Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

L’objectif global de ces procédures est d’isoler rapidement des neutrophiles hautement purifiés à partir d’échantillons de sang humain par centrifugation à gradient de densité afin d’étudier leur rôle dans la sensibilité des cellules du lymphome au traitement du cancer à l’aide de modèles de culture cellulaire à deux D et à trois D. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés sur les interactions entre le système immunitaire inné et le cancer, telles que le rôle que jouent les réponses des cellules tumorales médiées par les neutrophiles dans le traitement du cancer. Le principal avantage de la séparation par gradient de densité est la possibilité d’isoler des populations de cellules immunitaires pures dans un court laps de temps sans exposer les cellules à des stimuli modifiant leur fonction.

Pour isoler les cellules leucémiques primaires et les neutrophiles, commencez par ajouter 15 millilitres de sang traité à l’EDTA provenant d’échantillons de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique dans des tubes individuels stériles de 50 millilitres. Diluez le sang avec 15 millilitres de RPMI. Ensuite, ajoutez soigneusement et lentement 15 millilitres de solution de gradient de densité à température ambiante sous le sang, en prenant soin de ne pas mélanger les couches.

Après séparation des cellules par centrifugation, quatre phases distinctes seront visibles. Les plaquettes et le plasma en haut, un anneau blanc de cellules mononucléées, la solution à gradient de densité et les granulocytes et érythrocytes en bas. À l’aide d’une pipette de pâturage en plastique, transférez d’abord l’anneau blanc des cellules leucémiques primaires dans un tube neuf de 50 millilitres.

Lavez les cellules avec jusqu’à 50 millilitres de PBS avec du calcium et du magnésium. Et suspendez à nouveau le palais dans cinq millilitres de PBS frais. Ensuite, ajoutez 45 millilitres supplémentaires de PBS aux cellules et faites tourner à nouveau les cellules.

Après le deuxième lavage, suspendez à nouveau le palais dans un milieu RPMI complet. Et comptez le nombre de cellules leucémiques primaires viables. Ensuite, retirez les couches de plasma plaquettaire et de gradient de densité, et ajoutez 25 millilitres de PBS et 25 millilitres de dextrine dans du chlorure de sodium à la phase érythrocytaire granulocytaire.

Mélangez les tubes dix fois par inversion. Ensuite, laissez les cellules se déstabiliser pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’équilibre, transférez la couche supérieure de globules rouges pauvres en neutrophiles dans un tube stérile de 50 millilitres et faites tourner les cellules.

Remettez le palais en suspension dans cinq millilitres de PBS et lysez les globules rouges avec 45 millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Après 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante, faites tourner à nouveau les cellules et lavez le palais dans 50 millilitres de PBS. À la fin du lavage, remettez les cellules en suspension dans le milieu RPMI complet et comptez le nombre de neutrophiles viables.

Diluez les deux groupes de cellules à une concentration de 300 000 cellules par 50 microlitres de RPMI et divisez les échantillons entre le nombre approprié de tubes de télécopie de cinq millilitres. Après centrifugation, remettre les granulés en suspension dans 50 microlitres de PBS complété par du FBS. Pour déterminer la pureté des sous-ensembles de cellules isolées, étiquetez l’aliquant des cellules leucémiques primaires avec des anticorps CD19 antihumains conjugués à l’APC et l’aliquant des neutrophiles purifiés avec un mélange d’anticorps antihumains comme indiqué dans le tableau pendant 30 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laver les cellules dans 500 microlitres de PBS complété par FBS et remettre les palais en suspension dans 200 microlitres de PBS FBS frais. Ensuite, analysez la pureté des populations cellulaires par cytométrie en flux, en prenant soin de compenser la couleur des échantillons. Pour co-cultiver les cellules leucémiques primaires avec les neutrophiles autologistes, voir 200 000 cellules par millilitre de cellules leucémiques seules ou avec des neutrophiles autologistes dans une plaque à 24 puits dans un milieu RPMI complet.

