Name: Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Apprenez à isoler des neutrophiles purifiés à partir de sang humain par centrifugation sur gradient de densité pour étudier leur rôle dans la sensibilité des cellules lymphomateuses aux traitements anticancéreux.

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Ce travail a été soutenu par l’Institut National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

1. neutrophiles isolement et co-culture avec des cellules leucémiques primaires NOTE: Les procédures ont été menées sous l&#39;approbation du comité d&#39;éthique de l&#39;Hôpital Lyon avec tous les patients signent un consentement éclairé. <ol><li> Isolement des cellules leucémiques primaires et neutrophiles <ol><li> Collecter des tubes de sang périphérique sur EDTA (1,8 mg EDTA par millilitre de sang) provenant de patients diagnostiqués avec la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). </li><li> Ajouter chaque 15 ml de sang dans un tube stérile de 50 ml et on dilue avec 15 ml de RPMI (dilution 1: 1), puis avec précaution et ajouter lentement 15 ml d&#39;une solution à gradient de densité au fond du tube, sans mélanger les phases. Faire en sorte que la solution à gradient de densité à température ambiante pendant la préparation. </li><li> Centrifuger à 300 xg pendant 35 min à température ambiante et sans frein. Le sang doit se séparer en quatre étapes distinctes comme représenté sur la figure 1A, de haut en bas: des plaquettes et du plasma, des cellules mononucléaires (white ring), solution de gradient de densité, granulocytes et érythrocytes. </li><li> Collecter l&#39;anneau blanc qui représente les cellules leucémiques primaires avec une pipette en plastique de Pasteur et le transfert à un nouveau tube de 50 ml. <ol><li> Remplir le tube avec du PBS (contenant du calcium et de magnésium) à 50 ml au total et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot avec 5 ml de PBS, puis ajouter du PBS à 50 ml au total et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot avec du milieu RPMI complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 2 mM de glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine) pour compter en utilisant la viabilité cellulaire compteur. </li></ol></li><li> Aspirer les phases supérieures laissant le granulocytes et érythrocytes phase et ajouter PBS jusqu&#39;à 25 ml puis ajouter 3% dextran dans 0,9% NaClup à 50 ml au total. Mélanger les tubes 10 fois et les garder pendant 30 min à température ambiante sans mélange. </li><li> Collecter la partie supérieure RBC-couche pauvre de neutrophiles uneD les placer dans un tube de ml stérile 50 propre et centrifuger les tubes à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Remettre en suspension chaque culot avec 5 ml de PBS, puis ajouter un tampon de lyse des globules rouges à 50 ml au total. </li><li> Gardez les tubes dans l&#39;obscurité pendant 15 min à température ambiante puis centrifuger à 500 g pendant 10 min à température ambiante. Laver les pastilles avec du PBS (PBS ajouter jusqu&#39;à 50 ml au total) puis centrifuger à 500 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Resuspendre les pastilles avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre. Conserver 3 x 10 5 de chaque type de cellule dans 50 ul de PBS-FBS (4%) dans des tubes de 5 ml en matière plastique pour déterminer la pureté de leur isolement par cytométrie de flux. </li></ol></li><li> Analyser les apparences morphologiques des populations de cellules isolées <ol><li> Pour ce faire, resuspendre chaque 3 x 10 4 neutrophiles et 3 x 10 4 cellules mononucléaires dans 150 pi de milieu RPMI complet. Assembler les lames de verre, les cartes de filtrage et de chambres d&#39;échantillons dans la centrifugeuse Cytospin, assurant que til centrifuger est bien équilibrée. </li><li> Placer chaque type de cellule dans la chambre d&#39;échantillon et cyto-centrifugation à 750 g pendant 10 min à température ambiante Retirer les lames, les cartes de filtrage et de chambres d&#39;échantillons de la centrifugeuse. Démonter avec soin, afin de ne pas endommager les cellules sur la lame. Jeter les cartes de filtre et chambres d&#39;échantillon. </li><li> Colorer