Name: Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez l'imagerie des polysomes cérébraux par microscopie à force atomique sans fixation ni marquage. Cette méthode permet d'étudier l'organisation des ribosomes et le contrôle de l'expression génique dans des conditions proches de la physiologie.

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Cette recherche a été soutenue par le projet de recherche AXonomIX financé par la Provincia Autonoma di Trento, Italie.

Les pratiques utilisées pour obtenir les tissus de la souris ont été approuvées par l&#39;Organe pour la protection des animaux (LRRO) de l&#39;Université de Trento (Italie), pas de protocole. 04-2015, décret selon art.31 législatif n. 26/2014. Toutes les souris ont été maintenues à l&#39;installation Modèle Organism du Centre de biologie intégrative (CIBIO), Université de Trento, en Italie. Attention: Pour éviter toute dégradation de l&#39;ARN des échantillons, préparer tous les tampons à l&#39;aide de l&#39;eau traitée par DEPC pour minimiser la contamination RNase. 1. Préparation de polysomes de Brains entiers <ol><li> La collecte de tissus cérébraux (15 min) <ol><li> Euthanasier type sauvage souche de souris C57BL / 6 avec CO 2 asphyxie pendant 5 min 36. Disséquer soigneusement le cerveau hors du crâne 36, placer le tissu dans un tube de 1,5 ml et placer immédiatement dans de l&#39; azote liquide. Conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Préparation de lysat (30 minutes) <ol><li> Pulvériser l&#39;ensemble du tissu cérébral en utilisantun mortier et un pilon sous azote liquide. </li><li> Transfert environ 25 mg de poudre dans un tube à centrifuger froid et immédiatement (pour éviter la décongélation du tissu pulvérisé) ajouter 0,8 ml de tampon de lyse (voir le tableau 1) et de perturber la cellule par pipetage de haut en bas 25 fois rapidement. </li><li> Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 1 min à 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube et maintenir le tube sur la glace pendant 15 min. </li><li> Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les noyaux et les mitochondries. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. </li><li> Stocker le surnageant à -80 ° C pour un maximum de 6 mois ou l&#39;utiliser immédiatement. </li></ol></li><li> préparation du gradient de sucrose et de centrifugation (2 h et 30 min) <ol><li> ultracentrifugation tubes Laver abondamment de l&#39;eau sans RNase (eau traitée de diéthyle (DEPC-eau) ou commerciale) und 3% de H 2 O 2 / H 2 O DEPC solution. </li><li> Placer les tubes dans la glace et ajoute 5,5 ml d&#39; une solution froide de saccharose à 50% au fond de chaque tube (voir le tableau 1 pour les solutions de saccharose). ajouter délicatement le sucrose goutte de solution à 15% en baisse, en restant proche de l&#39;interphase afin de préserver une interphase forte, jusqu&#39;à ce que le tube est complètement rempli. Lorsque le tube est complètement rempli, fermer avec un bouchon en caoutchouc pour éviter la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Dans une chambre froide doucement fixer les tubes horizontalement et le maintenir dans cette position pendant 2 heures. Après ce temps, redresser lentement les tubes dans la position verticale et les mettre sur la glace. Les gradients sont maintenant prêts à être utilisés. Alternativement, préparer le gradient de saccharose 15-50% en utilisant un gradient classique ancien. </li><li> Dans une chambre froide retirer soigneusement 1,0 ml à partir du haut de la pente et de superposer la chute du saccharose à goutte avec le lysat cytosolique (ie, le surnageant obtenu à step 1.2). </li><li> Abaisser avec précaution les tubes