Name: Enregistrement souris vocalisations ultrasoniques pour évaluer la Communication Sociale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez l'enregistrement des vocalisations ultrasoniques chez la souris pour évaluer la communication sociale et les troubles neuropsychiatriques. Cette méthode standardisée améliore la reproductibilité des études comportementales.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation de France, par l’ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003], par l’ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen], par Neuron-ERANET (EUHF-AUTISME), par la Fondation Orange, par la Fondation FondaMentale, par la Fondation de France, par la Fondation Bettencourt-Schueller. La recherche qui a abouti à cet article a également reçu le soutien de l’entreprise commune Innovative Medicine Initiative dans le cadre de la convention de subvention n° 115300, dont les ressources sont composées d’une contribution financière du septième programme-cadre de l’Union européenne (FP7/2007-2013) et d’une contribution en nature des entreprises EFPIA. Nous remercions Julie Lévi-Strauss pour ses commentaires utiles sur le manuscrit et les six examinateurs anonymes dont les commentaires ont sensiblement amélioré le manuscrit.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici fournit des méthodes normalisées et fiables pour recueillir des vocalisations ultrasoniques de souris dans le laboratoire. Ces situations très limitées présentent l&#39;avantage de la normalisation. Ils sont utilisés avec succès pour comparer les souches ou génotypes au sein des souches 18,19,26,27. Tel que présenté dans les résultats représentatifs, ces méthodes permettent l&#39;identification de la communication sociale atypique chez les souris mutées pour SHANK2, un gène associé à des troubles du spectre autistique. Les comparaisons entre les souches de souris, entre les différents contextes ou même entre les laboratoires seront déclenchés par la disponibilité de grands ensembles de données sur la base de données mouseTube. Cet outil devrait stimuler les études sur les vocalisations ultrasoniques de souris en permettant des analyses multivariées. Les protocoles décrits ici sont optimisés pour tester les souris des génotypes différents au sein d&#39;une souche, comme cela se fait dans la majorité des études sur la modélisation de la génétique contribution à des troubles neuropsychiatriques. Il est recommandé de concevoir expérimentalement chaque étude pour avoir les meilleurs contrôles possibles. En effet, les effets de la litière peuvent masquer ou gonfler artificiellement les effets génétiques 28,29. Il est donc conseillé d&#39;inclure des contrôles de même portée pour chaque génotype. Elevage parents hétérozygotes devraient donc être favorisés, car il permettra à l&#39;adaptation correcte des souris mutantes et de contrôle au sein d&#39;une litière. Cela justifie le marquage de tous les chiots tatouage de la patte (aveuglé génotype) pour suivre les individus à travers les enregistrements tous les deux jours. Le génotypage est effectué au moment du sevrage, en prélevant des échantillons de la queue. Lors de l&#39;enregistrement des appels d&#39;isolement de chiot de P2, nous ne recommandons pas de prélever des échantillons de la queue déjà chez les petits, puisque cette opération inclut la manipulation supplémentaire et le stress très proche dans le temps d&#39;une session d&#39;enregistrement. Les protocoles suggérés ici pour susciter vocalisations ultrasoniques chez les adultes ne permet pas une identification claire de la emitter des vocalisations. Cela explique pourquoi nous manipulons la motivation de l&#39;animal d&#39;essai. En effet, les souris de test sont isolées et non le nouveau venu et les animaux d&#39;essai habituent pendant une longue période à la cage d&#39;essai au cours des interactions du même sexe. Dans les interactions hommes-femmes, la femelle introduit est pas isolé et le mâle de test accoutume pour la réduction du temps depuis la motivation pourrait être plus élevé dans ce contexte sexuel. Ces manipulations de motivation devraient maximiser la probabilité de la souris d&#39;essai émettant des vocalisations et non pas celui présenté. Pour enregistrer les vocalisations ultrasoniques mâles dans un contexte sexuel, un écouvillon simple coton frais urine (ie, non congelés) d&#39;une femelle oestrus peut également être introduit dans la cage 30. Cette méthode permet l&#39;attribution de vocalisations ultrasoniques au mâle de test avec 100% de certitude, mais il empêche la collecte d&#39;informations précises sur le contexte social actuel d&#39;émission de ces vocalisations. Par conséquent, nous sommes favorables à l&#39;protocol décrit ici (avec un oestrus femelle librement en mouvement). Nous vous recommandons également de toujours utiliser des souris introduit à partir de la même souche lors du test de la souris à partir d&#39;une souche mutante et d&#39;analyser les données comme une paire de souris vocalisations. Une étude récente favorise l&#39;utilisation de la triangulation