les cellules en utilisant le kit de coloration Giemsa et de garder les lames pendant 1 heure à sécher. Examiner les cellules au microscope avec un grossissement de 100X. </li></ol></li><li> Testez la pureté des cellules isolées par FACS <ol><li> Etiqueter les cellules leucémiques primaires isolées avec un anticorps anti-CD19 humain conjugué à APC (5 pi / 10 6 cellules). Etiqueter les neutrophiles purifiés avec un mélange d&#39;anticorps anti-humains énumérés dans le tableau 1 (5 pi / 10 6 cellules). Incuber les cellules dans le noir pendant 30 min à 4 ° C </li><li> Laver les cellules avec 500 ul de PBS-FBS (4%) de la centrifugeuse les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li>Remettre en suspension chaque culot dans 200 pl de PBS-FBS (4%). </li><li> Analyser un cytomètre de flux en utilisant la configuration optique suivante: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Veiller à la compensation de couleur. </li></ol></li><li> Coculture de cellules leucémiques primaires avec autologue neutrophiles <ol><li> Semences 2 x 10 5 cellules / ml de cellules leucémiques primaires seuls ou avec des neutrophiles autologues à 1:10 dans du milieu RPMI complet. Pour ce faire, d&#39; ajuster le nombre de cellules par dilution de suspensions cellulaires et ajouter 2 x 10 5 cellules / ml de cellules leucémiques primaires à 2 x 10 6 cellules / ml neutrophiles. Mélanger soigneusement. </li><li> Ajouter 25 pM de tyrosine-kinase (Btk) l&#39;inhibiteur de Bruton (Ibrutinib) aux cellules. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Cellule de récolte et d&#39; analyse FACS <ol><li> Collect les cellules dans des tubes en plastique de 5 ml pour l&#39;analyse FACS et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Laver les pellets avec 1 ml de PBS-FBS (4%) puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> pellets Resuspendre dans Annexin V et PI en utilisant le kit commercial et incuber les cellules dans le noir pendant 10 min à température ambiante. Analyser sur un cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 2A et la configuration optique suivant: laser 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Veiller à la compensation de couleur. </li></ol></li></ol> 2. Différenciation des cellules HL60 le long de la granulocytaire Pathway et leur coculture avec des cellules RL lymphome B dans le modèle 3D <ol><li> Différenciation des promyélocytaire humaine (HL60) cellules en cellules neutrophiles-like <ol><li> Ajuster le nombre de cellules HL60 à 3 x 10 5 cellules / ml , puis ajouter 1 uM d&#39; acide rétinoïque (RA) et 1,25% de DMSO pour induire leur différenciation. Seed chaque 3 x 10 5 </sup&gt; cellules HL60 par puits dans une plaque de 48 puits incuber ensuite pendant 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Ensuite, recueillir les cellules et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre. </li><li> Diluer la suspension cellulaire dans un milieu RPMI complet pour ajuster le nombre de cellules HL60 à 3 x 10 5 cellules / ml et induire leur différenciation à nouveau par addition de 1 uM d&#39; acide rétinoïque (RA) et 1,25% de DMSO. Seed chaque 3 x 10 5 HL60 cellules par puits dans une plaque de 48 puits et incuber pendant encore 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Analyse de la différenciation des HL60 (HL60 diff) <ol><li> Recueillir les cellules et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Reprendre le culot avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre. </li><li> Pour analyser les variations des marqueurs de surface cellulaire d&#39;expression par cytométrie de flux. Placez chaque 3 x 10 5 </sup&gt; cellules non différenciées HL60 ( à partir de la culture cellulaire) et 3 x 10 5 cellules HL60 diff dans des tubes en plastique de 5 ml pour l&#39; analyse FACS et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les culots dans 50 ul de PBS-FBS (4%). Etiqueter les cellules avec CD11b anti-humain conjugué à AF700 ou CD38 anti-humain conjugué à APC (5 pi / 10 6 cellules). Incuber les cellules dans le noir pendant 30 min à 4 ° C </li><li> Laver avec 500 pi de PBS-FBS (4%) puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension les granulés dans 