Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l'ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d'intégration

L'objectif général de cette procédure est d'amplifier par PCR les sites d'intégration rétroviraux à partir d'ADN génomique total, puis de séquencer la bibliothèque d'ADN obtenue afin de pouvoir cartographier précisément les emplacements d'intégration sur un génome de référence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales en rétrovirologie fondamentale et clinique en analysant la répartition des sites d'intégration au sein d'un génome hôte. Le principal avantage de cette technique réside dans la profondeur du séquençage d'ADN, ainsi que dans la possibilité de multiplexer de nombreux échantillons lors d'un même run de séquençage.

Un jour avant la transfection, ensemencer 3,3 × 10⁶ cellules HEK293T dans 10 millilitres de milieu de Dulbecco modifié et enrichi dans chacune de cinq boîtes de 100 millimètres. Le jour suivant, utiliser des réactifs de transfection disponibles dans le commerce ou du phosphate de calcium pour transfecter les cellules avec 10 microgrammes de plasmide contenant des clones moléculaires rétroviraux complets ou neuf microgrammes de vecteurs enveloppés tronqués à cycle unique plus un microgramme d’un construct exprimant VSV-G. Ajouter le mélange au milieu cellulaire goutte à goutte.

Après la transfection, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Après environ 48 heures, récolter le milieu cellulaire contenant le virus à l’aide d’une pipette graduée et le faire passer à travers un filtre de 0,45 micron par écoulement gravitationnel. Ensuite, concentrer le virus par ultracentrifugation à 200 000 g pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, éliminer le surnageant jusqu'à ce qu'il reste environ 500 microlitres de DMEM FPS, puis resuspendre le culot viral. Ajouter 20 unités de DNase et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Déterminer la concentration en p24 à l'aide d'un kit de capture de l'antigène p24 du VIH-1, conformément aux instructions du fabricant.

La veille de l'infection, ensemencer 3,0 × 10⁵ cellules HEK293T dans 2,5 millilitres de DMEM FPS par puits dans une plaque de six puits et incuber toute la nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Infecter les cellules avec une concentration finale de p24 viral de 500 nanogrammes par millilitre dans 500 microlitres de DMEM FPS frais. Incuber pendant deux heures dans un incubateur de culture tissulaire.

Après deux heures, ajouter deux millilitres de DMEM FPS préchauffé à 37 degrés Celsius dans chaque puits et replacer la plaque dans l'incubateur. 48 heures après l'infection, retirer le milieu et laver les cellules avec deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Récolter les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de trypsine-EDTA préchauffée à 37 degrés Celsius, puis, après quelques secondes, examiner visuellement les puits pour vérifier le détachement des cellules.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de DMEM FPS préchauffé et resuspendez les cellules en pipetant doucement 10 fois vers le haut et vers le bas avec une pipette volumétrique. Transférez la solution dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés contenant 18 millilitres de DMEM FPS préchauffé, puis remettez-le dans l'incubateur de culture tissulaire. Au minimum cinq jours après l'infection, récoltez les cellules comme précédemment et resuspendez-les dans cinq millilitres de DMEM FPS préchauffé par pipetage.

Centrifuger la solution pendant cinq minutes à température ambiante à 2 500 ×g, puis aspirer et jeter le surnageant. Enfin, extraire l'ADN génomique du culot cellulaire à l'aide d'un kit disponible commercialement. Éluer l'ADN à partir de la colonne d'échange ionique fournie avec 200 microlitres de Tris-HCl millimolaire à pH 8,5.

Après la sonication de l'ADN génomique, purifiez l'ADN soniqué à l'aide d'un kit de purification d'ADN amplifié par PCR. Ensuite, réparez l'ADN à l'aide d'un kit de réparation des extrémités. Après la purification de l'ADN comme précédemment, ajoutez une queue A à l'ADN à l'aide de l'enzyme Klenow Exo-Minus.

Alternativement, pour la fragmentation par digestion à l'aide d'endonucléases de restriction, couper l'ADN génomique avec un mélange d'enzymes générant des extrémités 5'TA en surplomb, ainsi qu'une enzyme incompatible telle que BglII qui coupe en aval du LTR viral en amont. Digérer 10 microgrammes d'ADN génomique dans un volume final de 100 microlitres. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Veillez à purifier l'ADN final à l'aide du kit de purification d'ADN amplifié par PCR. Le linker à utiliser avec l'ADN soniqué doit posséder un overhang 3'T compatible, tandis que le linker destiné à l'ADN digéré par MseI doit comporter un overhang 5'TA compatible. Commencez par hybridation de 10 micromolaire des brins de linker court et long dans 35 microlitres de tampon Tris-HCl EDTA, en chauffant à 90 degrés Celsius puis en refroidissant lentement jusqu'à la température ambiante par paliers d'un degré Celsius par minute.

Ensuite, préparez au moins quatre réactions de ligation parallèles par échantillon d'ADN génomique contenant 1,5 micromolaire d'adaptateur ligaturé, un microgramme d'ADN fragmenté et 800 unités de ligase T4 de l'ADN dans un volume final de 50 microlitres. Effectuez la ligation toute la nuit à 12 degrés Celsius. Pour les échantillons préparés par sonication, digérez la réaction de ligation purifiée avec une enzyme de restriction qui coupe en aval du LTR amont.

Utilisez 100 unités de l'enzyme appropriée dans les conditions recommandées par le fabricant pendant la nuit. Assurez-vous que les produits finaux sont purifiés à l'aide d'un kit de purification d'ADN amplifié par PCR. Préparez les PCR du premier tour en utilisant les réactifs indiqués ici.

Effectuer la première PCR en utilisant les paramètres suivants : 94 degrés Celsius pendant deux minutes, suivis de 30 cycles de 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, 55 degrés Celsius pendant 30 secondes, 68 degrés Celsius pendant 45 secondes. Terminer par 68 degrés Celsius pendant 10 minutes. Regrouper les réactions de la première PCR et purifier l'ADN comme précédemment.

Préparez ensuite les PCR du deuxième tour contenant les réactifs indiqués ici. Utilisez les mêmes paramètres de cyclage que pour la PCR du premier tour. Après avoir regroupé et purifié l'ADN issu de la réaction du deuxième tour, effectuez un contrôle de qualité et un séquençage de nouvelle génération, puis analysez les sites d'intégration en suivant les instructions détaillées fournies dans la partie écrite du protocole.

Les sites d'intégration provenant de bibliothèques préparées par digestion avec des enzymes de restriction, comme indiqué à gauche, ou par sonication, comme indiqué à droite, ont été alignés à l'aide d'un logiciel de représentation en « web logo ». Chaque dilution de la série de titrage est représentée, allant de l'ADN pur au sommet de la figure jusqu'à la dilution maximale de un à 15 625 au bas. Le degré de certitude diminue avec l'augmentation de la dilution de l'ADN des cellules infectées.

Cette image montre le logo de séquence pour le contrôle aléatoire apparié de 50 000 sites génomiques uniques. Notez que les sites aléatoires alignés à partir du jeu de données MRC, en revanche, n'ont pas permis de générer des niveaux appréciables de préférences de bases. Une fois maîtrisée, la préparation de bibliothèques de sites d'intégration peut être réalisée à partir d'ADN génomique en trois jours.

Le cartographage des sites d'intégration, de l'infection initiale à l'analyse bioinformatique terminée, peut donc être réalisé en environ deux semaines. Suite à cette procédure, des milliers, voire des millions de sites d'intégration rétrovirale uniques peuvent être répertoriés, et diverses analyses peuvent être menées afin de quantifier les associations entre les sites d'insertion et les annotations génomiques.