Fluorescence Imaging Time-lapse de la complète S. venezuelae Cycle de vie en utilisant un dispositif microfluidique

L’objectif global de ce protocole de microscopie fluorescente à intervalle temporel est de fournir une méthode pour étudier les processus cellulaires biologiques qui sous-tendent le développement et la différenciation cellulaire chez la bactérie filamenteuse sporulante, Streptomyces venezuelae. La méthode describe fournit une excellente plate-forme pour étudier les processus biologiques cellulaires qui sont au cœur du cycle de vie de Streptomyces, y compris la localisation dynamique des protéines, la croissance polarisée et la septation par sporulation. Le principal avantage de cette technique est que Streptomyces venezuelae sporule dans un liquide, ce qui nous permet de faire pousser les cellules dans un dispositif microfluidique et de surveiller au microscope l’ensemble du cycle de vie.

Cette méthode démontre l’immense potentiel de Streptomyces venezuelae en tant que nouveau système de développement pour le genre, car elle permet l’imagerie de cellules vivantes de la différenciation d’un mycélium multicentrique en chaînes de spores. Pour commencer, inoculez 30 millilitres de milieu de croissance complété avec 10 microlitres de spores de la souche S. venezuela à imager. Pour une croissance et une sporulation constantes des cellules, utilisez un flacon à chicanes ou un ballon contenant un ressort pour permettre une aération suffisante.

Cultivez les cellules pendant 35 à 40 heures à 30 degrés Celsius et 250 tr/min. Lorsque vous êtes prêt, vous devriez être en mesure de voir les fragments et les spores mycéliens via la microscopie à contraste de phase montée en liquide. Centrifugez un millilitre de la culture dans une centrifugeuse de table à 400 fois G pendant une minute pour granuler le mycélium et les plus gros fragments cellulaires.

Ensuite, transférez environ 300 microlitres de surnageant contenant une suspension de spores dans un nouveau tube de 1,5 millimètre et placez le tube sur de la glace. Conservez le milieu de culture restant pour l’utiliser dans une étape ultérieure. Ensuite, diluez les spores de un à 20 dans un milieu de croissance supplémenté et conservez les spores diluées sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires.

Versez le milieu de culture restant dans un bécher de 50 millilitres, puis prélevez 10 millilitres avec une seringue et utilisez un filtre à seringue stérile de 22 micromètres pour filtrer et stériliser le milieu de culture restant. Pour obtenir un milieu de croissance supplémenté épuisé, exempt de spores et de fragments mycéliens. Conservez le milieu de croissance supplémenté filtré pendant quelques jours à quatre degrés Celsius si des expériences supplémentaires, utilisant des conditions de croissance similaires, doivent être menées.

Chaque plaque microfluidique peut être utilisée pour un maximum de quatre expériences indépendantes. Pour éviter de contaminer les chambres d’écoulement inutilisées, assurez-vous d’utiliser des solutions et des conditions de travail stériles lors de la mise en place de l’expérience. Commencez par retirer la solution d’expédition de la plaque microfluidique.

Rincez ensuite les puits avec un milieu de croissance supplémentaire stérile. Une fois rincé, ajoutez 300 microlitres de milieu de croissance supplémenté à l’entrée du puits un, et 300 microlitres de milieu de croissance complété épuisé aux puits deux à six. Ensuite, chargez 40 microlitres de spores diluées dans le puits huit de la voie A et scellez le collecteur sur la plaque conformément aux instructions du fabricant.

Lancez le logiciel de contrôle de la microfluidique et sélectionnez le type de plaque approprié. Mettez en place un programme d’écoulement pour faire couler le milieu à partir des puits d’entrée un à cinq à six psi pendant deux minutes par puits afin d’amorcer le canal d’écoulement et la chambre de culture. Ensuite, faites-le couler un milieu de croissance supplémenté à six psi dans le puits d’entrée un pendant six heures.

Cela permettra la germination et la croissance végétative. Demandez au programme de passer après six heures au milieu de croissance supplémentaire épuisé et de le faire couler dans les puits deux à cinq à six psi pour le reste de l’expérience. Préchauffez la chambre environnementale à 30 degrés Celsius à l’avance.

Allumez ensuite le microscope et le logiciel de contrôle du microscope. Mettez en place un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique et confirmez que les filtres et les miroirs schématiques appropriés pour acquérir des images de contraste interférentiel différentiel, ainsi que les images des fusions de protéines fluorescentes jaunes et rouges fluorescentes sont en place. Placez une goutte d’huile d’immersion dans l’objectif et au bas de la fenêtre d’imagerie sur la plaque microfluidique également.