200 ul de PBS-FBS (4%). </li><li> Analyser le cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 3A et la configuration optique suivant: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP). </li><li> Pour tester les changements morphologiques dans HL60 diff, immobiliser les cellules sur des lames de verre pour l&#39; examen microscopique. <ol><li> Pour ce faire, resuspendre chaque 3 x 10 <sup&gt; 4 cellules non différenciées HL60 ( à partir de la culture cellulaire) et 3 x 10 4 HL60 diff dans 150 ul de milieu RPMI complet. Assembler les lames de verre, les cartes de filtrage et de chambres d&#39;échantillons dans la centrifugeuse Cytospin, en veillant à ce que la centrifugeuse est équilibrée. </li><li> Placer chaque type de cellule dans la chambre d&#39;échantillon et cyto-centrifugation à 1500 tpm pendant 10 min à température ambiante. Retirez les diapositives, cartes de filtre et chambres d&#39;échantillons de la centrifugeuse. Démonter avec soin, afin de ne pas endommager les cellules sur la lame. Jeter les cartes de filtre et chambres d&#39;échantillon. </li><li> Colorer les cellules en utilisant le kit de coloration Giemsa et de garder les lames pendant 1 heure à sécher. Examiner les cellules au microscope avec un grossissement de 100X. </li></ol></li></ol></li><li> 3 dimensions (3D) Culture REMARQUE: Veiller à ce que les matériaux utilisés dans cette expérience sont froids et l&#39;expérience se déroule sur la glace. <ol><li> Resuspendre chaque 5 x 10 4 cellules RL, que ce soit seul ou mélangé avec HL60 diff </em&gt; Au rapport RL: HL60 diff 01h10, avec 300 ul matrice de membrane basale en utilisant 1 ml pointe de pipette coupé avec des ciseaux stériles afin d&#39;élargir l&#39;ouverture à environ 2 à 3 mm. Éviter les bulles lors de cette étape. </li><li> Graine chaque 300 pi de suspension de cellules / puits dans une plaque de 24 puits. Éviter les bulles lors de cette étape. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 ° C avec 5% de CO 2 , puis ajouter 1 ml de milieu RPMI à chaque puits et laisser incuber pendant 7 jours à 37 ° C avec 5% de CO 2. Changer le milieu tous les deux jours. Ajouter 10 nM vincristine au jour 5. </li></ol></li><li> Analyse FACS <ol><li> Après 7 jours de culture, aspirer le milieu et laver chaque puits avec 1 ml PBS glacé deux fois. Ajouter 3 ml / puits de PBS glacé-EDTA (5 mM). Détacher le gel à partir du fond du puits par grattage en utilisant la partie inférieure de la pointe de pipette de 200 pi. Agiter doucement la plaque sur la glace pendant 30 min. </li><li> Transfert suspension cellulaire dans le tube de 15 ml stérile et agiter les tubes doucement sur ice pendant encore 30 min. Vérifiez l&#39;apparence de la suspension cellulaire homogène. (Si ce n&#39;est pas le cas, alors secouer les cellules pour plus de temps ou ajouter plus de PBS-EDTA). </li><li> Centrifuger les tubes à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Laver les pastilles avec PBS puis centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension avec du PBS-FBS (4%) et l&#39; étiquette avec l&#39; anticorps CD19 anti-humain conjugué à la PE-Cy7 , et un anticorps anti-CD38 humain conjugué à APC (5 pl / 10 6 cellules). Incuber dans l&#39; obscurité pendant 30 min à 4 ° C </li><li> Laver avec 500 pi de PBS-FBS (4%), puis Tubes centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules avec Annexin V et PI en utilisant un kit commercial. </li><li> Analyser le cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 4A et la configuration optique suivant: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Veiller à la compensation de couleur. </li></ol></li&gt; </ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Décrite ici, un protocole efficace, simple, rapide et peu coûteux pour l&#39;isolement des neutrophiles du sang humain avec une grande pureté en utilisant un gradient de densité approche de centrifugation et dans les mêmes cellules étape mononucléaires sont également séparés et valorisés. Les populations de cellules isolées sont ≥90% pur. Plusieurs méthodes sont disponibles pour l&#39;isolement des cellules neutrophiles du sang humain. Ceux - ci comprennent des procédés similaires en utilisa...