dans les seaux de balancement seau rotor. Centrifuger les gradients pour 100 min à 180.000 xg à 4 ° C en utilisant une ultracentrifugeuse. </li><li> Après la centrifugation, laisser les tubes dans leurs seaux pendant 20 min à 4 ° C pour laisser les gradients se stabilisent. </li></ol></li><li> gradient de sucrose de fractionnement (2 h) <ol><li> Retirez délicatement un tube d&#39;ultracentrifugation du rotor d&#39;ultracentrifugation et le monter sur le dispositif de collecteur d&#39;un gradient de densité Système Fractionnement. Prélever 1 ml fractions de surveillance de l&#39;absorbance à 260 nm avec un détecteur UV VIS / (Voir Figure 1 panneau supérieur). Gardez les fractions recueillies sur la glace. </li><li> Préparer des aliquotes de 30-40 ul des fractions d&#39;intérêt, gardez-les sur de la glace avant de les stocker à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. Ne pas utiliser des aliquotes ou des fractions de saccharose qui ont subi plus de deux cycles de congélation-décongélation (voir Figure 1 panneau inférieur). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Préparation d&#39;échantillons pour microscopie à force atomique (3 h) <ol><li> Avec du ruban, retirez les feuilles de mica. </li><li> Laver les feuilles de mica 3-4 fois avec DEPC-eau et le placer dans une petite boîte de Pétri. Puis sécher la surface avec de l&#39;air. </li><li> Couvrir le mica avec 200 ul de 1 mM de NiSO 4 et incuber pendant 3 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer la solution de nickel et ensuite sécher la surface avec de l&#39;air. Effectuer toutes les étapes futures à 4 ° C en plaçant la boîte de Pétri avec le mica sur la glace. </li><li> Décongeler une aliquote obtenue dans de la glace et 1.4.2 ajouter doucement l&#39;ensemble de la goutte d&#39;échantillon à goutte sur le mica. En utilisant une pointe de pi 100-200, étaler l&#39;échantillon sur toute la surface du mica. Incuber l&#39;échantillon sur la glace pendant 3 min. </li><li> Couvrir la chute de la feuille de mica à goutte avec 200 pi de tampon froid-AFM (voir le tableau 1) et incuber pendant 1 heure sur la glace. </li><li> Imagerie en liquide <ol><li> Retirez soigneusement le tampon-AFM et laver les feuilles de mica 3-4 foiss avec 200 pi de tampon froid-AFM pour éliminer l&#39;excès de saccharose. Ensuite , laver les feuilles de mica 3 fois avec la solution de lavage à froid (voir le tableau 1), en laissant la surface de mica recouvert par quelques microlitres de solution. </li><li> Aller au point 3 (acquisition d&#39;images). </li></ol></li><li> Imagerie dans l&#39;air <ol><li> Retirez délicatement le tampon-AFM et laver le mica 3-4 fois avec 200 pi de tampon froid-AFM pour éliminer l&#39;excès de saccharose. Ensuite, laver le mica 3 fois avec la solution de lavage à froid (voir tableau 1) et drainer l&#39;excès d&#39; eau en utilisant du papier. </li><li> Laisser l&#39;échantillon à sécher sous la hotte chimique avec la partie supérieure de la boîte de Petri partiellement ouverte. Après 2 heures, fermez la boîte de Pétri et conserver à la température ambiante. Mesurer l&#39;échantillon après 2-3 heures comme ils sont stables pendant des années. </li></ol></li></ol> 3. Acquisition d&#39;image (15 min par image après stabilisation thermique) Note: polysomes immobilisés sur le mica peuvent être visualisés dans l&#39;air ou dans un liquide, en utilisant le mode AC. <ol><li> Fixer le mica sur le porte-échantillon à l&#39;aide de ruban adhésif double face. </li><li> Insérez le porte-échantillon dans la phase de l&#39;AFM en suivant les instructions du fabricant. Lorsque l&#39;imagerie dans le liquide, si possible, essayer de maintenir l&#39;échantillon à une