Montez soigneusement le dispositif microfluidique scellé sur la platine du microscope inversé et fixez-le en place. Utilisez les marqueurs de position intégrés pour mettre au point la fenêtre d’imagerie de la chambre de culture microfluidique. Concentrez-vous sur la partie la plus à gauche de la première chambre d’écoulement étiquetée A, puis déplacez la platine pour obtenir une taille de piège cinq, correspondant à la hauteur du piège de 7 micromètres.

Dans le logiciel microfluidique, réglez le système pour charger les cellules du puits d’entrée huit à quatre psi pendant 15 secondes. Une fois le processus exécuté, vérifiez la densité cellulaire dans la chambre de culture en déplaçant la platine sur la fenêtre d’imagerie. Si aucune spores n’a été piégée, répétez l’étape de chargement cellulaire ou, alternativement, augmentez la pression et/ou le temps de chargement jusqu’à ce que la densité cellulaire souhaitée de une à 10 spores par fenêtre d’imagerie soit atteinte.

Veillez à ne pas surcharger la chambre de culture. Ensuite, démarrez le programme d’écoulement précédemment préparé dans le logiciel de contrôle et laissez la plaque microfluidique s’équilibrer en chaleur pendant une heure au stade du microscope avant de commencer l’acquisition d’images. Dans le logiciel de contrôle du microscope, configurez une acquisition multidimensionnelle pour prendre plusieurs images à plusieurs positions de platine au fil du temps en spécifiant d’abord un répertoire pour l’enregistrement automatique des fichiers d’image.

Ensuite, allez dans les paramètres d’éclairage et entrez des paramètres d’éclairage optimaux prédéterminés pour chaque construction spécifique. Ensuite, configurez une série chronologique pour acquérir des images toutes les 40 minutes pendant 24 heures. Afin de déterminer les positions de platine et de régler l’autofocus, scannez la chambre de culture et enregistrez les positions de platine pour chaque position d’imagerie d’intérêt.

Assurez-vous que les positions à un étage sont suffisamment éloignées les unes des autres pour minimiser le photoblanchiment et la phototoxicité. Une fois que les coordonnées Z des positions de scène sélectionnées sont vérifiées, activez l’autofocus matériel. Démarrez ensuite l’expérience time-lapse dans le logiciel de contrôle du microscope.

Arrêtez l’acquisition de l’image au bout de 24 à 30 heures, ou lorsque les hyphes de la région d’intérêt se sont différenciés en spores. Arrêtez ensuite le programme de flux dans le logiciel et démontez le dispositif microfluidique. Préparez la plaque microfluidique utilisée pour le stockage à court terme en retirant tout fluide restant des puits d’entrée, du puits de déchets et du puits de chargement de la cellule.

Remplissez ensuite les puits utilisés de la voie A et les puits des voies inutilisées avec du PBS stérile. Enfin, scellez la plaque avec un film de poire pour éviter qu’elle ne se dessèche. Et conservez l’assiette à quatre degrés Celsius.

L’imagerie réussie de cellules vivantes de l’ensemble du cycle de vie de S. venezuela produit une série chronologique continue, y compris les étapes clés du développement de la germination, de la croissance végétative et de la sporulation. Pendant la germination ou la croissance végétative, DivIVA-mCherry s’accumule exclusivement aux extrémités des hypes en croissance ou marque les points de ramification des hyphes nouvellement formés. En revanche, FtsZ-YPet forme des structures uniques en forme d’anneau à intervalles irréguliers dans le mycélium en croissance.

Ces structures fournissent l’échafaudage pour la synthèse de parois transversales végétales non constructives conduisant à la formation de compartiments hyphes interconnectés. Dans les hyphes sporulants, le modèle de localisation de FtsZ-YPet change radicalement. Tout d’abord, les filaments hélicoïdaux FtsZ-YPet culbutent le long de l’hyphe, puis lors d’un événement soudain, presque synchrone, ces hélices fusionnent en une échelle d’anneaux FtsZ-YPet régulièrement espacés.

Enfin, les septa de sporulation deviennent discernables dans les images de contraste d’interférence différentielle et, finalement, les nouvelles spores sont libérées. Cette technique fournit un protocole robuste pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes du cycle de vie complet de Streptomyces. Le système microfluidique est facile à utiliser.

Il offre une flexibilité expérimentale et permet un suivi à long terme de la Cette configuration expérimentale offre également un excellent point de départ pour étudier des événements de développement spécifiques en réponse à des conditions culturelles changeantes ou à l’utilisation de colorants fluorescents pour surveiller la synthèse du peptidoglycane ou pour visualiser l’organisation des chromosomes.