Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des Coxiella burnetii

L’objectif global de cette expérience est de développer une méthode LAMP simple utilisant des réactifs lyophilisés pour la détection de C. burnetii dans des échantillons de patients. Le principal avantage de ce protocole est qu’aucun coaching n’est nécessaire pour le stockage des réactifs. Cette méthode est idéale pour une utilisation dans les milieux à ressources limitées où la fièvre Q est endémique.

La démonstration de la procédure sera faite par Tatiana, une technicienne de notre laboratoire. En commençant par l’ADN du gène cible IS1111a de C. burnetii RSA493, déterminez la concentration plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nanomètres. Convertissez la concentration d’ADN plasmidique en nombre de copies à l’aide des calculs suivants, où 6330 est égal à la longueur et aux paires de bases du plasmide, et 34,2 nanogrammes par microlitre est la concentration du plasmide, telle que déterminée à l’aide du spectrophotomètre.

Préparez ensuite des dilutions en série de 8 à 10 fois du plasmide pour arriver au nombre suivant de copies par microlitre. Pour préparer le modèle d’ADN pour la réaction LAMP, commencez avec 200 microlitres d’échantillons de plasma humain, et avec le kit miniprep d’ADN, extrayez l’ADN selon le protocole du fabricant. Diluer l’échantillon final dans un volume de 20 microlitres.

Préparez 1 millilitre de tampon de réaction 2x LAMP en combinant les réactifs suivants. Mélanger par pulsation-vortex pendant 10 secondes. Pour effectuer la réaction LAMP standard, dans un tube PCR de 0,2 millilitre, mélangez 12,5 microlitres de tampon 2x LAMP, 1,2 microlitre de mélange d’amorces, 1 microlitre d’ADN polymérase Bst et 5,3 microlitres d’eau.

Ensuite, ajoutez 5 microlitres d’ADN à la réaction de 20 microlitres et mélangez bien, puis incubez à 60 degrés Celsius dans un bain-marie ou un bloc chauffant pendant 60 minutes. Après l’incubation, terminez la réaction en ajoutant 5 microlitres de tampon de chargement de gel 10x dans le tube. Chargez ensuite 5 microlitres de produits de réaction sur un gel d’agarose à 2 % coloré avec une coloration intercalaire d’acide nucléique.

Faites fonctionner le gel dans 1x TBE à 100 volts pendant 35 minutes, puis utilisez la lumière UV pour visualiser les résultats. Pour effectuer la réaction LAMP avec des réactifs reconstitués, préparez 1 millilitre de tampon de reconstitution en combinant les réactifs suivants. Mélanger par pulsation-vortex pendant 10 secondes.

Ensuite, retirez les tubes contenant les réactifs lyophilisés du sac en aluminium scellé. Pour l’étape 4.2, il est très important de s’assurer que le sac en aluminium est correctement fermé avant de l’ouvrir. N’utilisez pas les tubes si le sac en aluminium n’est pas scellé ou s’il est endommagé.

Ajoutez 20 microlitres de tampon de reconstitution dans chaque tube de réactifs et mélangez en pipetant de haut en bas cinq fois. Assurez-vous que les réactifs lyophilisés sont complètement remis en suspension. Ensuite, ajoutez 5 microlitres de matrice d’ADN aux réactifs reconstitués et mélangez bien.

Incuber à 60 degrés Celsius dans un bain-marie ou un bloc chauffant pendant 60 minutes. Pour terminer la réaction après l’incubation, ajoutez 5 microlitres de tampon de chargement de gel 10x, puis ajoutez 5 microlitres de produits de réaction sur un gel d’agarose à 2 % coloré avec une coloration d’acide nucléique intercalaire. Faites fonctionner le gel dans 1x tampon TBE à 100 volts pendant 35 minutes, puis visualisez les résultats à la lumière UV.

Pour effectuer la réaction LAMP avec du bleu d’hydroxynaphtol, ou HNB, ou colorant intercalant, préparez 1 millilitre de tampon de reconstitution en combinant les réactifs suivants qui incluent HNB ou un colorant intercalateur fluorescent. Mélanger par pulsation-vortex pendant 10 secondes. Effectuez la réaction LAMP comme décrit ci-dessus et utilisez la lumière UV ou l’œil nu pour visualiser les résultats.

Pour effectuer la réaction LAMP avec un scanner de tube, ajoutez 5 microlitres d’ADN aux réactifs reconstitués contenant le colorant intercalateur fluorescent, puis insérez le tube fermé dans le scanner de tube. Réglez la température d’incubation à 60 degrés Celsius et mesurez la fluorescence à 520 nanomètres pendant 60 minutes. Cette figure montre les résultats de la réaction LAMP sur des gels d’agarose avec des réactifs fraîchement préparés et des réactifs lyophilisés.

Observez que le réactif lyophilisé maintient son activité. Les réactions LAMP préparées par les deux réactifs ont détecté 25 copies de la matrice d’ADN. Dans cette figure, la détection des produits de la réaction avec du HNB ou un colorant intercalateur fluorescent dans la réaction est illustrée.

L’ajout de HNB à la réaction produit un changement de couleur visuel, du violet au bleu, avec 25, 50 et 100 copies de matrice d’ADN présentes dans les réactions. De plus, l’inclusion d’un colorant intercalateur fluorescent dans la réaction montre un signal fluorescent fort avec la lumière UV lorsque des nombres similaires de copies d’ADN sont présents. Voici les résultats de l’utilisation du scanner de tube pour surveiller les signaux fluorescents en temps réel avec un colorant intercalateur fluorescent.

Les signaux fluorescents sont supérieurs à la ligne de base après 14, 18, 21 et 23 minutes, avec 10^6, 10^4, 10^3 et 100 copies de matrice d’ADN dans les réactions. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en 90 minutes. Après sa mise au point, ce test a ouvert la voie au diagnostic rapide de l’infection à Coxiella burnetii dans les zones aux ressources limitées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reconstituer les réactifs LAMP lyophilisés. N’oubliez pas que les échantillons de patients peuvent être infectieux et que des précautions de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.