température inférieure à 25 ° C pour augmenter polysomes stabilité dans le temps. </li><li> Sélectionnez un cantilever approprié pour l&#39;imagerie AC et le monter sur le support de pointe en suivant les instructions du fabricant. Ici, l&#39;utilisation cantilevers avec force constante entre 2-20 N / m pour l&#39;imagerie de l&#39;air et environ 0,1 N / m pour l&#39;imagerie liquide. </li><li> Régler la tache laser sur le cantilever et zéro les signaux de détection de quadrant. </li><li> Sélectionnez une fréquence de conduite opportune et conduire le cantilever avec une amplitude de 10 à 20 nm. </li><li> Approchez l&#39;échantillon jusqu&#39;à ce que la pointe engage la surface. </li><li> Sélectionnez une zone de balayage de 2x2 um, acquérir au moins 512x512 images de pixels (largeur de pixel &lt;4 nm), sélectionner un mode de soustraction de fond en direct et une échelle Z de 20-25 nm. </li><li> Inspecter til l&#39;image à la recherche de la présence d&#39;objets ronds, caractérisé par la hauteur comprise entre 10 et 15 nm lors de l&#39;acquisition dans l&#39;air et 25 et 30 nm lorsqu&#39;elle est sous forme liquide et la largeur dans la plage de 25 à 30 nm. Réglez les paramètres de consigne et de retour jusqu&#39;à ce que les objets tranchants sont visualisés. Le fond doit apparaître relativement plat dans les bons échantillons, avec quelques objets de hauteur 2-4 nm (voir figure 2A et B). </li><li> Si l&#39;image semble bon (comme indiqué au point 3.8), acquérir plusieurs (au moins dix) scans 2x2 microns à des zones d&#39;échantillonnage différentes. </li><li> (optionnel). Si nécessaire, acquérir des images à haute résolution de polysomes sélectionnés (voir figure 2C). </li><li> Appliquer des corrections de logiciels (plan de soustraction et des algorithmes ligne par ligne) correction pour corriger les images AFM suppression d&#39;inclinaison arbitraire et les effets à la dérive. </li></ol> 4. Analyse des données (30 min par image) <ol><li> Exporter des images dans ImageJ (en option: appliquer un facteur d&#39;échelle) preferentially en utilisant un format de compression sans perte, par exemple, le format TIFF (voir la figure 3A). </li><li> Utilisez la macro RiboPick.ijm d&#39;outils ImageJ (à copier dans le sous - répertoire macro / outils ImageJ) pour compter ribosomes en polysomes (voir la figure 3B) et calculer les propriétés statistiques de l&#39;échantillon (voir la figure 3C). <ol><li> Lancer le chargement d&#39;une image en utilisant le &lt;Lire l&#39;image&gt; outil qui initialise le programme. </li><li> Choisissez les centres de ribosomes avec le &lt;sélection Point&gt; ImageJ norme outil (shift + clic gauche permet la multi-sélection de ribosomes). Marquez les ribosomes sélectionnés avec le &lt;Mark ribosomes&gt; outil. coordonnées ribosome apparaîtront dans une fenêtre de texte personnalisé. </li><li> Ajouter plus ribosomes à la même polysomes répéter la procédure indiquée au point 4.2.2. </li><li> Retirer ribosomes tort marqués à l&#39;aide de la touche &lt;Annuler la dernière sélection&gt; outil (commence la suppression de la dernière ribosome ajoutée à la première212; dans le courant polysomes seulement). </li><li> Lorsque le polysomes est terminé, utilisez le &lt;New polysomes&gt; outil. Comme le nombre de polysomes est ajouté sous forme d&#39;une superposition sur l&#39;image, la fenêtre de texte mis à jour. </li><li> Utilisez le &lt;Enregistrer les résultats et à proximité&gt; pour écrire le ribosome fichier de coordonnées (les unités de l&#39;image par défaut sont utilisés) et une image PNG qui résume ribosomes et polysomes l&#39;élite. L&#39;image originale est fermé sans être enregistré. </li></ol></li></ol>

