultes femelles par rapport aux mâles adultes. Le métabolisme de l'HST constitue une étape limitante dans l'activation du CPA en métabolites liant l'ADN. Comme on le voit ici, les dommages oxydatifs de l'ADN induits par le CPA étaient généralement plus importants dans le foie des rats mâles par rapport aux rats femelles, et étaient donc moins susceptibles d'être limitants dans la formation de tumeurs chez les rats mâles.Comme indiqué dans ces tableaux, l'évaluation histopathologique des foies de rats traités au CPA n'a révélé aucune preuve d'apoptose ou de nécrose induite par l'agent, confirmant ainsi les conclusions antérieures selon lesquelles les résultats positifs du test des comètes n'étaient pas un effet secondaire de la cytotoxicité. Lors de cette procédure, il est important de recueillir une suspension monocellulaire et de préparer les lames pour le test des comètes aussi rapidement que possible. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la toxicogénétique d'explorer de manière quantitative les dommages de l'ADN et leur réparation dans pratiquement tous les tissus animaux ainsi que dans des échantillons humains.Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous serez en mesure de mieux comprendre comment utiliser le test de la comète alcalin in vivo conjointement avec le test de la comète modifié par enzyme, afin de mesurer simultanément les cassures de l'ADN et les dommages oxydatifs de l'ADN, au niveau cellulaire unique dans les tissus animaux. Veuillez vous rappeler que manipuler des réactifs provoquant des lésions de l'ADN peut être extrêmement dangereux. Veuillez toujours porter des équipements de protection individuelle lorsque vous effectuez ces procédures.

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Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test d’électrophorèse alcaline unicellulaire pour quantifier les cassures d’ADN simple et double brin dans des cellules traitées à la doxorubicine. Les conditions alcalines perturbent les liaisons hydrogène entre les paires de bases d’ADN, ce qui entraîne le déroulement et la séparation complets des brins d’ADN. Cela permet la migration différentielle de fragments d’ADN intacts et endommagés dans un gel d’agarose lors de l’électrophorèse,...

L’électrophorèse alcaline sur gel unicellulaire : une technique sensible pour l’estimation quantitative des dommages à l’ADN dans les cellules cancéreuses individuelles après une chimiothérapie

La vidéo montre le test de comète pour détecter les dommages à l’ADN après une exposition à des agents nocifs. Dans des conditions alcalines, l’ADN se déroule et se dénature, et lors de l’électrophorèse, l’ADN intact et endommagé migre différemment dans le gel d’agarose, formant une structure en forme de comète. L’ADN non endommagé qui migre lentement forme la tête de comète circulaire, tandis que les fragments d’ADN endommagés qui migrent rapidement forment la queue de comète allongée.

Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

Test des comètes mesure cassures de l'ADN induites par différents facteurs. Si tous les facteurs (sauf stress oxydatif) causant des dommages de l'ADN sont maintenus constants, le montant des dommages à l'ADN est un bon paramètre indirect de stress oxydatif. L'objectif de ce protocole est d'utiliser test des comètes pour la mesure indirecte du stress oxydatif.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Un protocole pour évaluer les changements dans les niveaux de dommages à l’ADN et la capacité de réparation de l’ADN qui peuvent être induits par l’irradiation chronique in vivo à faible dose dans les lymphocytes de la rate de souris, en mesurant l’histone phosphorylée H2AX, un marqueur des cassures double brin de l’ADN, à l’aide de la cytométrie en flux est présenté.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

Nous décrivons ici deux modifications du test de la fibre d’ADN pour étudier les lacunes de l’ADN monocaténaire dans la réplication de l’ADN après l’induction de la lésion. Le test de fibre S1 permet la détection des lacunes post-réplicatives à l’aide de l’endonucléase S1 spécifique à l’ADNSS, tandis que le test de remplissage des lacunes permet la visualisation et la quantification de la réparation des lacunes.

Détection de l’accumulation et de la réparation des lacunes post-réplicatives dans les cellules humaines à l’aide du test de fibre d’ADN

Le test de comète est un moyen populaire de détecter les dommages à l’ADN. Cette étude décrit une approche pour exécuter des glissements dans des variantes représentatives du test de la comète. Cette approche a considérablement augmenté le nombre d’échantillons tout en réduisant la durée d’exécution des essais, le nombre de manipulations de lames et le risque d’endommagement des gels.

Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire

Découvrez le test de la comète alcaline in vivo et sa version modifiée par enzymes pour mesurer les dommages de l'ADN dans le foie de rat. Cette méthode sensible détecte les cassures et l'oxydation de l'ADN au niveau cellulaire.

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d ADN et l ADN oxydative dommages de foie de rat (Vidéo) | JoVE Journal

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d' ADN et l' ADN oxydative dommages de foie de rat

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