Name: Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des Coxiella burnetii (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Découvrez une méthode LAMP simple utilisant des réactifs lyophilisés pour détecter Coxiella burnetii dans des échantillons cliniques. Cette approche facilite le diagnostic de la fièvre Q dans les régions à ressources limitées.

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Cette recherche a été soutenue par Naval Medical Research Center, unité de recherche de travail 6000.RAD1.J.A0310. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement la politique ou la position officielle du ministère de la Marine, Département de la Défense, ou le gouvernement des États-Unis. Wei-Mei Ching est un employé du gouvernement des États-Unis. Ce travail a été préparé dans le cadre de ses fonctions officielles. Titre 17 USC §105 prévoit que «la protection des droits d&#39;auteur sous ce titre ne sont pas disponibles pour tous les travaux du gouvernement des États-Unis.» Titre 17 USC §101 définit un travail du gouvernement des États-Unis comme un travail préparé par un membre du service militaire ou employé du gouvernement américain dans le cadre de fonctions officielles de cette personne.

1. Préparer ADN plasmidique Dilutions comme standard pour LAMP Réaction <ol><li> Utiliser un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique (DO) à 260 nm pour déterminer le plasmide (contenant IS1111a du gène cible de C. burnetii RSA 493) la concentration d&#39;ADN. Une DO260 de 1 correspond à 50 pg / pl d&#39;ADN. </li><li> Convertir la quantité d&#39;ADN plasmidique dans le nombre de copies. Étant donné que la taille du plasmide est de 6330 pb, le poids moléculaire de ce plasmide est de 4,1 x 10 6 g (6,330 bp x 649 g / pb). La concentration d&#39;ADN du plasmide est de 34,2 ng / pl (tel que déterminé à l&#39;étape 1.1). 1 ul de cet échantillon d&#39;ADN contient 34,2 ng d&#39;ADN de plasmide, ce qui équivaut à 5 x 10 9 copies (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 x 10 6,02 gx 23) de l&#39; ADN. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;ADN plasmidique (5 x 10 9 copies / pl) à 90 pl d&#39;eau pour une dilution de 10 fois pour obtenir un échantillon d&#39;ADN de 5 x 10 8 copies / ul. </li><li> Répétez l&#39; étape 1.3 pour préparer des échantillons d&#39; ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6 à 5 x 10 5 5 x 10 4 à 5 x 10 3 à 5 x 10 2 à 5 x 10 1 et 5 x 10 0 copies / ul. </li></ol> 2. Préparer Modèle d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons pour LAMP Reaction <ol><li> Réaliser une extraction d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons de plasma humain en utilisant un kit d&#39;ADN de mini-utilitaire selon le protocole du fabricant. Utilisez un total de 200 échantillons ul pour l&#39;extraction et éluer l&#39;ADN extrait dans un volume de 20 pi. </li></ol> 3. Préparer 2x tampon de réaction LAMP <ol><li> Mélanger 200 pi de 10x Pol Buffer, 320 pi de 5 M trimethylglycine, 12 pi de 1 M MgSO 4, 280 pi de mélange de dNTP (10 mM chacun) et 188 pi d&#39;eau pour faire 1 ml de tampon 2x LAMP. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes. </li></ol> 4. Effectuez standard LAMP Réaction <ol><li> Mélanger 12,5 pl de 2x LATampon MP (tel que préparé à l&#39; étape 3; 40 mM de Tris-HCl (pH 8,8), KCl 20 mM , du sulfate de magnésium 16 4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, 1,6 M triméthylglycine, 1,4 mM de mélange de dNTP), 1,2 pi de mélange d&#39; amorces, 1 pi d&#39;ADN polymerase Bst (8 U / ul) et 5,3 ul d&#39;eau pour rendre le mélange réactionnel (20 ul) dans un tube PCR de 0,2 ml. </li><li> Ajouter 5 pi d&#39;ADN (de l&#39;étape 1 ou 2) au mélange de réaction de 20 ul et bien mélanger. </li><li> Fermer le tube et incuber à 60 ° C pendant 60 min dans un bain d&#39;eau ou