Name: Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et lADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites dintégration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez l'amplification PCR et le séquençage de sites d'intégration rétrovirale à partir d'ADN génomique. Cette méthode bioinformatique permet de cartographier précisément les intégrations virales dans le génome hôte.

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Nous sommes reconnaissants à nos collègues Stephen Hughes et Henry Levin conseil qui était essentiel d&#39;établir le protocole NGS pour rétroviral séquençage du site d&#39;intégration dans le laboratoire Engelman. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux américains de la santé accorde AI039394 et AI052014 (à ANE) et AI060354 (Centre universitaire de Harvard for AIDS Research).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un protocole pour l&#39;analyse des sites d&#39;intégration de retrovirus, de l&#39;étape d&#39;infection par le virus initial par mappage des profils de distribution génomique, est décrite. Ce protocole est applicable à tout retrovirus et tout type de cellule infectable. En outre, la conduite de dosage est très sensible, avec la possibilité de récupérer un nombre satisfaisant des sites uniques d&#39;intégration à partir de dilutions en série de l&#39; ADN génomique équivalent à celui d&#39;une infection initiée avec un...

L&#39;intégration de l&#39;ADN viral (vDNA) dans le génome de la cellule hôte est une étape essentielle dans le cycle de vie retroviral. L&#39; intégration est réalisée par l&#39;enzyme intégrase virale (IN), qui réalise deux procédés catalytiques distincts qui conduisent à la mise en place du provirus inséré de façon stable 1. EN unités s&#39;engager les extrémités de la vDNA linéaire qui est produite par transcription inverse, la formation de la intasome d&#39;ordre supérieur avec vDNA extrémités maintenues ensemble par un multimère EN 2-4. EN clive &#39;extrémités de la vDNA en aval de 5&#39;-CA-3 invariants du 3 séquences dans un processus connu sous le nom 3&#39;-traitement, laissant en retrait extrémités 3&#39; avec des groupes hydroxyles réactifs à chaque vDNA terminale 5-8. Le intasome est ensuite importé dans le noyau dans le cadre d&#39;un grand ensemble de l&#39; hôte et des protéines virales connues comme le complexe de pré - intégration (PIC) 9-11. Après avoir rencontré l&#39;ADN cible cellulaire (ADNt), IN utilise le vDNA 3&#39;-hydroxyle groups pour cliver le haut ADNt et des brins inférieurs en quinconce et se joint à la vDNA à des groupes de phosphate ADNt 5 &#39;dans le processus de transfert de brin 12,13 simultanément. Rétrovirus préférences du site d&#39;intégration d&#39;exposition sur les échelles locales et globales. Localement, les sites d&#39;intégration de consensus sont constitués de séquences palindromiques TDNA faiblement conservés qui enjambent d&#39;environ cinq à dix paires de bases en amont et en aval des sites d&#39;insertion vDNA 14,15. Globalement, les retrovirus ciblent annotations chromatine spécifiques 16. Il y a sept genres différents rétroviral - alpha par epsilon, lenti et spuma. Les lentivirus, qui comprennent le VIH-1, favorisent l&#39; intégration au sein des organes de gènes activement transcrits 17, tandis que les gammaretroviruses intègrent préférentiellement dans les sites de transcription de démarrage (TSSS) et des régions activatrices actives 18-20. À l&#39;opposé, spumavirus est fortement biaisé vers heterochromrégions atiques, tels que les domaines de la lamina associée gènes pauvres 21. Les préférences de base ADNt locales sont en grande partie dictée par des réseaux spécifiques de contacts nucléoprotéine entre IN et ADNt 13,22,23. Pour les lentivirus et gammaretroviruses, l&#39; intégration par rapport aux annotations génomiques est en grande partie régie par des interactions entre IN et facteurs cellulaires parentes 24-27. Modifier les détails du réseau d&#39;interaction IN-ADNt 13,22,23,28 et de perturber ou de re-engineering IN-hôte interactions de facteurs 25-27,29-32 sont des stratégies éprouvées pour recibler l&#39; intégration aux niveaux local et mondial, respectivement. La puissance des procédures de séquençage d&#39;ADN utilisés au catalogue des sites d&#39;intégration rétrovirale a beaucoup augmenté au cours des dernières décennies. Les sites d&#39;intégration ont été récupérés dans le travail de pionnier en utilisant la purification laborieuse et des techniques manuelles de clonage pour obtenir une poignée de sites uniques par étude 33,34.La combinaison de l&#39; amplification LM-PCR des jonctions d&#39;ADN LTR-hôtes avec la possibilité de cartographier des sites d&#39;intégration individuels aux génomes humains et les projets de souris transformées sur le terrain, avec le nombre de sites récupérés à partir de la culture tissulaire exogène infection de cellules croissant à plusieurs centaines de milliers 17 , 18. La combinaison la plus récente de la LM-PCR avec la méthodologie NGS a envoyé la profondeur de la bibliothèque montée en flèche. Plus précisément, pyroséquençage a donné l&#39;ordre de dizaines de milliers de sites d&#39;intégration uniques 30,35-38, tandis que les bibliothèques séquencés grâce à l&#39;utilisation du regroupement d&#39;ADN peut donner des millions de séquences uniques 19-21,39. Nous décrivons ici un protocole LM-PCR optimisé pour l&#39;amplification et le