Name: Récolte sélective de Marginating-pulmonaires Leucocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez la récolte sélective des leucocytes marginants-pulmonaires chez le rat et la souris par perfusion forcée. Cette méthode permet d'étudier les fonctions immunologiques uniques de ces cellules adhérant aux capillaires pulmonaires.

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Les auteurs et ces travaux ont été soutenus par le NIH / NCI subvention # R01CA172138 (à SBE).

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) à l&#39;Université de Tel-Aviv. 1. Protocole Rat <ol><li> Les préparatifs <ol><li> Disposer 2 papillon 21 G aiguilles. Eventuellement, préparer 2 contondants tranchant papillon 21 G aiguilles en déposant le tranchant de l&#39;aiguille. </li><li> Stériliser outils chirurgicaux: 2 paires de ciseaux, une pince émoussée tranchant, hémostatique, pinces à dents tissus stérilisés par autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec). </li><li> Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) par addition de 30 unités d&#39;héparine par ml de tampon phosphate salin (1 x PBS). Utilisez à la température ambiante. 35 ml est le volume minimal nécessaire par animal. </li><li> PBS héparinisé flux dans les conduites de la pompe péristaltique et les aiguilles de papillon pour éviter les bulles d&#39;air. </li></ol></li><li> Perfusion des Poumons et Collection de MP-leucocytes <ol><li> Euthanasier l&#39;animal par une surdose de 8% isoflurane. Confirmer l&#39;euthanasie par la respiration de surveillance cessation. </li><li> Lors de la cessation de la respiration, ouvrir immédiatement les cavités péritonéale et à la poitrine à l&#39;aide des ciseaux stériles et des pinces à dents tissus. Effectuer une incision abdominale médiane le long de l&#39;abdomen jusqu&#39;à la pointe du sternum. </li><li> Soulevez le sternum à l&#39;aide de la pince, coupe prudemment la cage thoracique des deux côtés, sans perforer un organe interne ou les gros vaisseaux sanguins. Fixer un hémostatique sur le sternum, et rostrale fois la cage thoracique afin d&#39;exposer le complexe cardiorespiratoire. </li><li> Insérez une aiguille papillon dans le ventricule droit du cœur, et dans environ une minute recueillir le volume maximal de sang dans une seringue (~ 6 ml de 250 g animal). </li><li> Fixer la veine cave avec un hémostatique pour éviter perfusion arrière du foie (voir Discussion). </li><li> Tenez l&#39;aiguille de papillon dans le ventricule droit en remplaçant la seringue contenant le sang avec le tuyau d&#39;écoulement de la ppompe eristaltic. </li><li> Insérer une deuxième aiguille papillon relié à une seringue de 5 ml de récolte dans le ventricule gauche, ce qui évite la pénétration du septum interventriculaire. </li><li> Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d&#39;environ 5 ml / min et de recueillir doucement dans la seringue les premiers millilitres de perfusat qui sont contaminés par du sang. Continuez jusqu&#39;à ce que la couleur perfusat vire du noir au rouge pâle. (Jeter la perfuste de sang contaminé). </li><li> Sans arrêt de la pompe péristaltique, à remplacer rapidement la seringue de 5 ml de récolte avec une seringue 20 ml de récolte et de recueillir 20 ml de liquide de perfusion pulmonaire en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu&#39;à 7 ml / min). surveiller en continu le flux de perfusat dans la seringue de collecte, tout en évitant la formation de vide. </li><li> Cesser l&#39;écoulement de la pompe péristaltique. </li></ol></li><li> leucocytes Extraction <ol><li> Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g. </li><li> Aspirer le liquide. </li><li>Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide. Répéter deux