d&#39;un bloc de chauffage. Ceci est la température de réaction optimale déterminée au préalable. </li><li> Ajouter 5 ul de 10 x tampon de charge de gel pour terminer la réaction. </li><li> Charge 5 pi de produits de réaction sur un gel d&#39;agarose 2% coloré avec intercalation colorant d&#39;acide nucléique. </li><li> Exécutez gel à 100 V pendant 35 min dans un tampon 1x TBE. </li><li> Visualisez les résultats par la lumière UV. </li></ol> 5. Effectuez LAMP Réaction avec ReconstituéRéactifs <ol><li> Mélanger 125 pi de tampon 10x Pol, 200 pi de 5 M triméthylglycine, 7,5 ul de 1 M MgSÛ4, 667,5 pi d&#39;eau pour faire 1 ml de tampon de reconstitution. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes. </li><li> Retirer les tubes qui contiennent les réactifs lyophilisés du sachet en feuille d&#39;aluminium scellée. Ne pas utiliser les tubes si le sac de papier d&#39;aluminium ne soit pas scellé ou si elle est endommagée. </li><li> Ajouter 20 pi de tampon de reconstitution dans chaque tube pour remettre en suspension les réactifs lyophilisés. </li><li> Mélanger par pipetage tampon de haut en bas 5 fois. Jetez un coup d&#39;oeil pour vous assurer que les réactifs lyophilisés sont complètement remis en suspension. La poudre blanche devrait disparaître dans le tube. </li><li> Ajouter 5 ul de matrice d&#39;ADN (de l&#39;étape 1 ou 2) pour les réactifs reconstitués et bien mélanger. </li><li> Fermer le tube et incuber à 60 ° C pendant 60 min dans un bain d&#39;eau ou d&#39;un bloc de chauffage. </li><li> Ajouter 5 ul de 10 x tampon de charge de gel pour terminer la réaction. </li><li> Charge 5 pi de réactionproduits à un gel d&#39;agarose à 2% coloré avec intercalation colorant d&#39;acide nucléique. </li><li> Exécutez gel à 100 V pendant 35 min dans un tampon 1x TBE. </li><li> Visualisez les résultats par la lumière UV. </li></ol> 6. Effectuer LAMP Réaction avec tampon de reconstitution contenant HNB ou fluorescent intercalant Dye <ol><li> Mélanger 125 ul de 10 x Pol tampon, 200 ul de 5 M triméthylglycine, 7,5 ul de 1 M MgSO 4, 7,5 pi d&#39;mM HNB 20 (ou 12,5 pi de 100x colorant fluorescent intercalant) et 660 ul (ou 655 pi) d&#39;eau à faire 1 ml de tampon de reconstitution. Mélanger par impulsions tourbillonnement pendant 10 secondes. </li><li> Utilisez le tampon reconstitué préparé à l&#39;article 6 de répéter les étapes 5.2 - 5.6. </li><li> Visualisez les résultats par l&#39;oeil nu (réaction contenant HNB) ou une lumière UV (réaction contenant colorant fluorescent intercalant). </li></ol> 7. Effectuer en temps réel LAMP Réaction avec Tube Scanner <ol><li> Ajouter 5 ul ADN à la reconstitutréactifs és contenant colorant fluorescent intercalant, fermer le tube et l&#39;insérer dans le scanner de tube. </li><li> Régler la température d&#39;incubation à 60 ° C. Mesurer la fluorescence à 520 nm pendant 60 min. </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
<li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+and+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li>
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<li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li>
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<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+%28LAMP%29+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li>
<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Auparavant, nous avons développé un test LAMP sensible et spécifique ciblant l&#39;élément d&#39;insertion IS1111a 14. L&#39;élément IS1111 a été choisi parce qu&#39;il est hautement conservée entre les différentes souches de C. burnetii et son nombre élevé de copies (7-110) dans les bactéries (Klee 2006). Nos résultats ont montré que la lampe peut détecter environ 25 copies de l&#39;élément IS1111, qui peut en corrélation avec aussi peu que une copie chromosomique de C...