pour localiser l&#39;émetteur 31. Dans cette étude, les femmes ont été trouvées pour émettre également vocalisations ultrasoniques lors de rencontres avec un mâle. Ceci pourrait être expliqué par le fait qu&#39;ils ont été isolés pendant au moins deux semaines avant la session d&#39;enregistrement. La généralisation de l&#39;utilisation de la triangulation proposée dans cette étude devrait néanmoins permettre l&#39;identification de l&#39;émetteur des vocalisations dans la plupart des cas, si les enregistrements vidéo sont correctement synchronisés. Les appels de chiots enregistrés au cours du développement d&#39;isolement ne sont pas dérangés par le bruit de fond de la literie. Habituellement, une analyse automatique fonctionne très bien pour extraire les principales variables. En revanche, les vocalisations enregistrées des adultes sont disturbed par le bruit de fond provenant des animaux qui se déplacent dans la litière. L&#39;analyse automatique peut échouer, et donc une analyse manuelle doit être utilisée. Néanmoins, l&#39;ajout de literie dans la cage de test devrait fournir des conditions qui sont moins stressant pour les animaux que le sol nu (que les souris n&#39;aiment pas). D&#39;autres efforts de la communauté sont concentrés sur l&#39;amélioration de la détection automatique des vocalisations ultrasoniques dans diverses conditions, y compris ceux impliquant des bruits de fond. Par exemple, le logiciel VOICE permet d&#39;analyser les vocalisations qui avaient été sélectionnés manuellement pour l&#39;absence de bruit de fond 32. Dans ce logiciel, l&#39;extraction des variables acoustiques est automatique, mais il faut la sélection manuelle initiale. Il convient de noter que la variabilité inter-individuelle est très important dans le comportement vocal de souris. Par exemple, le taux des hommes adultes en présence d&#39;une femelle oestrus d&#39;appel est très distribué (Figure 1). Nous suggest ces protocoles normalisés pour obtenir des vocalisations ultrasoniques déjà pour limiter la variabilité liée au contexte expérimental. Néanmoins, nous tenons à souligner l&#39;importance de présenter non seulement la moyenne et SEM pour les données, mais surtout les points individuels dans des échantillons de petite taille 33. Il est également très pertinent - sinon nécessaire - pour enregistrer au moins 12 individus de chaque groupe / génotype pour recueillir des données représentatives. Dans de nombreux cas, la variabilité inter-individuelle ne doit pas être caché (généralement, il ne peut pas être), et il pourrait être d&#39;une grande importance pour identifier les individus porteurs de la mutation génétique étudiée, mais n&#39;affichant aucun phénotype atypique. Ces personnes pourraient fournir des indices sur les compensations, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles voies pour les thérapies des troubles génétiques. Dans la plupart des caractérisations du comportement des modèles de souris pour les troubles neuropsychiatriques, le comportement vocal et les contacts sociaux sont considérered à part (par exemple, 19,27,34,35). Les méthodes d&#39;analyse récentes fournissent maintenant une caractérisation détaillée semi-automatique des événements sociaux et les séquences d&#39;événements lors d&#39; une interaction ( à l&#39; aide MiceProfiler par exemple) 36, ainsi que la possibilité de combiner cette analyse avec des données provenant des enregistrements audio. Le principal avantage de cette méthode est de fournir une vue d&#39;ensemble de la communication sociale dans les modèles de souris de TSA, d&#39;identifier plus précisément les aspects de la communication sociale sont touchés. Dans le présent protocole de synchronisation est encore manuel, mais cela peut être amélioré en déclenchant l&#39;enregistrement vidéo via le logiciel d&#39;enregistrement audio. Ce type d&#39;analyse devrait devenir la norme de fournir une vision plus globale des déficits de communication sociale dans les modèles de souris de troubles neuropsychiatriques. En outre, jusqu&#39;à présent, les signaux vocaux sont généralement analysées à partir du côté de l&#39; émetteur ( par exemple, des tests sont conçus pour favoriser l&#39;émission de vosignaux cal par la souris testée, comme dans les protocoles actuels). L&#39;accent doit désormais être mis sur le récepteur de ces signaux, afin de mieux identifier les fonctions de ces signaux acoustiques. Cela devrait être fait en évaluant également le comportement des souris nouveau-venu dans les protocoles actuels chez les adultes ( en utilisant MiceProfiler par exemple) 36, en utilisant des expériences de lecture 16, ou par la mise en place de nouveaux protocoles. En effet, les présents protocoles prévoient des situations très contraints qui pourraient ne pas refléter les conditions éthologiques exactes de vocalisation émission chez la souris. L&#39;émission spontanée de vocalisations ultrasoniques devra être mieux caractérisé en utilisant des enregistrements audio et vidéo en continu à jeter plus de lumière sur le comportement vocal spontanée de souris.