Les cellules immunitaires innées constituent une partie essentielle des cellules dans le microenvironnement de la tumeur et ont été associés à une tumeur maligne chez les patients et les modèles animaux de cancer 1. Récemment, il est devenu plus largement apprécié que les réponses immunitaires chroniques jouent un rôle crucial dans la promotion de la progression tumorale, les métastases et la résistance aux chimiothérapies 2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées importantes qui ont été montrés pour réguler directement la réponse des cellules tumorales à la chimiothérapie 3,4. Cependant, le rôle des neutrophiles, des acteurs clés dans le système immunitaire inné, dans la régulation de la réponse tumorale au traitement anti-cancéreux est inconnue. Les objectifs de ces protocoles sont d&#39;utiliser une méthode rapide et crédible pour séparer les neutrophiles provenant des échantillons de sang CLL du patient et de différencier les cellules HL60 le long de la voie granulocytaire afin d&#39;étudier leur rôle dans la régulation de la sensibilité des cellules de lymphome à des agents anti-lymphome. 5 et agir comme une première ligne de défense contre les micro - organismes envahisseurs 6. Les neutrophiles ont un rôle essentiel dans la hausse des réponses immunitaires innées efficaces en plus de fonctions effectrices variables dans plusieurs états pathologiques 7. Par conséquent, un procédé rapide et fiable pour isoler neutrophiles à partir d&#39; autres cellules sanguines, telles que la méthode de séparation par gradient de densité, est nécessaire pour des études in vitro. L&#39; utilisation de cette méthode pour l&#39; isolement des cellules neutrophiles facilitera de nouvelles recherches sur les fonctions immunologiques à médiation par les neutrophiles in vivo et ex vivo. La capacité d&#39;obtenir des populations pures de neutrophiles est une première étape importante pour l&#39;étude des patients atteints de maladies immunologiques 8. Densité procédé de séparation par gradient est une technique idéale dans laquelle un rendement élevé de cellules est obtenue. La méthod comprend l&#39;ajout d&#39;une solution à gradient de densité dans le fond d&#39;un tube contenant du sang humain dilué suivi par une centrifugation à 300 g pendant 35 min sans pause. L&#39;anneau des cellules mononucléaires apparaît à l&#39;interface et les neutrophiles réside en dessous de la première. Cette méthode possède des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes disponibles tels que des kits d&#39;isolement neutrophiles qui sont beaucoup plus chers 9. En outre, l&#39;isolement des neutrophiles du sang humain par des kits commerciaux utilisant des anticorps dirigés contre un marqueur de surface spécifique pour les neutrophiles humains, augmentent le risque d&#39;une activation ou la différenciation cellulaire. Densité procédé de séparation par gradient permet l&#39;isolement des neutrophiles dans un court laps de temps. Dans le même temps, les cellules mononucléaires sont également séparés et récupérés. C&#39;est une technique fondamentale dans laquelle un rendement élevé de cellules pur est obtenu afin d&#39;obtenir l&#39;intégrité fonctionnelle. Afin d&#39;imiter le microenv tumoralironnement, des expériences 3D ont été réalisées. Compte tenu de la courte demi-vie des neutrophiles in vitro, les expériences en 3D avec des neutrophiles humains fraîches ne sont pas concluants. Pour cette raison, promyélocytaire (HL60), les cellules sont amenées à se différencier en cellules neutrophiles-like en utilisant les inducteurs de différenciation diméthylsulfoxyde (DMSO) et de l&#39;acide rétinoïque (RA). En utilisant des cellules HL60 différenciées (HL60 diff) permettra d&#39; éviter d&#39; avoir des réponses différentes de neutrophiles en raison de l&#39; isolement de différents donateurs. En 3D vitro des modèles de culture représentent une étape intermédiaire entre les modèles 2D in vitro et dans des modèles in vivo. Dans la culture 2D, les cellules réparties sur une surface plastique formant des pièces jointes de cellules anormales aux protéines déposées qui sont dénaturées sur cette surface synthétique. A l&#39;inverse, les cellules en forme de culture 3D cellule-cellule naturelle jointes depuis les cellules et la matrice extracellulaire sont elles synthétisent le matériau naturel auquel ils sont attachés.Pour cette raison, les modèles de co-culture en 3D, en particulier entre les cellules cancéreuses et d&#39;autres types de cellules, ont été très utiles pour indiquer leur contribution à la croissance tumorale, l&#39;angiogenèse et les métastases. Par conséquent, les cultures 3D rendent la culture cellulaire miment les conditions physiologiques qui existent in vivo 10.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp ;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de veau (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (le PBS contient du calcium et du magnésium)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-acétyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)</td><td>Life technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine (Pen Strep)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la tyrosine kinase (Btk) de Bruton (Ibrutinib)&nbsp ;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Vincristine&nbsp ;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel matrice de membrane basale&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Mettre à 4 oC pendant la nuit (O/N) avant le jour de l’expérience</td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration Annexing V-FLOUS&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp ; 988&nbsp ; 549&nbsp ; 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit RAL 555 Kit de coloration Giemsa modifié</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Cytométrie en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Leica DMR-XA</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellomètre Auto T4 Compteur de viabilité cellulaire</td><td>Nexcelom&nbsp ; Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neutrophiles isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