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<li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboAbacus%3A+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent dans cet article et n’ont rien à divulguer.

Comme la structure de l&#39;ADN a été prouvé être d&#39;une importance capitale pour décrire le processus de transcription et que l&#39;organisation de la chromatine a avancé notre compréhension du contrôle transcriptionnel de l&#39;expression génique, il est essentiel d&#39;analyser l&#39;organisation et la structure des polysomes pour améliorer la compréhension véridique de la traduction et de son règlement. Avec le protocole décrit, une densité optimale de polysomes doucement immobilisées...

La synthèse des protéines est le processus consommant de l&#39; énergie plus dans les cellules 1,2. Par conséquent, il est pas surprenant que les abondances de protéines sont principalement contrôlées à la translation plutôt que la transcription 3,4,5 niveau. Le polysomes est le composant macromoléculaire fondamental qui convertit les informations ARNm en lectures protéiniques fonctionnels. Polysomes sont jusqu&#39;ici considérées comme des complexes macromoléculaires , où plusieurs commandes de translation convergeant 13/06. Malgré des centaines d&#39;études sur la structure du ribosome 14- 16, les connaissances moléculaires détaillées sur la dynamique de la traduction et la topologie de polysomes a rencontré un intérêt limité. En conséquence, l&#39;organisation du complexe polysomal ribonucléoprotéinique natif et son effet potentiel sur la traduction sont encore des questions plutôt obscures. Polysomes peuvent se cacher encore des organisations ordonnées et fonctionnelles inconnues, potentiellement en miroir ce que nucléosomes et contro épigénétiquels ont représenté pour le champ de transcription. En effet, l&#39;enquête de cette hypothèse intrigante nécessite des études supplémentaires et de nouvelles approches techniques. Dans cette ligne, les techniques structurelles et microscopie à force atomique peuvent fructueusement collaborer pour percer de nouveaux mécanismes pour contrôler l&#39; expression des gènes, de façon similaire à ce qui a été réalisé pour le nucléosome 17,18. Depuis la découverte du ribosome 14-16, sa structure a été caractérisée en détail dans les procaryotes, les levures 19,20 21 et , plus récemment , chez l&#39; homme 22, fournissant la description des mécanismes moléculaires à la base de la synthèse protéique. Polysomes ont été comptabilisés initialement sur ​​la membrane du réticulum endoplasmique, formant des organisations géométriques 2D typiques 14. Comme mentionné précédemment, polysomes ensemble n&#39;a pas fait l&#39;objet d&#39;un intérêt constant que la structure du ribosome. Dans le passé, les polysomes ont été étudiés essentiellement en transmission EM-fondé des techniques. Seulement récemment, des techniques de cryo-EM ont permis à la reconstruction 3D de polysomes purifiés à partir de systèmes de traduction in vitro 23-26, des lysats cellulaires humaines 27 ou 28 dans les cellules. Ces techniques offrent des informations plus fine sur l&#39;organisation ribosome ribosomes dans les polysomes 23, 26-28 et la description moléculaire préalable des surfaces adjacentes de ribosomes dans les polysomes de germe de blé 24 de contact. Ainsi, cryo-EM tomographie permet la divulgation des interactions ribosomes ribosome avec détail moléculaire, mais il est grevé par une vaste post-traitement et analyse la reconstruction qui nécessitent des ressources informatiques lourds pour le traitement des données. De plus, pour obtenir le détail moléculaire des interactions ribosome-ribosome, une carte à haute résolution du ribosome est nécessaire, et ce genre de ribosome de référence est disponible seulement pour quelques espèces. Surtout, cryo-EM tomographie ne parvient pas à détecter l&#39;ARN libre. Therefminerai, de nouvelles techniques sont nécessaires pour comprendre l&#39;organisation de la machinerie de traduction. A côté de cryo-EM, l&#39; AFM a également été utilisé comme un outil utile pour l&#39; imagerie directe de polysomes dans les eucaryotes inférieurs 29-33 et les humains 27. Par rapport à EM, l&#39;AFM ne nécessite aucun échantillon de fixation ou de l&#39;étiquetage. En outre, les mesures peuvent être effectuées dans des conditions physiologiques proches et avec la possibilité unique d&#39;identifier clairement les ribosomes et les brins d&#39;ARN nus 27. L&#39;imagerie de polysomes simples peut être effectuée relativement rapidement, en obtenant des milliers d&#39;images à nano-résolution avec peu d&#39;effort post-traitement par rapport au post-traitement vaste et lourd et de reconstruction analyses requises par microscopie cryo-EM. Par conséquent, l&#39;AFM de la manipulation et l&#39;analyse des données n&#39;a pas besoin de postes de travail coûteux et grande puissance de calcul. En tant que telle, cette technique recueille des informations sur la forme des polysomal, les caractéristiques morphologiques (par exemple,hauteur, longueur et largeur), les densités ribosome, la présence d&#39;ARN libre et le nombre de ribosomes par polysomes 27 avec un débit plus élevé que cryo-EM. De telle manière, AFM représente une approche puissante et complémentaire aux techniques EM pour représenter polysomes 27. Nous présentons ici un pipeline complet de la purification à l&#39;analyse de données où AFM est appliqué à l&#39;image et l&#39;analyse polysomes du cerveau de souris. Le protocole proposé se concentre sur les problèmes de purification et le dépôt précis de polysomes sur des substrats de mica qui sont utilisés pour l&#39;imagerie AFM. En plus de l&#39; analyse des particules classiques qui peuvent être facilement réalisée avec un logiciel commun utilisé par la communauté de l&#39; AFM, un plugin ImageJ 34, appelé RiboPick, est présenté pour compter le nombre de ribosomes par polysomes 27, 35.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Préparation du lysat</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Préparation du lysat</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Préparation du lysat</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Préparation du lysat</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Préparation du lysat</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Préparation du</td></tr><tr><td>désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Préparation du lysat</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Préparation du lysat</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Préparation du gradient de saccharose</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Centrifugeuse à gradient de saccharose</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Centrifugation à gradient de saccharose</td></tr><tr><td>Tube polyallomère</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Centrifugation à gradient de saccharose</td></tr><tr><td>Système de fractionnement à gradient de densité&nbsp ;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Fractionnement par gradient de saccharose</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualisation</td></tr></tbody></table>