Le petit Gram négatif bactérie Coxiella burnetii est l&#39;agent causal de la fièvre Q, qui est une zoonose dans le monde entier. En raison de la distribution mondiale de la fièvre Q et la forte infectivité de C. burnetii, les militaires et les civils américains déployés à l&#39; étranger sont à risque d&#39;être infectés dans les zones endémiques. La fièvre Q se manifeste sous deux formes: les infections aiguës et chroniques. La fièvre Q aiguë se présente avec des symptômes semblables à la grippe, l&#39;hépatite, ou la pneumonie, et est habituellement une maladie auto-limitation avec un faible taux de mortalité. La fièvre Q chronique, alors que moins répandue, se traduit souvent par une endocardite, qui a un taux de mortalité beaucoup plus élevé si non traitée 1,2. Par conséquent, le diagnostic précoce pour guider un traitement approprié est essentiel pour les soins aux patients. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) et en temps réel de PCR quantitative (qPCR) essais ont été développés pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures cellulaires et des échantillons cliniques 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Les deux PCR et qPCR sont coûteuses et souvent pas facilement disponibles dans les zones de ressources limitées pour le travail de routine. Initialement décrit par Notomi 6, isothermes amplification de boucle médiée (LAMP) offre une méthode d&#39;amplification d&#39; ADN alternative. Lampe utilise l&#39; ADN polymerase Bst pour la synthèse d&#39;ADN par déplacement de brin ainsi que des ensembles d&#39; amorces spécialement conçues qui reconnaissent au moins six régions indépendantes du gène cible. L&#39;avantage le plus important de lampes est que l&#39;amplification se produit dans des conditions isothermes. Par conséquent, seul un bain d&#39;eau, bloc chauffant ou un incubateur est nécessaire. Cette méthode a été utilisée pour détecter plusieurs pathogènes rickettsies 7-9. La visualisation des produits d&#39;ADN amplifiés par électrophorèse sur gel est la méthode la plus précise qui permet de différencier les vrais positifs de faux positifs dus à une amplification non spécifique. Toutefois, les procédures impliquées dans l&#39;électrophorèse sur gel ne sont pas pratiques pour les ar des ressources limitéeseas. Plusieurs méthodes ont été développées pour détecter les produits de la réaction. Ces alternatives, telles que la turbidité dérivée de la formation de pyrophosphate de magnésium 10 ou à l&#39; aide d&#39; un colorant fluorescent intercalant pour être visualisé sous lumière UV 11,12 sont plus favorables que l&#39; exécution d&#39; un gel. Les réactifs LAMP ont été stables pendant un mois lorsqu&#39;il est conservé à 25 ° C et 37 ° C, qui sont des températures ambiantes dans les pays tropicaux et sub-tropicales où la fièvre Q est endémique 13. Un essai de lampe a été développé dans notre laboratoire pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de plasma 14. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation du mélange réactionnel de lampe à partir des réactifs lyophilisés. Les réactifs lyophilisés sont stables pendant un mois lorsqu&#39;il est conservé à température ambiante. Lorsqu&#39;il est combiné avec une méthode de visualisation facile, ceci est une méthode idéale à utiliser pour détecter C. burnetii dans un cadre de ressources limitées.

<table><tbody><tr><td>amorces LAMP</td><td>Eurofins MWG opéron</td><td>10 nmol, sans sel</td><td>Séquence conçue par le client</td></tr><tr><td>Bst ADN polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 unités/ml</td></tr><tr><td>10x tampon thermo pol</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>mélange dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM chacun</td></tr><tr><td>Bétaïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, triméthylglycine</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>tampon de chargement de gel</td></tr><tr><td>SYBR vert</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10 000x, visualiser les produits en tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10 000x, visualiser les produits en gels</td></tr><tr><td>Réactifs lyophilisés</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphtol blue</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant scanner de tube</td><td>Qiagen</td><td></td><td>détection en temps réel</td></tr></tbody></table>

