Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l'ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d'intégration

L’objectif global de cette procédure est d’amplifier par PCR les sites d’intégration rétrovirale à partir de l’ADN génomique en vrac et de séquencer la banque d’ADN résultante, de sorte que des emplacements d’intégration précis puissent être cartographiés sur un génome de référence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en rétrovirologie fondamentale et clinique en analysant la distribution des sites d’intégration dans le génome de l’hôte. Le principal avantage de cette technique est la profondeur de séquençage de l’ADN et le fait que de nombreux échantillons peuvent être multiplexés en une seule séquence de séquençage.

Un jour avant la transfection, mettez 3,3 fois 10 à la sixième HEK293T cellules dans 10 millilitres de milieu d’aigle modifié de Dulbecco complété dans chacune des cinq boîtes de 100 millimètres. Le lendemain, utilisez des réactifs de transfection disponibles dans le commerce ou du phosphate de calcium pour transfecter les cellules avec 10 microgrammes de plasmide portant des clones moléculaires rétroviraux complets ou neuf microgrammes de vecteurs simples ronds élidés enveloppés plus un microgramme d’une construction d’expression VSV-G. Ajouter le mélange dans le milieu cellulaire goutte à goutte.

Après la transfection, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Après environ 48 heures, récoltez le milieu cellulaire contenant le virus à l’aide d’une pipette volumétrique et passez-le à travers un filtre de 0,45 micron par écoulement par gravité. Ensuite, concentrez le virus par ultracentrifugation à 200 000 G pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, retirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste environ 500 microlitres de DMEM FPS, et remettez en suspension la pastille virale. Ajoutez 20 unités de DNase et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius. Déterminer la concentration de p24 à l’aide d’un kit de capture de l’antigène p24 du VIH-1 selon les instructions du fabricant.

La veille de l’infection, on dispose 3,0 fois 10 à la cinquième HEK293T cellules dans 2,5 millilitres de DMEM FPS par puits dans une plaque à six puits et on les incube pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire. Infectez les cellules avec une concentration virale finale de p24 de 500 nanogrammes par millilitre dans 500 microlitres de DMEM FPS frais. Incuber pendant deux heures dans un incubateur de culture tissulaire.

Après deux heures, ajoutez deux millilitres de DMEM FPS préchauffé à 37 degrés Celsius dans chaque puits et remettez la plaque dans l’incubateur. 48 heures après l’infection, retirez le milieu et lavez les cellules avec deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Récoltez les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de trypsine-EDTA préchauffé à 37 degrés Celsius, et après quelques secondes, inspectez visuellement les puits pour déloger les cellules.

Ajoutez ensuite deux millilitres de DMEM FPS préchauffé et remettez les cellules en suspension en pipetant doucement de haut en bas 10 fois avec une pipette volumétrique. Transférez la solution dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés contenant 18 millilitres de DMEM FPS préchauffé et retournez-le dans l’incubateur de culture tissulaire. Au moins cinq jours après l’infection, récoltez les cellules comme avant et mettez-les en suspension dans cinq millilitres de DMEM FPS préchauffé par pipetage.

Centrifugez la solution pendant cinq minutes à température ambiante à 2 500 G, puis aspirez et jetez le surnageant. Enfin, extrayez l’ADN génomique de la pastille cellulaire à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Eluter l’ADN de la colonne d’échange d’ions fournie avec 200 microlitres de Tris-HCL millimolaire à pH 8,5.

Après sonication de l’ADN génomique, purifiez l’ADN soniqué à l’aide d’un kit de purification PCR. Ensuite, réparez l’ADN à l’aide d’un kit de réparation d’extrémité. Après purification de l’ADN comme précédemment, A suit l’ADN à l’aide de l’enzyme Klenow Exo-Minus.

Alternativement, pour la fragmentation par digestion d’endonucléases de restriction, coupez l’ADN génomique avec un cocktail d’enzymes qui génèrent des surplombs de 5'TA, ainsi qu’une enzyme incompatible telle que BglII qui se clive en aval du LTR viral en amont. Coupez 10 microgrammes d’ADN génomique dans un volume final de 100 microlitres. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Assurez-vous que l’ADN final est nettoyé à l’aide du kit de purification PCR. L’agent de liaison à utiliser avec l’ADN soniqué doit contenir un surplomb T 3' compatible, tandis que l’agent de liaison pour l’ADN digéré par MseI doit contenir un surplomb 5'TA compatible. Commencez par recuire 10 micromolaires des brins courts et longs dans 35 microlitres de tampon EDTA Tris-HCL en chauffant à 90 degrés Celsius et en refroidissant lentement à température ambiante par pas d’un degré Celsius par minute.

Ensuite, préparez au moins quatre réactions de ligature parallèles par échantillon d’ADN génomique contenant 1,5 linker ligaturé micromolaire, un microgramme d’ADN fragmenté et 800 unités d’ADN ligase T4 dans un volume final de 50 microlitres. Ligate toute la nuit à 12 degrés Celsius. Pour les échantillons préparés par sonication, digérer la réaction de ligature purifiée avec une enzyme de restriction qui clive en aval du LTR en amont.

Utilisez 100 unités de l’enzyme appropriée dans les conditions recommandées par le fabricant pendant la nuit. Assurez-vous que les produits finaux sont purifiés à l’aide d’un kit de purification PCR. Préparez les premières PCR à l’aide des réactifs présentés ici.

Exécutez le premier tour de PCR en utilisant les paramètres suivants : 94 degrés Celsius pendant deux minutes, suivi de 30 cycles de 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, 55 degrés Celsius pendant 30 secondes, 68 degrés Celsius pendant 45 secondes. Terminez à 68 degrés Celsius pendant 10 minutes. Regroupez les premières réactions et purifiez l’ADN comme précédemment.

Préparez ensuite les PCR de deuxième série contenant les réactifs présentés ici. Utilisez les mêmes paramètres de cyclage que pour la PCR du premier tour. Après avoir regroupé et purifié l’ADN de la réaction du second tour, effectuez le contrôle de la qualité et le séquençage de nouvelle génération, et analysez les sites d’intégration à l’aide des instructions détaillées de la partie écrite du protocole.

Les sites d’intégration des banques préparées par digestion avec des enzymes de restriction, comme indiqué à gauche, ou par sonication, comme indiqué à droite, ont été alignés à l’aide d’un logiciel de logo Web. Chaque dilution de la série de titrage est représentée, de l’ADN pur en haut de la figure à la dilution maximale de un à 15 625 en bas. Le degré de certitude diminue avec la dilution croissante de l’ADN cellulaire infecté.

Cette image montre le logo de la séquence pour le contrôle aléatoire apparié de 50 000 sites génomiques uniques. Notez que les sites aléatoires alignés à partir de l’ensemble de données MRC, en revanche, n’ont pas réussi à générer des niveaux appréciables de préférences de base. Une fois maîtrisées, les banques de sites d’intégration peuvent être préparées à partir de l’ADN génomique en trois jours.

La cartographie des sites d’intégration, de l’infection initiale à la bio-informatique complète, peut donc être réalisée en deux semaines environ. À la suite de cette procédure, des milliers, voire des millions de sites d’intégration rétrovirale uniques peuvent être catalogués, et diverses analyses peuvent être effectuées pour quantifier les associations entre les sites d’insertion et les annotations génomiques.