<classe p = 'jove_content'> Les neutrophiles sont le type de globules blancs le plus abondant (40 % à 75 %) et parmi les premières cellules inflammatoires à migrer vers le site de l’inflammation. Ils sont des acteurs clés du système immunitaire inné et jouent un rôle majeur dans la biologie du cancer. Les neutrophiles ont été proposés comme médiateurs clés de la transformation maligne, de la progression tumorale, de l’angiogenèse et de la modulation de l’immunité antitumorale ; par leur libération de facteurs solubles ou leur interaction avec les cellules tumorales. Pour caractériser les fonctions spécifiques des neutrophiles, une méthode rapide et fiable est convoitée pour l’isolement in vitro des neutrophiles à partir du sang humain. Ici, une méthode de séparation par gradient de densité est démontrée pour isoler les neutrophiles ainsi que les cellules mononucléées du sang. La procédure consiste à superposer soigneusement la solution à gradient de densité telle que Ficoll au-dessus du sang dilué obtenu chez des patients diagnostiqués avec une leucémie lymphoïde chronique (LLC), suivie d’une centrifugation, d’un isolement de la couche mononucléaire, d’une séparation des neutrophiles des globules rouges par le dextran, puis de la lyse des érythrocytes résiduels. Il a été démontré que cette méthode isole les neutrophiles ≥ 90 % de pureté. Pour imiter le microenvironnement tumoral, des expériences tridimensionnelles (3D) ont été réalisées à l’aide d’une matrice de membrane basale telle que Matrigel. Étant donné la courte demi-vie des neutrophiles in vitro, il n’est pas possible de réaliser des expériences 3D avec des neutrophiles humains frais. Pour cette raison, les cellules promyélocytaires HL60 sont différenciées le long de la voie granulocytaire à l’aide des inducteurs de différenciation diméthylsulfoxyde (DMSO) et acide rétinoïque (RA). Le but de nos expériences est d’étudier le rôle des neutrophiles sur la sensibilité des cellules de lymphome aux agents anti-lymphomes. Cependant, ces méthodes peuvent être généralisées pour étudier les interactions des neutrophiles ou des cellules de type neutrophile avec un large éventail de types de cellules dans différentes situations.