fois cette étape. L&#39;utilisation de PBS ou de milieu dépend de l&#39;utilisation conséquente de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 20 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide. </li><li> Reconstituer les cellules à la concentration voulue, en fonction de l&#39;utilisation de l&#39; échantillon ( par FACS, la PCR, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Protocole de souris <ol><li> Les préparatifs <ol><li> Disposer 2 papillon 25 G aiguilles. Eventuellement, préparer 2 contondants tranchant papillon 25 G aiguilles en déposant le tranchant de l&#39;aiguille. </li><li> Stériliser outils chirurgicaux: 2 paires de ciseaux, une pince émoussée tranchant, hémostatique, pinces à dents tissus stérilisés par autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec). </li><li> Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) par addition de 30 unités d&#39;héparine par ml de solution PBS 1x. Utilisez à la température ambiante. 25 ml est le volume minimal nécessaire par animal. </li><li> Stream PBS héparinisé dans les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles de papillon pour éviter les bulles d&#39;air. </li></ol></li><li> Perfusion des Poumons et Collection de MP-leucocytes <ol><li> Euthanasier l&#39;animal par une surdose de 8% isoflurane. Confirmer l&#39;euthanasie par la respiration de surveillance cessation. </li><li> Lors de la cessation de la respiration, ouvrir immédiatement les cavités péritonéale et à la poitrine à l&#39;aide des ciseaux stériles et des pinces à dents tissus. Effectuer une incision abdominale médiane le long de l&#39;abdomen jusqu&#39;à la pointe du sternum. </li><li> Soulevez le sternum à l&#39;aide de la pince, coupe prudemment la cage thoracique des deux côtés, sans perforer un organe interne ou les gros vaisseaux sanguins. Fixer un hémostatique sur le sternum, et rostrale fois la cage thoracique afin d&#39;exposer le complexe cardiorespiratoire. </li><li> Fixer la veine cave avec un hémostatique pour éviter perfusion arrière du foie (voir Discussion). </li><li> Insérez une aiguille papillon reliée à la conduite d&#39;évacuation de la pompe péristaltique dans le droit êmetricle du coeur, et une deuxième aiguille papillon relié à une seringue de 2 ml de récolte dans le ventricule gauche du cœur, avoidingpenetration du septum interventriculaire. </li><li> Mettez la pompe à une vitesse d&#39;environ 2 ml / min et de recueillir les premiers millilitres de perfusat de sang contaminé dans la seringue de récolte jusqu&#39;à ce que le perfusat vire du noir au rouge pâle (Jeter la perfuste de sang contaminé). </li><li> Sans arrêt de la pompe péristaltique, à remplacer rapidement la seringue 2 ml de récolte avec une seringue 10 ml de récolte et de recueillir 10 ml de liquide de perfusion pulmonaire en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu&#39;à 4 ml / min). surveiller en continu le flux de perfusat dans la seringue de collecte, tout en évitant la formation de vide. </li><li> Cesser l&#39;écoulement de la pompe péristaltique. </li></ol></li><li> leucocytes Extraction <ol><li> Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g. </li><li> Aspirer le liquide. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifugeuse à 400g pendant 10 min, et aspirer le fluide. Répétez cette étape trois fois. L&#39;utilisation de PBS ou de milieu dépend de l&#39;utilisation conséquente de l&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS ou moyen, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le liquide. </li><li> Reconstituer les cellules à la concentration voulue, en fonction de l&#39;utilisation de l&#39; échantillon ( par FACS, la PCR, etc.). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

