Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy

L’objectif global de ce protocole est de fournir un pipeline détaillé pour la purification et le dépôt précis de polyribosomes cérébraux sur le mica et d’obtenir des milliers d’images à une résolution nanométrique sans avoir besoin d’un post-traitement lourd ou d’analyses de reconstruction 3D. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la traduction et du contrôle traductionnel, comme la compréhension de l’impact de l’organisation des ribosomes dans les polysomes lors du recâblage de l’expression des gènes. Les principaux avantages de cette technique sont qu’il n’est pas nécessaire de fixer ou de marquer l’échantillon, et que les mesures peuvent être effectuées dans des conditions physiologiques proches pour identifier facilement les ribosomes et les supports d’ARN nus.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’organisation du polyribosome de mammifère, elle peut également être appliquée à d’autres micro-organismes, tels que les levures, les bactéries et les insectes, ainsi qu’à l’état impliquant des contrôles translationnels de l’expression génique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la manipulation d’un échantillon polysomal pour l’absorption du mica et les étapes de lavage sont assez délicates et nécessitent des compétences et de l’expérience en matière de manipulation. Paola Bernabo et Lorenzo Lunelli feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer, prélevez et congelez du tissu cérébral comme décrit dans le protocole textuel ci-joint. Ensuite, sortez le mouchoir congelé du congélateur et apportez-le sur le banc. Placez le tissu cérébral congelé et l’azote liquide dans un mortier pré-refroidi et pulvérisez-le à l’aide d’un pilon jusqu’à ce qu’il forme une poudre.

Transférez environ 25 milligrammes de poudre de cerveau dans un tube de microcentrifugation froid et ajoutez immédiatement 0,8 millilitre de tampon de lyse. Pipetez le mélange de haut en bas 25 fois rapidement pour perturber les cellules. Ensuite, centrifugez le tube à 12 000 x g pendant une minute à quatre degrés Celsius pour granuler les débris cellulaires.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation et maintenez le tube sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes pour granuler les noyaux et les mitochondries. Ensuite, retirez soigneusement un millilitre du haut d’un dégradé de saccharose préalablement préparé.

Superposez le saccharose goutte à goutte avec le surnageant du lysat cytosolique. Une fois l’échantillon maintenant chargé au-dessus du gradient, abaissez soigneusement le tube et un tube d’équilibrage dans les godets d’un rotor à godets oscillants. Centrifugez le gradient pendant 100 minutes.

Après l’ultracentrifugation, laissez les tubes dans leurs godets pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, pour laisser le gradient se stabiliser. Ensuite, retirez soigneusement le tube d’échantillon et montez-le sur le dispositif collecteur d’un système de fractionnement à gradient de densité. Collectez des fractions d’un millilitre tout en surveillant l’absorbance des acides nucléiques à 260 nanomètres avec un détecteur de lumière visible UV et mettez-les sur de la glace.

Ensuite, préparez des aliquotes de 30 à 40 microlitres des fractions d’intérêt et conservez-les sur de la glace. Si les échantillons ne sont pas utilisés immédiatement, conservez-les à 80 degrés Celsius et prenez des mesures pour limiter le nombre de cycles de gel-dégel. Pour préparer des échantillons pour l’imagerie AFM, recouvrez d’abord une feuille de mica lavée de 200 microlitres d’un sulfate de nickel II millimolaire et incubez la feuille pendant trois minutes à température ambiante.

Retirez ensuite la solution, séchez la surface à l’air comprimé et placez la boîte de Pétri sur de la glace. Ensuite, ajoutez délicatement l’aliquote entière de la fraction d’intérêt goutte à goutte sur le mica. À l’aide d’une pointe de 100 ou 200 microlitres, étalez l’échantillon sur toute la surface du mica et incubez l’échantillon sur de la glace pendant trois minutes.

Ensuite, recouvrez la feuille de mica goutte à goutte de 200 microlitres de tampon froid AFM et incubez l’échantillon sur de la glace pendant une heure. Il est important de maintenir l’échantillon à 40 degrés et d’utiliser un tampon froid préparé dans de l’eau exempte de RNase pour préserver l’organisation des polyribosomes. Après l’incubation, retirez soigneusement le tampon et lavez le mica trois à quatre fois avec 200 microlitres de tampon froid AFM pour éliminer tout excès de saccharose.

Ensuite, lavez le mica trois fois avec une solution de lavage froide et égouttez l’excès d’eau du mica à l’aide de papier. L’élimination complète du saccharose des échantillons absorbants est cruciale maintenant que vous avez sectionné à la fois le ribosome et l’ARN nu dans le polysome. Laissez sécher l’échantillon sous le capot chimique avec le haut de la boîte de Pétri partiellement ouvert.

Au bout de deux heures, fermez la boîte de Pétri. L’échantillon peut maintenant être conservé à température ambiante. Fixez l’échantillon préparé au porte-échantillon de l’AFM à l’aide de ruban adhésif double face.

Ensuite, insérez le support d’échantillon dans l’étage AFM conformément aux instructions du fabricant. Après l’étalonnage, approchez-vous de l’échantillon jusqu’à ce que la pointe en porte-à-faux s’engage dans la surface. Sélectionnez une zone de balayage de deux par deux microns, une résolution d’au moins 512 x 512 pixels, choisissez le mode de soustraction d’arrière-plan en direct et sélectionnez une échelle Z de 20 à 25 nanomètres.

Ensuite, commencez l’acquisition de l’image. Inspectez l’image, à la recherche de la présence d’objets ronds caractérisés par une hauteur comprise entre 10 et 15 nanomètres lors de l’acquisition d’images dans l’air. Ensuite, ajustez le point de consigne et les paramètres de retour jusqu’à ce que les objets pointus soient visualisés.

L’arrière-plan devrait apparaître relativement plat dans de bons échantillons avec des objets de deux à quatre nanomètres de haut. Une fois que l’image semble bonne, acquérez plusieurs balayages de deux par deux microns dans différentes zones d’échantillonnage. Après le dépôt d’aliquotes de saccharose sur le mica, l’AFM fournit des descriptions précises de la taille de polysomes uniques qui apparaissent comme des amas de ribosomes serrés.

En examinant de plus près l’un des pics ribosomiques à l’aide d’une analyse de section efficace, on constate que la hauteur des pics ribosomiques est d’environ 14 nanomètres. Cela correspond à ce qui a été observé précédemment pour les ribosomes et les polysomes humains après séchage à l’air. Dans l’image de droite, une macro a été utilisée pour identifier l’emplacement du ribosome et marquer chaque ribosome avec un cercle rouge.

À l’aide de ces informations, la distribution de fréquence du nombre de ribosomes par polysome peut être analysée. Cette distribution expérimentale a été ajustée à l’aide d’une courbe gaussienne centrée sur 5,8 ribosomes par polysome, avec un écart-type de 1,3. Une fois maîtrisée, cette technique allant de la pulvérisation cérébrale à l’acquisition d’images de polyribosomes peut se faire en moins de huit heures si elle est réalisée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder l’échantillon sur de la glace et d’utiliser des tampons froids pour le dépôt de l’échantillon sur le mica. En suivant cette procédure, et en utilisant le plugin ImageJ d’un développeur pour le mettre à disposition dans votre article, vous pouvez compter précisément le nombre de ribosomes par polysome. Après chaque développement, cette technique ouvrira la voie à la compréhension de la cinétique de formation des polysomes et à l’identification des changements dans l’organisation des polysomes et de leurs différentes conditions cellulaires ou tissulaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des milliers d’images de polysomes pour analyser et étudier systématiquement leur organisation.