le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes amplification réactifs pour la détection des<em&gt; coxiella burnetii</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, l&#39;agent responsable de la fièvre Q, est une bactérie intracellulaire obligatoire. Des dosages diagnostiques basées sur la PCR ont été développées pour détecter C. ADN burnetii dans des cultures de cellules et d&#39; échantillons cliniques. PCR nécessite un équipement spécialisé et une formation approfondie de l&#39;utilisateur final, et par conséquent, il ne convient pas pour le travail de routine en particulier dans une zone de ressources limitées. Nous avons mis au point une boucle à médiation par une amplification isotherme (LAMP) essai pour détecter la présence de C. burnetii dans des échantillons de patients. Ce procédé est effectué à une seule température d&#39;environ 60 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant. La sensibilité de ce dosage de la lampe est très similaire à la PCR avec une limite de détection d&#39;environ 25 copies par réaction. Ce rapport décrit la préparation de la réaction en utilisant des réactifs lyophilisés et la visualisation des résultats en utilisant le bleu hydroxynaphthol (HNB) ou une lampe UV avec colorant fluorescent intercalant dans la réaction. Les réactifs LAMP étaient lyophilized et conservé à température ambiante (TA) pendant un mois, sans perte de sensibilité de détection. Ce test LAMP est particulièrement robuste car la préparation du mélange réactionnel ne comporte pas d&#39;étapes complexes. Cette méthode est idéale pour une utilisation dans des environnements à ressources limitées où la fièvre Q est endémique.

Les réactifs LAMP lyophilisés l&#39; intérieur du tube de 0,2 ml contient Bst ADN polymérase, des amorces et des dNTP. 20 ul de tampon de reconstitution est utilisée pour remettre en suspension les réactifs lyophilisés. La figure 1 montre les résultats de la réaction LAMP sur des gels d&#39; agarose avec des réactifs fraîchement préparés et des réactifs lyophilisés. Le réactif lyophilisé ne réduit pas son activité. Les réactions de LAMP préparées par les réactif...

Nous avons décrit ici une méthode simple d’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) utilisant des réactifs lyophilisés pour la détection de C. burnetii dans des échantillons de patients.