La méthode présentée ici permet la récolte sélective et à l&#39;étude de la population unique de MP-leucocytes. Par rapport à la circulation des leucocytes ou splénique, la population de MP se caractérise par une composition distincte de sous - populations leucocytaires, les niveaux plus élevés d&#39;activation, la libération ultérieure de diverses cytokines et des niveaux plus élevés d&#39; ARNm de cytokines pro- et anti-inflammatoires 2,3. Plus précisément, nous avons montré que les cellules NK-MP sont plus...

Leucocytes adhérant aux capillaires des poumons ( par exemple, marginating-pulmonaire (MP) leucocytes) 1 ont été montrées pour présenter la composition leucocytaire distincte et une activité unique par rapport aux leucocytes d&#39;autres compartiments immunitaires (par exemple, la circulation, de la rate, la moelle osseuse) 2- 4. Par exemple, exposition MP-leucocytes plus tueuses naturelles (cellules NK) cytotoxicité contre les cellules tumorales différentes, par rapport à circulants et spléniques cellules NK, ainsi que l&#39;ARN messager différencié (ARNm) niveaux et augmentation de la sécrétion de cytokines pro- et anti-inflammatoires. La composition des cellules est également différenciée des leucocytes circulants comme MP-leucocytes ont un rapport plus élevé de l&#39;immunité innée / adaptative par rapport aux leucocytes circulants (50% contre 30%, respectivement). L&#39;objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective de MP-leucocytes, afin d&#39;étudier ce compartiment immunitaire important et unique (population cellulaire), et elucIDATE l&#39;impact des diverses manipulations (par exemple, l&#39; activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques. Pour comprendre l&#39;importance de cette population unique, il est important de noter que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles par des fonctions in vivo de l&#39; immunité à médiation cellulaire (CMI). Cette capacité est évidente malgré l&#39;échec précédent du système immunitaire pour contrôler la tumeur primaire, et amplement étayée par des preuves in vivo chez des patients cancéreux et des modèles animaux 5. Surtout, ces résultats sont souvent incompatibles avec in vitro et ex vivo études qui rapportent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par la circulation des leucocytes dans des échantillons de sang chez les humains et les animaux (mesuré par les essais de cytotoxicité) 6,7. Cet écart peut être attribué à l&#39;existence in vivo des populations leucocytaires distincts, tels que mentionnés ci lesusmentionné population leucocytaire MP, et plus particulièrement son sous - population de cellules NK activées 3. En effet, les cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélés être résistants à la circulation et les leucocytes spléniques, se sont révélés être lysées par les cellules NK-MP 3,8. Ainsi, les cellules prétendument «NK» résistantes MADB106 qui produisent des métastases aux poumons de fischer344 (F344), les rats sont contrôlés par des cellules NK-MP, mais pas par circulation ou des cellules NK spléniques qui sont couramment étudiées compte tenu de leur facilité d&#39;accès. MP-leucocytes purifiés actifs et ne sont pas accessibles par les méthodes classiques de récolte de leucocytes dans les poumons, qui sont basés sur un broyage du tissu pulmonaire ou la dégradation biologique 9. Notre approche présente deux avantages majeurs par rapport aux approches de traitement des tissus. Tout d&#39;abord, la méthode de perfusion récolte sélective MP-leucocytes, en les séparant des autres cellules qui proviennent du parenchyme pulmonaire interstitielle et compar broncho-alvéolairetments. En second lieu, la meilleure technique de perfusion préserve l&#39;intégrité et le milieu physiologique de la MP-leucocytes, à la différence du broyage et le traitement biologique des approches qui endommagent les cellules, modifier leur morphologie et induisent la production et la libération de divers facteurs qui modulent l&#39;activité immunitaire et plus particulièrement répriment NK 10 cytotoxicité. Les poumons sont un organe cible majeure pour les métastases du cancer et pour diverses maladies infectieuses. Toutes les cellules cancéreuses circulantes et des cellules infectées passent à travers les capillaires pulmonaires où ils ont besoin de se déformer et d&#39;interagir avec des cellules endothéliales capillaires et les leucocytes résidents. Dans ces conditions, les cellules circulantes peuvent être facilement ciblés par MP-leucocytes résidents. Il semble donc intéressant de disposer biologiquement leucocytes activés dans ce compartiment immunitaire, et il est important d&#39;étudier cette MP-population unique dans différents milieux biologiques, expérimentaux et cliniques. Il est digne de noter que syl&#39; activation stemic immunitaire par divers-réponse modificateurs biologiques (par exemple l&#39; acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou de type C CpG ODN (CpG-C ODN)) ont été montrés pour activer MP-leucocytes plus de leucocytes circulants 3, 8,11.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Pompe</td><td></td><td></td><td></td>péristaltique</tr><tr><td>Aiguille papillon</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>Aiguille papillon</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4"</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Solution Pic 10</td><td></td><td>ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Solution Pic</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Pince à bords arrondis Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hémostatique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus Héparine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodique muqueuse porcine (sans perservatifs)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