Densité procédé de séparation par gradient décrite ici fournit des cellules leucémiques primaires et des neutrophiles non stimulés isolés à partir du sang des patients atteints de LLC La figure 1A représente les différentes couches de sang obtenus après gradient de densité de centrifugation (de haut en bas. Plaquettes et de plasma, cercle blanc représente les cellules mononucléaires, solution à gradient de densité, les granulocytes et les globules rouges). la Fig...

Les neutrophiles sont le type de globules blancs le plus abondant. L’isolement des neutrophiles du sang humain par la méthode de séparation par gradient de densité et la différenciation des cellules promyélocytaires humaines (HL60) le long de la voie granulocytaire sont décrits ici ; Tester leur rôle sur la sensibilité des cellules du lymphome aux agents anti-lymphomes.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

L'objectif général de ces procédures est d'isoler rapidement des neutrophiles hautement purifiés à partir d'échantillons sanguins humains par centrifugation en gradient de densité afin d'étudier leur rôle dans la sensibilité des cellules lymphomateuses aux traitements anticancéreux, en utilisant des modèles de culture cellulaire en deux D et en trois D. Ces méthodes permettent de répondre à des questions clés concernant les interactions entre le système immunitaire inné et le cancer, comme par exemple quel est le rôle des réponses des cellules tumorales médiées par les neutrophiles dans la thérapie anticancéreuse. Le principal avantage de la séparation en gradient de densité est la possibilité d'isoler des populations cellulaires immunitaires pures en peu de temps, sans exposer les cellules à des stimuli modifiant leur fonction.Pour isoler les cellules leucémiques primaires et les neutrophiles, commencez par ajouter 15 millilitres de sang traité au EDTA provenant d'échantillons de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique dans des tubes stériles individuels de 50 millilitres. Diluez le sang avec 15 millilitres de RPMI. Ensuite, ajoutez soigneusement et lentement 15 millilitres de solution de gradient de densité à température ambiante sous le sang, en prenant soin de ne pas mélanger les couches.Après séparation des cellules par centrifugation, quatre phases distinctes seront visibles : les plaquettes et le plasma en haut, un anneau blanc de cellules mononucléées, la solution de gradient de densité, et les granulocytes et les érythrocytes en bas. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférez d’abord l’anneau blanc de cellules leucémiques primaires dans un nouveau tube de 50 millilitres.Lavez les cellules avec jusqu'à 50 millilitres de PBS contenant du calcium et du magnésium. Et resuspendez le culot dans cinq millilitres de PBS frais. Ensuite, ajoutez encore 45 millilitres de PBS aux cellules, puis centrifugez à nouveau les cellules.Après le deuxième lavage, re-suspendre le culot dans le milieu RPMI complet. Puis compter le nombre de cellules leucémiques primaires viables. Ensuite, éliminer les couches de plasma plaquettaire et de gradient de densité, et ajouter 25 millilitres de PBS et 25 millilitres de dextrine dans du chlorure de sodium à la phase granulocytaire-érythrocytaire.Mélangez les tubes dix fois par retournement. Ensuite, laissez les cellules se déposer pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l'équilibre, transférez la couche supérieure pauvre en globules rouges et riche en neutrophiles dans un tube stérile de 50 millilitres et centrifugez les cellules.Resuspendre le palais dans cinq millilitres de PBS et lyser les globules rouges avec 45 millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Après 15 minutes à l’obscurité à température ambiante, centrifuger à nouveau les cellules et laver le palais dans 50 millilitres de PBS. À la fin du lavage, resuspendre les cellules dans le milieu RPMI complet et dénombrer le nombre de neutrophiles viables.Diluez les deux groupes de cellules à une concentration de 300&nbsp;000 cellules par 50 microlitres de RPMI et répartissez les échantillons dans le nombre approprié de tubes FACS de cinq millilitres. Après centrifugation, remettez en suspension les culots dans 50 microlitres de PBS supplémenté en FBS. Pour déterminer la pureté des sous-ensembles cellulaires isolés, étiquetez l’aliquote de cellules leucémiques primaires avec un anticorps anti-CD19 humain conjugué à l’APC et l’aliquote de neutrophiles purifiés avec un mélange d’anticorps anti-humains, comme indiqué dans le tableau, pendant 30 minutes à l’obscurité à quatre degrés Celsius.