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

L'objectif général de cette expérience est de développer une méthode LAMP simple utilisant des réactifs lyophilisés pour la détection de C.burnetii dans des échantillons de patients. Le principal avantage de ce protocole est qu'aucune formation n'est requise pour le stockage des réactifs. Cette méthode est idéale pour une utilisation dans des contextes à ressources limitées où la fièvre Q est endémique.La procédure sera démontrée par Tatiana, une technicienne de notre laboratoire. À partir de l'ADN du gène cible IS1111a de C.burnetii RSA493, déterminez la concentration du plasmide à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nanomètres. Convertissez la concentration en ADN plasmidique en nombre de copies à l'aide des calculs suivants, où 6330 correspond à la longueur en paires de bases du plasmide, et 34,2 nanogrammes par microlitre est la concentration du plasmide, telle que déterminée précédemment à l'aide du spectrophotomètre.Préparez ensuite des dilutions sérielles du plasmide par facteurs de 8 à 10 pour obtenir le nombre suivant de copies par microlitre. Pour préparer le modèle d'ADN pour la réaction LAMP, commencez avec 200 microlitres d'échantillons de plasma humain et, à l'aide du kit de minipréparation d'ADN, extrayez l'ADN selon le protocole du fabricant. Diluez l'échantillon final dans un volume de 20 microlitres.Préparez 1 millilitre de tampon de réaction LAMP 2x en combinant les réactifs suivants. Mélangez par vortexage bref pendant 10 secondes. Pour réaliser la réaction LAMP standard, dans un tube PCR de 0,2 millilitre, mélangez 12,5 microlitres de tampon LAMP 2x, 1,2 microlitre de mélange d'amorces, 1 microlitre de polymérase Bst ADN et 5,3 microlitres d'eau.Ensuite, ajoutez 5 microlitres d'ADN à la réaction de 20 microlitres et mélangez soigneusement, puis incubez à 60 degrés Celsius dans un bain-marie ou un bloc chauffant pendant 60 minutes. Après l'incubation, arrêtez la réaction en ajoutant 5 microlitres de tampon de charge 10x au tube. Chargez ensuite 5 microlitres des produits de réaction sur un gel d'agarose à 2 % coloré avec un colorant intercalant pour acides nucléiques.Faites migrer le gel dans du TBE 1x à 100 volts pendant 35 minutes, puis utilisez une lumière UV pour visualiser les résultats. Pour réaliser la réaction LAMP avec des réactifs reconstitués, préparez 1 millilitre de tampon de reconstitution en combinant les réactifs suivants. Mélangez par vortexage bref pendant 10 secondes.Ensuite, retirez les tubes contenant les réactifs lyophilisés du sachet en aluminium scellé. Pour l'étape 4.2, il est très important de s'assurer que le sachet en aluminium est correctement scellé avant de l'ouvrir. N'utilisez pas les tubes si le sachet en aluminium n'est pas scellé ou est endommagé.Ajouter 20 microlitres de tampon de reconstitution dans chaque tube de réactifs et mélanger en pipettant cinq fois vers le haut et vers le bas. S'assurer que les réactifs lyophilisés sont complètement resuspendus. Ensuite, ajouter 5 microlitres de matrice d'ADN aux réactifs reconstitués et bien mélanger.Incuber à 60 degrés Celsius dans un bain-marie ou un bloc chauffant pendant 60 minutes. Pour arrêter la réaction après l'incubation, ajouter 5 microlitres de tampon de charge pour gel 10x, puis déposer 5 microlitres des produits de réaction sur un gel d'agarose à 2 % coloré avec un colorant intercalant pour acides nucléiques. Faire migrer le gel dans du tampon TBE 1x à 100 volts pendant 35 minutes, puis visualiser les résultats sous lumière UV.Pour réaliser la réaction LAMP avec du bleu d'hydroxynaphtol, ou HNB, ou un colorant intercalant, préparez 1 millilitre de tampon de reconstitution en combinant les réactifs suivants comprenant le HNB ou un colorant intercalant fluorescent. Mélangez par vortexage bref pendant 10 secondes. Effectuez la réaction LAMP comme décrit précédemment et utilisez une lumière UV ou l'œil nu pour visualiser les résultats.Pour réaliser la réaction LAMP avec un lecteur de tubes, ajoutez 5 microlitres d'ADN aux réactifs reconstitués contenant le colorant intercalant fluorescent, puis insérez le tube fermé dans le lecteur de tubes. Réglez la température d'incubation à 60 degrés Celsius et mesurez la fluorescence à 520 nanomètres pendant 60 minutes. Cette figure montre les résultats de la réaction LAMP sur des gels d'agarose avec des réactifs fraîchement préparés et des réactifs lyophilisés.Observer que le réactif lyophilisé conserve son activité. Les réactions LAMP préparées à l'aide des deux réactifs ont détecté 25 copies de matrice d'ADN. Sur cette figure, la détection des produits de la réaction avec le HNB ou un colorant intercalant fluorescent dans la réaction est montrée.L'ajout de HNB à la réaction produit un changement de couleur visible, passant du violet au bleu, avec 25, 50 et 100 copies de matrice d'ADN présentes dans les réactions. De plus, l'incorporation d'un colorant intercalant fluorescent dans la réaction montre un signal fluorescent intense sous lumière UV lorsque des nombres de copies d'ADN similaires sont présents. Les résultats présentés ici proviennent de l'utilisation d'un scanner de tubes permettant de surveiller en temps réel les signaux fluorescents avec un colorant intercalant fluorescent.Les signaux fluorescents sont supérieurs à la ligne de base après 14, 18, 21 et 23 minutes, avec respectivement 10^6, 10^4, 10^3 et 100 copies de matrice d'ADN dans les réactions. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en 90 minutes. Après son développement, ce test a permis un diagnostic rapide de l'infection par Coxiella burnetii dans les zones à ressources limitées.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment reconstituer les réactifs LAMP lyophilisés. N’oubliez pas que les échantillons de patients peuvent être infectieux et que des précautions de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Research

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Domesle, K. J., et al. Amplification isothermique médiée par boucle pour le dépistage de Salmonella dans la nourriture animale et la confirmation de Salmonella par isolement en culture.  J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo démontre la technique d’amplification isothermique médiée par boucle (LAMP) pour détecter un gène bactérien cible en amplifiant l’ADN à température constante. Le mélange réactionnel est préparé en ajoutant un mélange maître isotherme, des amorces spécifiques pour le gène...