récolte sélective de marginating-pulmonaires leucocytes

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

Les leucocytes marginaux-pulmonaires (MP) sont des leucocytes qui adhèrent à l’endothélium interne des capillaires pulmonaires. Il a été démontré que les leucocytes MP présentent une composition et des caractéristiques uniques par rapport aux leucocytes d’autres compartiments immunitaires. Les preuves suggèrent une cytotoxicité plus élevée des cellules tueuses naturelles et un profil pro- et anti-inflammatoire distinct de la population de leucocytes MP par rapport aux immunocytes circulants ou spléniques. La méthode présentée ici permet la récolte sélective de MP-leucocytes par perfusion forcée des poumons chez la souris ou le rat. Contrairement à d’autres méthodes utilisées pour extraire les leucocytes pulmonaires, telles que le broyage des tissus et la dégradation biologique, cette méthode produit exclusivement des leucocytes à partir des capillaires pulmonaires, non contaminés par des cellules parenchymateuses, interstitielles et broncho-alvéolaires. De plus, la technique de perfusion préserve mieux l’intégrité et le milieu physiologique des MP-leucocytes, sans induire de réponses physiologiques dues au traitement tissulaire. Cette population unique de leucocytes MP est stratégiquement située pour identifier et réagir aux cellules circulantes anormales, car toutes les cellules malignes circulantes et les cellules infectées sont détenues lors de leur passage dans les capillaires pulmonaires, interagissant physiquement avec les cellules endothéliales et les leucocytes résidents. Ainsi, la récolte sélective de leucocytes MP et leur étude dans diverses conditions peuvent faire progresser notre compréhension de leur signification biologique et clinique, en particulier en ce qui concerne le contrôle des cellules aberrantes circulantes et des maladies pulmonaires.

L&#39;exposition MP-compartiment une composition leucocyte sous-ensemble différent par rapport aux leucocytes circulants. En utilisant une analyse de cytométrie en flux, les sous-populations leucocytaires ont été identifiés et quantifiés pour caractériser la composition à la fois en circulation et MP leucocytes. Les granulocytes et les lymphocytes ont été identifiés sur la base avant et latérales éparpillements. Dans les lymphocytes, NKRP-1 des cellules lumineuses ont été iden...

Les leucocytes marginaux-pulmonaires présentent des caractéristiques uniques et des fonctions immunologiques distinctes par rapport aux autres populations de leucocytes. Nous décrivons ici le prélèvement sélectif de cette sous-population de leucocytes pulmonaires, par perfusion forcée des poumons chez le rat et la souris. Les leucocytes pulmonaires marginaux semblent essentiels pour déterminer la susceptibilité aux maladies transmissibles par le sang et les maladies pulmonaires.