À la fin de l'incubation, laver les cellules dans 500 microlitres de PBS supplémenté en FBS et resuspendre les culots dans 200 microlitres de PBS frais avec FBS. Ensuite, analyser la pureté des populations cellulaires par cytométrie en flux, en veillant à effectuer la compensation chromatique des échantillons. Pour co-cultiver les cellules leucémiques primaires avec les neutrophiles autologues, semer 200 000 cellules par millilitre de cellules leucémiques seules ou avec des neutrophiles autologues dans une plaque de 24 puits contenant du milieu RPMI complet.Mélangez soigneusement les cellules. Ensuite, traitez les cellules avec un inhibiteur de la tyrosine kinase de Brutton pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le jour suivant, prélève une aliquote des cellules dans un tube en plastique de cinq millilitres.Ensuite, centrifuger les cellules et laver les culots dans un millilitre de PBS avec FBS. Après la deuxième centrifugation, étiqueter les cellules avec l’anéxine V et l’iodure de propidium selon les instructions du fabricant pendant dix minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Puis, analyser les neutrophiles et les cellules leucémiques primaires par cytométrie en flux en utilisant la stratégie de gating illustrée.Pour mettre en place une co-culture en trois dimensions, ajouter 50 000 cellules B lymphomateuses RL seules ou mélangées à des cellules HL60 différenciées dans des tubes stériles de 15 millilitres. Centrifuger les échantillons et resuspendre les culots dans 300 microlitres de matrice de membrane basale, en utilisant une pointe de pipette de un millimètre dont l'ouverture a été coupée à deux à trois millimètres. Incuber ensuite 300 microlitres des cellules dans chaque puits d'une plaque de 24 puits pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2.À la fin de l'incubation, ajouter un millilitre de milieu RPMI complet dans chaque puits et remettre les cultures en trois dimensions dans l'incubateur pendant sept jours supplémentaires, en changeant le milieu tous les deux jours. Au jour cinq, ajouter dix nanomolaires d'incristine aux cultures. Après une semaine de culture, aspirer le milieu et laver chaque puits deux fois avec un millilitre de PBS glacé.Ensuite, ajoutez trois millilitres de PBS glacé contenant du EDTA dans chaque puits et grattez le fond des puits à l’aide d’une pipette de 200 microlitres pour détacher les gels. Agitez doucement la plaque sur de la glace pendant 30 minutes. Puis, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes stériles individuels de 15 millilitres pour les agiter doucement sur de la glace pendant encore 30 minutes.Vérifiez l'apparition d'une suspension cellulaire homogène. Ensuite, centrifugez les cellules, effectuez un lavage au PBS et resuspendez les culots dans du PBS frais contenant du FBS. Enfin, marquez les cellules avec les anticorps appropriés et les colorants de viabilité comme vient de l'être démontré, puis analysez les cellules différenciées RL et HL60 par cytométrie en flux en utilisant la stratégie de gating illustrée.L'analyse de tous les événements des populations cellulaires isolées par cytométrie en flux montre que cette méthode de séparation donne une population hautement pure de cellules leucémiques primaires exprimant CD19, sous forme d'un pic unique. Et une population de neutrophiles dont la pureté dépasse 90 %, positive pour les antigènes communs des leucocytes CD45, ainsi que pour les antigènes CD15 et CD16 exprimés par les neutrophiles matures. Le positionnement de la fenêtre d'analyse sur les cellules leucémiques primaires issues de cocultures avec des neutrophiles montre que les neutrophiles exercent un effet protecteur sur la survie cellulaire face à l'inhibiteur de la tyrosine kinase ibrutinib, avec un nombre significativement plus élevé de cellules leucémiques primaires viables comparé à la culture de cellules leucémiques primaires seules.Les cellules HL60 différenciées sont plus stables en culture 3D que les neutrophiles. Après l'induction de leur développement granulocytaire, ces cellules sont plus petites que les cellules HL60 non différenciées et expriment des niveaux plus élevés de CD11B et de CD38. Les cellules HL60 différenciées présentent également des noyaux multilobés.Ces cellules exercent un effet protecteur sur les cellules RL, avec un nombre significativement plus élevé de cellules RL viables dans les cocultures en trois D après un traitement par la vincristine, par rapport aux cellules de lymphome traitées à la vincristine et cultivées seules. Une fois maîtrisée, la méthode de centrifugation en gradient de densité peut être réalisée en 90 minutes. Après leur développement, ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour explorer l'impact de divers globules blancs sur la malignité tumorale dans des modèles précliniques et des échantillons de patients.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler rapidement et de façon fiable les cellules mononucléées et les neutrophiles, d'analyser l'effet des neutrophiles sur la modulation des réponses des cellules tumorales aux agents anti-cancéreux, et de mettre en place une co-culture en trois dimensions.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement de neutrophiles cytotoxiques de haute densité et de neutrophiles de basse densité à partir du sang d’une souris porteuse d’une tumeur par centrifugation discontinue par gradient de saccharose.