Amplification isotherme médiée par boucle pour la détection des gènes bactériens

Cette vidéo présente une méthode d’évaluation de la croissance intracellulaire de mutants de Coxiella marqués à la GFP dans des cellules épithéliales en culture. Le phénotype mutant est visualisé à l’aide de l’immunocoloration et de la microscopie à épifluorescence, ce qui permet d’étudier l’effet de la mutation sur la croissance intracellulaire.

Évaluation de la croissance intracellulaire des mutants de Coxiella dans les cellules eucaryotes

Le diagnostic de l’infection à Eimeria chez les poulets reste exigeant. Les approches basées sur la morphologie du parasite et la pathologie de l’hôte sont souvent peu concluantes, tandis que les approches moléculaires basées sur la PCR se sont avérées exigeantes en termes de coût et d’expertise. L’objectif de ce protocole est d’établir l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) comme diagnostic moléculaire simple de l’infection eimérienne.

amplification isotherme (LAMP) Essais de boucle médiation pour la détection des espèces spécifiques de<em&gt; Eimeria</em&gt; Qui infectent les poulets

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Développement d&#39;un Quantitative recombinase polymérase L&#39;amplification Assay avec un contrôle positif interne

Coxiella burnetii est une bactérie intracellulaire Gram négatif obligatoire responsable de la maladie zoonotique la fièvre Q. Nous décrivons ici des procédés pour la génération de mutants de transposon Coxiella fluorescent ainsi que l'identification et l'analyse automatisée de l'internalisation, la réplication et cytotoxiques phénotypes résultants.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Ici, nous présentons un protocole pour le développement et la validation d’une méthode de PCR quantitative utilisée pour la détection et la quantification de l’ADN de l’EHV-2 dans les fluides respiratoires équins. Le protocole de validation de la qRT-PCR EHV-2 implique une procédure en trois parties : le développement, la caractérisation du test qRT-PCR seul et la caractérisation de l’ensemble de la méthode analytique.

Développement et validation d&#39;une méthode de PCR quantitative pour équidé herpèsvirus-2 Diagnostics dans respiratoires Fluides

L'étude des interactions entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes est un domaine important de la recherche biologique. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour mesurer la translocation effecteur par Coxiella burnetii lors de l' inactivation de gène siRNA en utilisant un substrat BlaM.

Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Pendant siRNA Silencing

Ce protocole décrit la fabrication d’une cassette de petite, prêt à l’emploi qui peut être appliquée pour la détection visuelle de plusieurs acides nucléiques lors d’un test unique, qui est facile à utiliser. Dans cette approche, une gamme capillaire a été utilisée pour multiplexe et très efficace de détection des cibles de l’OGM.

Détection visuelle de plusieurs acides nucléiques dans une gamme capillaire

L’amplification isothermale à base de boucle (LAMP) est un test isothermal d’amplification de l’acide nucléique (iNAAT) qui a suscité un grand intérêt dans le domaine de la détection des pathogènes. Ici, nous présentons un protocole Salmonella LAMP validé en laboratoire comme une méthode rapide, fiable et robuste pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de salmonella présumée de l’isolement culturel.

Amplification isothermale à médiatographie en boucle pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de Salmonella de l’isolement culturel

Le présent travail décrit les étapes de production d’une qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de T. cruzi qui peut être préchargée sur la cuve de réaction et conservée au réfrigérateur pendant plusieurs mois.

qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes

Divers agents pathogènes bactériens peuvent provoquer des infections des voies respiratoires et entraîner de graves problèmes de santé s’ils ne sont pas détectés avec précision et traités rapidement. La détection rapide et précise de ces agents pathogènes par amplification isotherme médiée par boucle permet une gestion et un contrôle efficaces des infections des voies respiratoires en milieu clinique.

Détection rapide d’agents pathogènes bactériens à l’origine d’infections des voies respiratoires inférieures grâce à une amplification isotherme médiée par boucle à base de puce microfluidique

Découvrez une méthode LAMP simple utilisant des réactifs lyophilisés pour détecter Coxiella burnetii dans des échantillons cliniques. Cette approche facilite le diagnostic de la fièvre Q dans les régions à ressources limitées.

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des

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