peering au cerveau polysomes avec atomic force microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Le mécanisme de translation, à savoir le polysomes ou polyribosome, est l&#39; un des plus grands et les plus complexes machineries cytoplasmiques dans les cellules. Polysomes, formés par les ribosomes, les ARNm, plusieurs protéines et les ARN non-codants, représentent les plates-formes où les contrôles ont lieu traductionnelles intégrés. Cependant, alors que le ribosome a été largement étudiée, l&#39;organisation de polysomes fait encore défaut compréhension globale. beaucoup d&#39;efforts sont donc nécessaires afin d&#39;élucider l&#39;organisation polysomes et tout nouveau mécanisme de contrôle de la traduction qui peut être intégré. La microscopie à force atomique (AFM) est un type de sonde à balayage microscopie qui permet l&#39;acquisition d&#39;images 3D à résolution nanométrique. Par rapport à la microscopie électronique (EM) techniques, l&#39;un des principaux avantages de l&#39;AFM est qu&#39;il peut acquérir des milliers d&#39;images à la fois dans l&#39;air et en solution, ce qui permet de l&#39;échantillon à être maintenu dans des conditions proches physiologiques sans qu&#39;il soit nécessaire pour la coloration et la fixation procédures. Ici, un protocole détaillé pour la purification précise de polysomes de cerveau de souris et leur dépôt sur des substrats de mica est décrite. Ce protocole permet l&#39;imagerie polysomes dans l&#39;air et aux liquides avec l&#39;AFM et leur reconstitution sous forme d&#39;objets en trois dimensions. En complément de cryo-microscopie électronique (cryo-EM), la méthode proposée peut être commodément utilisé pour analyser systématiquement polysomes et l&#39;étude de leur organisation.

Gradient de saccharose polysomal profilage de l&#39; ensemble du cerveau de la souris Il est possible de purifier polysomes à partir d&#39;un lysat cellulaire par profilage polysomal, qui sépare les macromolécules en fonction de leur poids et leur taille. Profilage polysomal, des lysats cytoplasmiques obtenus à partir de cellules ou de tissus ...

Bien que la structure des ribosomes ait été largement caractérisée, l’organisation des polysomes est encore sous-étudiée. Pour pallier ce manque de connaissances, nous présentons ici un protocole de préparation détaillé pour l’imagerie précise des polysomes de mammifères par microscopie à force atomique (AFM) dans l’air et dans les liquides.

Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

L'objectif général de ce protocole est de fournir un pipeline détaillé permettant la purification précise et le dépôt de polyribosomes cérébraux sur de la mica, ainsi que l'obtention de milliers d'images avec une résolution nanométrique, sans nécessiter de post-traitement intensif ni d'analyses de reconstruction 3D. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la traduction et du contrôle traductionnel, telles que la compréhension de l'impact de l'organisation des ribosomes au sein des polysomes lors de la réorganisation de l'expression génique. Les principaux avantages de cette technique sont l'absence de besoin de fixation ou d'étiquetage de l'échantillon, et la possibilité de réaliser les mesures dans des conditions proches des conditions physiologiques, permettant ainsi d'identifier facilement les ribosomes et les brins d'ARN nus.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'organisation des polyribosomes de mammifères, elle peut également être appliquée à d'autres micro-organismes, tels que les levures, les bactéries et les insectes, ainsi qu'à des états impliquant des contrôles traductionnels de l'expression génique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manipulation des échantillons polysomaux pour l'adsorption sur la mica et les étapes de lavage sont assez délicates et nécessitent des compétences manuelles et de l'expérience. La procédure sera démontrée par Paola Bernabo et Lorenzo Lunelli.Pour commencer, recueillir et congeler le tissu cérébral comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, sortir le tissu congelé du congélateur et l'amener sur le plan de travail. Placer le tissu cérébral congelé et de l'azote liquide dans un mortier prérefroidi et le pulvériser à l'aide d'un pilon jusqu'à l'obtention d'une poudre.Transférez environ 25 milligrammes de poudre cérébrale dans un tube de microcentrifugeuse froid et ajoutez immédiatement 0,8 millilitre de tampon de lyse. Aspirez et expulsez le mélange 25 fois rapidement à l’aide d’une pipette pour rompre les cellules. Ensuite, centrifugez le tube à 12 000 x g pendant une minute à quatre degrés Celsius afin de former un culot contenant les débris cellulaires.Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et maintenez le tube sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes afin de former un culot de noyaux et de mitochondries. Puis, retirez soigneusement un millilitre à partir du haut d'un gradient de saccharose préparé précédemment.Recouvrir la solution de saccharose, goutte à goutte, avec le surnageant provenant du lysat cytosolique. Une fois l'échantillon chargé au-dessus du gradient, insérer délicatement le tube et un tube témoin dans les godets d'un rotor à godets oscillants. Faire centrifuger le gradient pendant 100 minutes.Après ultracentrifugation, laisser les tubes dans leurs godets pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius afin de permettre la stabilisation du gradient. Ensuite, retirer délicatement le tube d'échantillon et le monter sur le dispositif de collecte d'un système de fractionnement en gradient de densité. Collecter des fractions d'un millilitre tout en surveillant l'absorbance des acides nucléiques à 260 nanomètres à l'aide d'un détecteur de lumière UV-visible, et les placer sur de la glace.Ensuite, préparez des aliquotes de 30 à 40 microlitres des fractions d’intérêt, et conservez-les sur de la glace. Si les échantillons ne doivent pas être utilisés immédiatement, stockez-les à 80 degrés Celsius et prenez des mesures pour limiter le nombre de cycles de congélation-décongélation. Pour préparer les échantillons en vue de l’imagerie par AFM, recouvrez tout d’abord une feuille de mica lavée de 200 microlitres de sulfate de nickel II à une concentration de un millimolaire, puis incubez la feuille pendant trois minutes à température ambiante.Ensuite, retirez la solution, séchez la surface à l'aide d'air comprimé et placez la boîte de Pétri sur de la glace. Ensuite, ajoutez délicatement tout l'aliquote de la fraction d'intérêt, goutte à goutte, sur la mica. À l'aide d'une pipette de 100 ou 200 microlitres, répartissez l'échantillon sur toute la surface de la mica, puis incubez l'échantillon sur glace pendant trois minutes.Ensuite, recouvrir la lame de mica goutte à goutte avec 200 microlitres de tampon AFM froid et incuber l'échantillon sur glace pendant une heure. Il est important de maintenir l'échantillon à 40 degrés et d'utiliser un tampon froid préparé dans de l'eau exempte de RNase afin de préserver l'organisation des polyribosomes. Après l'incubation, retirer soigneusement le tampon et laver la mica trois à