Mélangez soigneusement les cellules. Traitez ensuite les cellules avec l’inhibiteur de tyrosine kinase de Brutton pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le lendemain, prélevez un aliquant des cellules dans un tube de télécopie en plastique de cinq millilitres.

Ensuite, faites tourner les cellules et lavez les granulés dans un millilitre de FBS PBS. Après la deuxième centrifugation, étiquetez les cellules aninexine cinq et l’iodure de propidium selon les instructions du fabricant pendant dix minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, analysez les neutrophiles et les cellules leucémiques primaires par cytométrie en flux à l’aide de la stratégie de déclenchement illustrée.

Pour mettre en place une co-culture à trois D, ajoutez 50 000 cellules B de lymphome RL seules ou mélangez-les avec des cellules différenciées HL60 dans des tubes stériles de 15 millilitres. Faites tourner les échantillons et remettez les granulés en suspension dans 300 microlitres de matrice de membrane basale, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millimètre dont l’ouverture est coupée à deux ou trois millimètres. Ensuite, incubez 300 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de 24 puits pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

À la fin de l’incubation, ajoutez un millilitre de milieu RPMI complet dans chaque puits et retournez les cultures 3D dans l’incubateur pendant sept jours supplémentaires, avec des changements de milieu tous les deux jours. Le cinquième jour, ajoutez dix nanomolaires d’incristine aux cultures. Après une semaine de culture, aspirez le milieu et lavez bien chacun deux fois avec un millilitre de PBS glacé.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de PBS glacé avec de l’EDTA dans chaque puits et raclez le fond des puits avec une pointe de pipette de 200 microlitres pour détacher les gels. Agitez doucement l’assiette sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes stériles individuels de 15 millilitres pour les agiter doucement sur de la glace pendant 30 minutes supplémentaires.

Confirmer l’apparition d’une suspension cellulaire homogène. Ensuite, faites tourner les cellules puis effectuez un lavage PBS et remettez les granulés en suspension dans du PBS frais avec FBS. Enfin, marquez les cellules avec les anticorps et les colorants de viabilité appropriés comme nous venons de le démontrer et analysez les cellules différenciées RL et HL60 par cytométrie en flux en utilisant la stratégie de déclenchement illustrée.

L’analyse de tous les événements des populations cellulaires isolées par cytométrie en flux démontre que cette méthode de séparation aboutit à un pic unique CD19 très pur exprimant une population de cellules leucémiques primaires. Et plus de 90 % de la population de neutrophiles purs est positive pour les antigènes communs des leucocytes CD45 et les antigènes CD15 et CD16 exprimés par les neutrophiles matures. L’effet sur les cellules leucémiques primaires des co-cultures de neutrophiles démontre que les neutrophiles exercent un effet protecteur sur la survie cellulaire contre l’inhibiteur de la tyrosine ibrutinib avec un nombre significativement plus élevé de cellules leucémiques primaires viables par rapport à la culture de cellules leucémiques primaires seules.

Les cellules HL60 différenciées sont plus stables dans les cultures trois D que les neutrophiles. Après l’induction de leur développement granulocytaire, ces cellules sont plus petites que les cellules HL60 indifférenciées et expriment des niveaux plus élevés de CD11B et CD38. Les cellules HL60 différenciées présentent également des noyaux multilobés.

Ces cellules présentent un effet protecteur sur les cellules RL avec un nombre significativement plus élevé de cellules RL viables dans trois co-cultures D après un traitement à la vincrostine par rapport aux cellules de lymphome traitées à la vincrostine cultivées seules. Une fois maîtrisée, la méthode de centrifugation par gradient de densité peut être réalisée en 90 minutes. Après leur développement, ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour explorer l’impact de divers globules blancs sur la malignité tumorale dans des modèles précliniques et des échantillons de patients.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler rapidement et de manière fiable les cellules mononucléées et les neutrophiles, d’analyser l’effet des neutrophiles sur la médiation des réponses des cellules tumorales aux agents anticancéreux et de mettre en place une co-culture trois D.