séquençage des sites d&#39;intégration rétroviraux utilisant NGS de regroupement d&#39;ADN. Le procédé incorpore nécessaire séquences d&#39;adaptation dans les amorces de PCR, et donc directement dans les molécules d&#39;ADN amplifiées, ce qui empêche ainsi la nécessité d&#39;une étape de ligature adaptateur supplémentaire avant séquenCing 40. Le pipeline d&#39;analyse bio-informatique, à partir de l&#39;analyse des données de séquençage pour les premières LTR-hôtes d&#39;ADN des jonctions à la cartographie des sites uniques d&#39;intégration à PERTINENT caractéristiques génomiques, est également décrite de façon générale. Conformément à la préséance établi des protocoles méthodologiques antérieurs dans ce domaine 36,38,41-43, scripts personnalisés peuvent être développés pour faciliter la réalisation des étapes spécifiques dans le pipeline de la bioinformatique. L&#39;utilité et la sensibilité du protocole est illustré par des données représentatives de l&#39;amplification, le séquençage et la cartographie du VIH-1 des sites d&#39;intégration à partir de cellules de culture de tissus infectés à la multiplicité approximative d&#39;infection (MOI) de 1,0, ainsi qu&#39;une série de titrages de cet ADN diluée à travers l&#39; ADN cellulaire non infecté dans 5 fois des mesures pour une dilution maximale de 1: 15,625 pour obtenir le approximative MOI équivalent de 6,4 x 10 -5.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Milieu de culture cellulaire standard, compatible avec les cellules HEK293T</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Différents lots de sérum peuvent devoir être pré-sélectionnés pour une production virale optimale</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antibiotiques à ajouter à</td>la</tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate</td> DMEM <td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Utilisé pour laver les cellules</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Utilisé pour détacher les cellules adhérentes des plaques de culture tissulaire</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>réactif de transfection d’ADN</td></tr><tr><td>0,45 & micro ; m Filtres</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Utilisé pour filtrer les milieux de culture cellulaire contenant des particules virales</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Utilisé pour dégrader l’ADN plasmidique transféré des stocks de virus</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Utilisé pour quantifier le rendement de la production de virus</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de tissus</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Utilisé pour purifier l’ADN génomique des cellules</td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Avec ce modèle de sonicateur, effectuez deux cycles de service, 5 % ; intensité, 3 ; cycles par rafale, 200 ; temps, 80 sec</td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>L’eau disponible dans le commerce est recommandée pour réduire le risque de contamination croisée des échantillons</td></tr><tr><td>QIAQuick Purification PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Utilisé pour purifier l’ADN lors</td></tr> de la construction <tr><td>d’une bibliothèque End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Utilisé pour réparer les extrémités d’ADN d’échantillons d’ADN soniqué</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-5' exo&ndash ;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Utilisé avec du dATP à des fragments d’ADN réparés en queue</td></tr><tr><td>A dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Désoxyadénosine triphosphate</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Endonucléase de restriction pour le clivage de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Endonucléase de restriction pour supprimer l’amplification de la séquence U5 du VIH-1</td></tr><tr><td>en amont T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzyme pour l’assemblage covalent d’extrémités d’ADN compatibles</td></tr><tr><td>Oligonucléotides d’ADN</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>personnalisées</td><td>Demandez à l’entreprise de purifier les oligonucléotides. La purification HPLC suffit pour les ADN < 30 nucléotides ; PAGE purifier les ADN plus longs&nbsp ;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Mélange commercial contenant de l’ADN polymérase pour PCR</td></tr><tr><td>dNTP (solutions de 100 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Diluez les quatre produits chimiques sur de la glace avec de l’eau stérile pour atteindre les concentrations intermédiaires de 2,5 mM chacun dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Spectrophotomètre Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>pour la détermination de la concentration</td></tr> <tr><td>d’ADNQubit Fluorimeter</td><td>Life Technologies</td><td>Fluorimètre Qubit&reg ; 3.0</td><td>Utilisé pour confirmer la concentration d’ADN de la bibliothèque de sites d’intégration</td></tr><tr><td>Système TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Essai sur bande pour confirmer la distribution de la taille de l’ADN de la bibliothèque de sites d’intégration</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Utilisé pour le NGS</td></tr></tbody></table>

amplification, séquençage de nouvelle génération, et l&#39;adn génomique cartographie des rétrovirales sites d&#39;intégration

