Un bioessai simple pour l'évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

Le but global de ce bioessai cellulaire simple est de détecter, quantifier et surveiller l'activité des membres de la famille des ligands du facteur de croissance endothélial vasculaire. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en biologie vasculaire, en virologie, en oncologie et en ophtalmologie, domaines dans lesquels les ligands de la famille VEG-FR régulent des processus essentiels liés à ces maladies. Le principal avantage de cet essai réside dans sa capacité à évaluer les ligands de la famille VEG-FM selon leur aptitude à se lier et à réticuler leurs différents récepteurs, sans nécessiter de cellules épithéliales spécialisées.

Mettons en culture la lignée cellulaire sécrétant l'IL3, WEHI-3D, en pipetant cinq fois dix à la puissance six cellules en phase logarithmique de croissance dans quatre à dix flacons T175 contenant chacun 50 millimètres de milieu de culture frais. Incubons pendant sept jours ou jusqu'à ce que les cellules aient dépassé leur phase logarithmique de croissance de 24 à 48 heures environ. Retirons par décantation le liquide et les cellules des flacons.

Et centrifuger à 1 000 G pendant 15 minutes pour éliminer les cellules et les débris cellulaires. Ensuite, retirer les 90 % supérieurs du surnageant et le filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Aliquoter le milieu conditionné en fractions d’un millilitre pour la préparation des tests.

Des aliquotes de 50 millilitres pour préparer le milieu de culture destiné au passage de lignées cellulaires dépendantes de facteurs, et des volumes de 200 millilitres pour un stockage à long terme à 20 degrés Celsius. Conserver les volumes plus petits à 20 degrés Celsius. Cultiver les cellules BAF3 de contrôle dans un milieu contenant 10 % de milieu conditionné WEHI-3D.

et des cellules VegFR2-EPoR-BAF3 dans le même milieu supplémenté de un milligramme par millilitre de G418. Repiquez les cellules à un dilution de un à 15 à partir de cellules en phase de croissance logarithmique. Récoltez les cellules BAF3 témoins ou les cellules VegFR2VPoR-BAF3 pour des cultures en phase logarithmique moyenne.

Par aspiration douce à la pipette pour détacher les cellules du fond du flacon, centrifuger à 750 G pendant cinq minutes afin d'obtenir un culot cellulaire. Resuspendre le culot dans 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de tonicité murine et centrifuger à nouveau à 750 G pendant cinq minutes. Répéter ce lavage deux fois supplémentaires pour éliminer le milieu contenant l'IL3.

Lavez les cellules une fois en utilisant un milieu sans milieu conditionné DEHI-3D. Il est important d'éliminer le milieu de culture contenant de l'IL3 afin de s'assurer qu'aucun facteur de croissance supplémentaire ne reste, ce qui pourrait entraîner un résultat faussement positif ou une activité de fond élevée. Après centrifugation et élimination du surnageant, resuspendez les cellules dans le même milieu dépourvu d'IL3 à une concentration de 7,4 × 10⁴ cellules par millilitre.

Enfin, mélanger des volumes égaux de bleu de trypan en PBS avec une population cellulaire et charger dans un hémacytomètre. Compter au moins 100 cellules. Les cellules qui absorbent le colorant sont considérées comme mortes ou en voie de mort.

Il est essentiel que les cellules utilisées pour le test présentent une viabilité élevée afin de garantir leur capacité à réagir aux conditions du test. Utilisez une pipette automatique P20 bien étalonnée et des embouts stérilisés pour ajouter 1 000 cellules en 13,5 microlitres de milieu déficient en IL dans les puits d'une plaque de 72 puits. Veillez à bien mélanger la suspension cellulaire pendant le prélèvement afin qu'un dépôt des cellules par gravité n'entraîne pas de biais dans la concentration cellulaire.

Utilisez une pipette P2 bien calibrée pour ajouter 1,5 microlitre de milieu sans IL3 en triple exemplaire dans les puits témoins. Mélangez délicatement. De la même manière, ajoutez le milieu conditionné à 10 % de WEHI-3D et le témoin sans IL3 contenant 100 nanogrammes par millilitre de VegFA dans les puits souhaités.

Ajouter enfin 1,5 microlitres des échantillons test en triplets. Remplir les puits inutilisés de la plaque de microtitration avec de l'eau stérile, du PBS ou du milieu. Placer du papier absorbant imbibé d'eau dans un récipient perméable aux gaz afin de créer une chambre humidifiée permettant les échanges gazeux.

Incuber les plaques de dosage dans les chambres sous une atmosphère humidifiée de 10 % de dioxyde de carbone pendant 16 heures. Après 16 heures d'incubation, analyser les plaques à l'aide d'un microscope inversé à contraste de phase standard avec un grossissement de 40 à 100x. À ce stade, il est possible de distinguer les échantillons positifs des échantillons négatifs.

Les puits sans soutien de facteurs de croissance ou contenant uniquement le milieu auront un nombre réduit de cellules rondes ainsi que des cellules mortes ou en voie de mort et des débris cellulaires. En revanche, les cellules incubées dans un milieu contenant l'IL3 ou un ligand pour le VegFR2 sont grandes et translucides, et il n’y a aucune ou très peu de granularité dans le cytoplasme cellulaire ni de débris cellulaires dans la culture. Ajouter 10 000 cellules lavées dans 135 microlitres de milieu déficient en IL3 dans les puits d'une plaque standard de 96 puits.

Utilisez une pipette P20 étalonnée pour ajouter 15 microlitres des échantillons test et des témoins dans les puits. Incubez le mélange de cellules, de facteurs de croissance et/ou d'agents inhibiteurs comme précédemment pendant 48 heures. À la fin de la période d'incubation, évaluez le nombre de cellules viables dans les puits à l'aide des méthodes décrites dans la partie écrite du protocole.

Voici les résultats d'un test dans lequel le test biologique VEGF-R2 EPoR BAF3 est utilisé pour quantifier l'activité des trois ligands humains recombinants spécifiques de VEGF-R2 : VEGF-A165, VEGF-C et VEGF-D. L'activité a été quantifiée en présence de bévacizumab, un anticorps monoclonal inhibiteur dirigé contre VEGF-A165, ou en présence de trastuzumab, un anticorps non neutralisant.

Les données ont été normalisées par rapport à la réponse à VEGF-A165 seul. Comme prévu, le bécacizumab a bloqué l'effet de VEGF-A165 dans le test, mais n'a eu aucun effet sur l'activité de VEGF-C et de VEGF-D. Les cellules exposées à l'IL3 présentaient une viabilité élevée.

Alors que ceux exposés à aucun facteur de croissance supplémentaire présentent une faible viabilité. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'il existe une gamme d'agents régulateurs dans les milieux conditionnés qui doivent être préparés préalablement à l'essai. Cette technique a ouvert la voie à un renouveau en biologie vasculaire, en virologie, en cancérologie et en ophtalmologie pour explorer le rôle du VEG-FM dans les ligines.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer les cellules de bioessai, réaliser le bioessai et effectuer les analyses quantitatives ou semi-quantitatives de l'activité du ligand VEG-FM.