Récolte sélective de Marginating-pulmonaires Leucocytes

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une perfusion forcée des poumons de souris ou de rat afin de recueillir sélectivement les leucocytes pulmonaires marginaux, qui adhèrent à l'endothélium interne des capillaires pulmonaires. Cette méthode permet l'étude de cette population spécifique de leucocytes, qui présente des caractéristiques uniques et des fonctions hématologiques distinctes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'obtenir des leucocytes provenant exclusivement des capillaires pulmonaires, en excluant les cellules des compartiments parenchymateux, interstitiels et bronchoalvéolaires.Liat Sorski et Lee Shaashua, deux étudiantes diplômantes de mon laboratoire, démontreront cette procédure. Avant de commencer, faire circuler du PBS hépariné à travers les tuyaux de la pompe péristaltique et les aiguilles papillon afin d'éliminer toutes les bulles d'air. Ensuite, immédiatement après l'arrêt de la respiration, utiliser des ciseaux stériles et des pinces à tissus dentées pour ouvrir les cavités péritonéale et thoracique du rat euthanasié en pratiquant une incision abdominale médiane jusqu'au processus xiphoïde.Ensuite, utilisez la pince pour soulever le sternum et couper prudemment la cage thoracique des deux côtés. Placez un clamp hémostatique sur le sternum et repliez la cage thoracique vers la partie rostrale afin d'exposer le complexe cardio-pulmonaire. Insérez ensuite une aiguille papillon dans le ventricule droit du cœur et prélève la quantité maximale de sang possible.Lorsque tout le sang a été prélevé, pincer la veine cave à l’aide d’un hémostat pour éviter une perfusion rétrograde du foie. Ensuite, tout en maintenant l’aiguille papillon dans le ventricule droit, remplacer la seringue de sang par le tube de sortie de la pompe péristaltique et insérer une deuxième aiguille papillon, reliée à une seringue de prélèvement de cinq millilitres, dans le ventricule gauche. Mettre maintenant la pompe péristaltique en marche à une vitesse d’environ cinq millilitres par minute et recueillir délicatement les premiers millilitres de perfusat contaminé dans la seringue de prélèvement jusqu’à ce que le perfusat passe d’une couleur rouge foncé à un rouge pâle.Ensuite, sans arrêter la pompe, remplacez rapidement la seringue de prélèvement de cinq millilitres par une seringue de prélèvement de 20 millilitres et collectez 20 millilitres de perfusat pulmonaire afin d'isoler les leucocytes pulmonaires marginaux du rat à un débit de sept millilitres par minute. Observez la décoloration progressive des poumons, passant d'un rouge pâle à un blanc transparent, signe d'une perfusion réussie. Une fois que tout le volume de perfusat a été collecté, arrêtez l'écoulement de la pompe péristaltique et transférez le perfusat recueilli dans un tube.Ensuite, centrifuger le liquide de perfusion et aspirer le surnageant. Faire circuler du PBS hépariné à travers les tubulures de la pompe péristaltique et les aiguilles papillon afin d'éliminer toutes les bulles d'air. Pour recueillir les leucocytes pulmonaires marginaux de la souris, aussitôt après l'arrêt de la respiration, utiliser des ciseaux stériles et une pince anatomique à dents pour ouvrir les cavités péritonéale et thoracique par une incision médiane de l'abdomen jusqu'au processus xiphoïde.Ensuite, utilisez une pince pour soulever le sternum et couper la cage thoracique des deux côtés. Appliquez une pince hémostatique sur le sternum et rabattez la cage thoracique vers l'avant pour exposer le complexe cardio-pulmonaire. Appliquez une pince hémostatique sur la veine cave afin d'éviter une perfusion rétrograde du foie, puis insérez l'aiguille papillon dans le ventricule droit du cœur.Ensuite, tout en maintenant l'aiguille à papillon dans le ventricule droit, raccorder l'aiguille à papillon au tube de sortie de la pompe péristaltique et insérer une deuxième aiguille à papillon, reliée à une seringue de récolte de deux millilitres, dans le ventricule gauche. Mettre la pompe en marche à une vitesse d'environ deux millilitres par minute. Recueillir délicatement le premier millilitre de perfusat sanguin contaminé dans la seringue de récolte jusqu'à ce que le perfusat passe d'une couleur rouge foncé à un rouge pâle.Ensuite, sans arrêter la pompe péristaltique, remplacez rapidement la seringue de prélèvement de deux millilitres par une seringue de prélèvement de 10 millilitres et collectez 10 millilitres de liquide de perfusion pulmonaire à un débit de perfusion de quatre millilitres par minute. Observez la décoloration progressive des poumons, passant d'un rouge pâle à un blanc transparent, signe d'une perfusion réussie. Une fois tout le liquide de perfusion pulmonaire collecté, arrêtez l'écoulement de la pompe péristaltique et transférez le liquide collecté dans un tube.Ensuite, centrifuger le perfusat et aspirer le surnageant. Le compartiment pulmonaire marginal présente une composition en sous-ensembles de leucocytes différente de celle observée pour les leucocytes circulants. En effet, les cellules immunitaires innées, notamment les granulocytes, les monocytes et les cellules natural killer, représentent plus de 50 % de la population de leucocytes marginaux pulmonaires.Par rapport à moins de 30 % du compartiment des cellules circulantes. En revanche, les populations de cellules T et de cellules dendritiques sont présentes en pourcentages plus faibles dans le compartiment marginaire-pulmonaire par rapport aux cellules circulantes. Un pourcentage trois fois plus élevé de grandes cellules natural killer est présent dans le compartiment marginaire-pulmonaire que dans le compartiment des cellules circulantes, bien que le nombre total de cellules natural killer soit globalement similaire.De plus, la capacité des cellules natural killer du compartiment pulmonaire marginaux à lyser les cellules tumorales est supérieure à celle des cellules natural killer circulantes, mesurée par un test standard de libération de chrome contre au moins deux lignées cellulaires tumorales différentes. En outre, une stimulation immunitaire par administration in vivo de Poly I:C produit un effet plus marqué sur la cytotoxicité des cellules natural killer pulmonaires marginales que sur celle des cellules natural killer circulantes, lorsqu'on utilise des cibles MADB106. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est correctement effectuée.Ces techniques permettent la récolte sélective des leucocytes MP. L'étude de ces leucocytes permettra d'approfondir notre compréhension de leur signification biologique et clinique, notamment en ce qui concerne le contrôle des cellules circulantes anormales et des maladies pulmonaires. Après cette procédure, les cellules peuvent être caractérisées et analysées par cytométrie en flux, PCR ou tout autre test d'intérêt.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de recueillir les leucocytes pulmonaires en cours de margination.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une préparation hautement purifiée de cellules de souris pulmonaires dendritiques est décrite. Un accent particulier est donné à l'isolement de sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles.