Isolement de neutrophiles cytotoxiques à partir de sang de souris porteuses de tumeurs

Cette vidéo présente un test étudiant le rôle des cellules de type neutrophile dans la protection des cellules de lymphome contre la cytotoxicité des agents chimiothérapeutiques. Une co-culture 3D, composée de cellules de type lymphome et neutrophiles, est établie et exposée à la vincristine, un médicament de chimiothérapie. Le contact direct avec les cellules de type neutrophile induit une régulation positive des protéines anti-apoptotiques dans les cellules du lymphome, favorisant ainsi leur...

Détermination du rôle des cellules de type neutrophile dans la sensibilité des cellules de lymphome à un médicament testé

Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d'identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d'échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l'identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pronostiques.

D&#39;un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique

Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Le protocole décrit ici représente une méthode simple et reproductible qui utilise la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme des purines sur des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) cultivées dans différentes conditions.

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Ce protocole détaille une méthode pour isoler les neutrophiles du sang total, des manteaux bouffants ou des membranes de leucaphérèse, obtenant un bon rendement, une pureté élevée et une activation cellulaire minimale. Nous utilisons la purification par gradient, la sédimentation des globules rouges (RBC) et la lyse des globules rouges pour obtenir une préparation de neutrophiles de haute qualité / pureté.

Isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys

Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.

Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Ici, nous proposons une approche fiable pour isoler les neutrophiles de densité faible et normale du sang total en utilisant l’isolement magnétique (sélection négative) et le milieu à gradient de densité discontinu. Il garantit l’isolement intact des cellules de haute pureté (≥93 %), facilitant ainsi l’analyse précise en aval des sous-populations de neutrophiles, ce qui est crucial pour comprendre leurs rôles dans la santé et la maladie.

L’isolement et la caractérisation des neutrophiles de basse et de densité normale dans le sang total

Les neutrophiles de basse densité (LDN) augmentent considérablement dans plusieurs maladies. Les LDN sont généralement isolés par tri cellulaire. Nous présentons une méthode pratique pour obtenir de la NDT pure et viable. Après la centrifugation du sang périphérique par gradient de densité, les cellules sont incubées avec des microbilles magnétiques, puis la LDN est séparée par des colonnes magnétiques.

Méthode à microbilles magnétiques rapides pour la purification efficace de neutrophiles de faible densité

Apprenez à isoler des neutrophiles purifiés à partir de sang humain par centrifugation sur gradient de densité pour étudier leur rôle dans la sensibilité des cellules lymphomateuses aux traitements anticancéreux.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

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