quatre fois avec 200 microlitres de tampon AFM froid pour éliminer tout excès de saccharose.Ensuite, lavez le mica trois fois avec la solution de lavage froide et éliminez l'excès d'eau à l'aide de papier. La suppression complète du saccharose des échantillons absorbants est maintenant cruciale depuis que vous avez rompu à la fois le ribosome et l'ARN nu dans le polysome. Laissez l'échantillon sécher sous la hotte chimique, le couvercle de la boîte de Pétri partiellement ouvert.Après deux heures, fermer la boîte de Pétri. L'échantillon peut désormais être conservé à température ambiante. Fixer l'échantillon préparé sur le porte-échantillon du microscope à force atomique (AFM) à l'aide d'un ruban adhésif double face.Ensuite, insérez le porte-échantillon sur la platine du microscope à force atomique (AFM) conformément aux instructions du fabricant. Après la calibration, approchez l'échantillon jusqu'à ce que la pointe du levier entre en contact avec la surface. Sélectionnez une zone de balayage de deux par deux micromètres, une résolution d'au moins 512 x 512 pixels, choisissez le mode de soustraction en continu du fond, et sélectionnez une échelle Z de 20 à 25 nanomètres.Ensuite, commencez l'acquisition d'images. Examinez l'image en recherchant la présence d'objets sphériques caractérisés par une hauteur comprise entre 10 et 15 nanomètres lors de l'acquisition d'images dans l'air. Ajustez ensuite les paramètres de consigne et de rétroaction jusqu'à ce que des objets nets soient visualisés.Le fond devrait apparaître relativement plat dans de bons échantillons, avec quelques objets de deux à quatre nanomètres de hauteur. Une fois que l'image semble satisfaisante, enregistrez plusieurs scans de deux microns sur deux microns sur différentes zones de l'échantillon. Après le dépôt d'aliqotes de saccharose sur la mica, la microscopie à force atomique (AFM) fournit des descriptions précises de la taille des polysomes individuels, qui apparaissent comme des agrégats de ribosomes étroitement groupés.Un examen plus attentif de l'un des pics ribosomiques à l'aide d'une analyse en coupe transversale révèle que la hauteur des pics ribosomiques est d'environ 14 nanomètres. Cela correspond à ce qui avait été observé précédemment pour les ribosomes et polysomes humains après séchage à l'air. Dans l'image de droite, une macroinstruction a été utilisée pour identifier l'emplacement des ribosomes et marquer chaque ribosome à l'aide d'un cercle rouge.À l’aide de ces informations, on peut analyser la distribution de fréquence du nombre de ribosomes par polysome. Cette distribution expérimentale a été ajustée à une courbe gaussienne centrée sur 5,8 ribosomes par polysome, avec un écart type de 1,3. Une fois maîtrisée, cette technique, de la pulvérisation cérébrale à l’acquisition des images de polyribosomes, peut être réalisée en moins de huit heures si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de maintenir l'échantillon sur de la glace et d'utiliser des tampons froids pour le dépôt de l'échantillon sur la mica. En suivant cette procédure et en utilisant le module complémentaire ImageJ d'un développeur mis à disposition dans votre publication, vous pouvez dénombrer précisément le nombre de ribosomes par polysome. Après chaque développement, cette technique ouvrira la voie à la compréhension de la cinétique de formation des polysomes et à l'identification des modifications dans l'organisation des polysomes ainsi que dans leurs différentes conditions cellulaires ou tissulaires.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir des milliers d'images de polysomes afin d'analyser et d'étudier systématiquement leur organisation.

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Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration de la microscopie statique à force atomique pour visualiser des nucléosomes assemblés. Cette technique d’imagerie à haute résolution permet d’étudier la structure des nucléosomes.

Microscopie statique à force atomique pour visualiser et caractériser les nucléosomes assemblés

&lt;p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;Source : Lunelli, L., et al. Regarder les polysomes cérébraux avec la force atomique Microscopie. J. Vis. exp.(2016).Cette vidéo montre l’imagerie des polysomes à l’aide de la microscopie à force atomique. Une feuille de mica enrobée d’ions nickel ancre l’ARN avec les ribosomes attachés. L’échantillon est lavé, séché et monté sur la platine du microscope. La pointe en porte-à-faux scanne la surface de...

 Imagerie de polysomes isolés du cerveau d’une souris à l’aide de la microscopie à force atomique

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