L&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.

La récolte macrophages alvéolaires murins et l&#39;évaluation d&#39;activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des leucocytes hépatiques marginants du foie de souris par perfusion forcée.

Isolement de leucocytes hépatiques marginaux à partir du foie d’une souris

Ce protocole décrit une technique d'isolation pour obtenir des cellules mésenchymateuses du stroma de séjour du poumon primaires de rats, par l'utilisation d'une digestion enzymatique, séparation par gradient de densité, l'adhérence plastique et CD146 + sélection de billes magnétiques.

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Les leucocytes marginaux-hépatiques présentent des caractéristiques uniques et des fonctions immunologiques distinctes par rapport aux autres populations de leucocytes. Nous décrivons ici une méthode de récolte sélective de cette population spécifique de cellules hépatiques, par perfusion forcée du foie de rats ou de souris. Les leucocytes hépatiques marginaux semblent essentiels pour déterminer la susceptibilité aux maladies hépatiques et aux métastases.

Récolte sélective de Marginating-hépatiques Leucocytes

Ce protocole décrit la dépose et la purification des cellules endothéliales de l’artère pulmonaire (PAECs) qui respectent les info-bulles des cathéters Swan-Ganz tandis qu’ils sont coincés dans l’artère pulmonaire au cours du cathétérisme cardiaque droit et restent adhérentes à la ballonnet dégonflé après le retrait du corps du patient.

Récolte des cellules endothéliales de l’info-bulles des cathéters Swan-Ganz après cathétérisme cardiaque droit

Nous décrivons une méthode pour traiter le liquide de lavage bronchoalveolar et le sang périphérique assorti des individus chroniquement HIV-infectés sur la thérapie antirétrovirale pour évaluer les réservoirs pulmonaires de HIV. Ces méthodes ont comme conséquence l'acquisition des cellules T cD4 très pures et des macrophages alvéolaires qui peuvent plus tard être employés pour l'immunophénotypage et les quantifications d'ADN/ARN de HIV par réaction en chaîne ultrasensible de polymérase.

Traitement du liquide de lavage bronchoalvéolaire et du sang apparié pour le macrophage alvéolaire et le CD4- Immunophénotypage à cellules T et évaluation du réservoir du VIH

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.

Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

Ce protocole détaille l’isolement de populations immunes et non immunes vivantes du poumon de souris à l’état d’équilibre et après une infection grippale. Il fournit également des stratégies de contrôle pour identifier les sous-ensembles de cellules épithéliales et myéloïdes.

Isolement de populations de cellules myéloïdes et épithéliales vivantes à partir du poumon de souris

Une méthode rapide pour obtenir leucocytes infiltrants du cerveau murin est décrite. Cette méthode utilise un gradient de Percoll continue et gradient de Ficoll discontinu pour sélectionner et purifier la couche leuco-enrichi. Leucocytes isolés peuvent alors être caractérisées par des mesures de cytométrie en flux.

Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes

Découvrez la récolte sélective des leucocytes marginants-pulmonaires chez le rat et la souris par perfusion forcée. Cette méthode permet d'étudier les fonctions immunologiques uniques de ces cellules adhérant aux capillaires pulmonaires.

Récolte sélective de Marginating-pulmonaires Leucocytes

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