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Rétrovirus exposition préférences d&#39;intégration de la signature sur les deux échelles locales et globales. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour (1) génération de diverses bibliothèques de sites d&#39;intégration rétrovirales par PCR (LM-PCR) de ligature médiée et séquençage de nouvelle génération (NGS), (2) la cartographie de la localisation génomique de chaque virus- accueillir la jonction en utilisant bedtools, et (3) l&#39;analyse des données pour la pertinence statistique. L&#39;ADN génomique extrait de cellules infectées est fragmenté par digestion avec des enzymes de restriction ou par sonication. ADN après la fin de la réparation appropriée, lieurs double brin sont ligaturés sur les extrémités d&#39;ADN et la PCR semi-nichée est réalisée en utilisant des amorces complémentaires à la fois à la longue répétition terminale (LTR) du virus extrémité et l&#39;ADN de liaison ligaturer. Les amorces de PCR portent des séquences requises pour la classification de l&#39;ADN lors de NGS, niant la nécessité d&#39;adapter la ligature séparée. le contrôle de la qualité (CQ) est réalisée afin d&#39;évaluer la distribution de la taille des fragments d&#39;ADN et d&#39;adapterer ADN incorporation avant NGS. les fichiers de sortie de séquence sont filtrés pour LTR contenant lit, et les séquences définissant le LTR et l&#39;éditeur de liens sont rognées loin. des séquences de cellules hôtes rognées sont mises en correspondance à un génome de référence en utilisant BLAT et sont filtrées pour une identité minimale de 97% à un point unique dans le génome de référence. sites d&#39;intégration uniques sont examinés pour nucléotide adjacent (nt) la séquence et la distribution par rapport à diverses caractéristiques génomiques. En utilisant ce protocole, les bibliothèques de site d&#39;intégration d&#39;une grande complexité peuvent être construites à partir d&#39;ADN génomique dans les trois jours. Le protocole complet qui englobe une infection virale sensible exogène de cellules de culture tissulaire à l&#39;analyse des sites d&#39;intégration peut donc être effectuée en environ une à deux semaines. Les applications récentes de cette technologie se rapportent à l&#39;analyse longitudinale des sites d&#39;intégration de patients infectés par le VIH.

Le tableau 4 présente les résultats d&#39;une expérience représentative pour illustrer la sensibilité de NGS pour la récupération des sites d&#39;intégration d&#39;une culture de cellules infectées. ADN cellulaire non infecté a été utilisé pour diluer en série ADN génomique d&#39;une infection dans laquelle chaque cellule , en moyenne , contenait une intégration 40. Dilutions ont été préparés dans les étapes de cinq à une dilution maximale de 1: 15.625. L&#39;...

Nous décrivons un protocole permettant d’amplifier les sites d’intégration rétrovirale à partir de l’ADN génomique des cellules infectées, de séquencer les jonctions virus-hôte amplifiées, puis de cartographier ces séquences sur un génome de référence. Nous décrivons également des techniques pour quantifier la distribution des sites d’intégration par rapport à diverses annotations génomiques à l’aide de BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

L'objectif général de cette procédure est d'amplifier par PCR les sites d'intégration rétroviraux à partir d'ADN génomique total, puis de séquencer la bibliothèque d'ADN obtenue afin de pouvoir cartographier précisément les emplacements d'intégration sur un génome de référence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales en rétrovirologie fondamentale et clinique en analysant la répartition des sites d'intégration au sein d'un génome hôte. Le principal avantage de cette technique réside dans la profondeur du séquençage d'ADN, ainsi que dans la possibilité de multiplexer de nombreux échantillons lors d'un même run de séquençage.Un jour avant la transfection, ensemencer 3,3 × 10⁶ cellules HEK293T dans 10 millilitres de milieu de Dulbecco modifié et enrichi dans chacune de cinq boîtes de 100 millimètres. Le jour suivant, utiliser des réactifs de transfection disponibles dans le commerce ou du phosphate de calcium pour transfecter les cellules avec 10 microgrammes de plasmide contenant des clones moléculaires rétroviraux complets ou neuf microgrammes de vecteurs enveloppés tronqués à cycle unique plus un microgramme d’un construct exprimant VSV-G. Ajouter le mélan

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