Les patients souffrant de troubles neuropsychiatriques affichent généralement des déficits dans la communication sociale (par exemple, les patients atteints de troubles du spectre autistique, la schizophrénie ou la maladie d&#39; Alzheimer) 1. Des souris génétiquement modifiées sont de plus en plus fréquemment utilisés pour modéliser les causes génétiques de ces troubles 2. Étudier la communication sociale dans ces modèles de souris est d&#39;un grand intérêt pour la compréhension des mécanismes de mutations génétiques conduisant à des dysfonctionnements sociaux atypiques et pour tester de nouvelles thérapies. Puisque les souris sont des animaux sociaux et de communiquer les uns avec les autres à l&#39;aide olfactive, tactile, des signaux visuels et acoustiques, ils sont des modèles appropriés pour évaluer la communication sociale. Vocalisations ultrasoniques souris sont maintenant couramment utilisés en tant que proxy pour modéliser les bases génétiques des déficits de communication vocaux 3,4 (mais l&#39;existence de l&#39; apprentissage vocal dans cette espèce est encore débattue 5,6, même si la plupart des études récentes ARGUe l&#39;absence d&#39;apprentissage vocal 7). Des souris de laboratoire ont été trouvés pour émettre vocalisations ultrasoniques dans les relations mère-enfant, dans les interactions socio-sexuelle mâle-femelle, dans les interactions sociales de même sexe (revue en référence 8) et dans les interactions sociales 9 juvéniles-juvénile. Chiots souris émettent des appels d&#39;isolement pendant les deux premières semaines de la vie quand elle est isolée du barrage et littermates 10. Les mâles émettent des vocalisations ultrasonores lorsqu&#39;il est en présence d&#39;une femelle oestrus (ou indices urinaires de son) 11,12. Les mâles et les femelles émettent une vocalisation ultrasonique lors de l&#39; interaction avec un congénère inconnu du même sexe 13,14. L&#39;organisation et les fonctions de ces vocalisations ne sont pas complètement claires et doivent d&#39;autres investigations. Les connaissances actuelles sur l&#39;aspect fonctionnel est limité à l&#39;explicitation du comportement de récupération chez les mères entendre les appels d&#39;isolement des petits, la facilitation de la proximité des femelles adultes vers vocalizat mâle adulteions 15 et le comportement exploratoire accru des hommes adultes auditifs adultes vocalisations femmes 16. Caractériser les anomalies dans la communication vocale dans des modèles murins de troubles neuropsychiatriques devrait être effectuée dans des conditions normalisées pour exclure la contribution majeure des conditions expérimentales. Ces caractérisations, combinées à l&#39;évaluation des interactions sociales simultanées et des études neurobiologiques, dans divers modèles génétiques devraient améliorer nos connaissances sur la contribution génétique aux différents aspects de la communication par ultrasons de la souris. Sur une longue période, il devrait donner plus de lumière sur certaines bases neurobiologiques de la communication sociale chez les humains. Nous visons actuellement à fournir des protocoles simples à obtenir de manière fiable vocalisations ultrasoniques au cours du développement et à l&#39;âge adulte pour les souris mâles et femelles dans le laboratoire. Ces protocoles devraient faciliter la normalisation des enregistrements à comparer de façon plus fiable ultrles émissions de vocalisation Asonic entre les souches et les laboratoires. Il devrait également faciliter la mise en place de ces enregistrements dans les laboratoires ayant aucune expérience préalable avec la souris vocalisations ultrasoniques enregistrements. Nous soulignons également la possibilité actuelle de combiner les données de vocalisations ultrasoniques avec des données comportementales détaillées collectées simultanément au cours des interactions sociales chez les souris adultes, afin d&#39;obtenir des informations cruciales sur les déficiences sociales, ainsi que sur le contexte de l&#39;émission des vocalisations ultrasoniques. Ces analyses permettront un éclairage nouveau sur l&#39;organisation et les fonctions des vocalisations ultrasoniques de souris. Enfin, nous annonçons également la possibilité de partager des enregistrements de vocalisation ultrasonique avec toute la communauté scientifique sur la base de données mouseTube (http://mousetube.pasteur.fr). Accès libre aux données d&#39;enregistrement audio devrait stimuler la connaissance sur la communication par ultrasons de la souris en permettant aux scientifiques de comparer leurs propres données avec vocalisations ultrasoniques enregistrées dans d&#39;autres laboraratoires (avec des souches / protocoles similaires ou différents), et / ou de contester leurs méthodes d&#39;analyse avec les fichiers enregistrés dans des conditions différentes.

<table><tbody><tr><td>aiguilles 0,3 mm x 13 mm [30&nbsp ; G 1/2"]</td><td>BD Microlance</td><td>304000-pâte</td><td></td></tr> à <tr><td>tatouer verte</td><td>Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada</td><td>329AA-thermomètre</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisherbrand, Waltham, USA</td><td>4126 (W255NA)</td><td>-</td></tr><tr><td>chambre insonorisée faite maison (chiots)</td><td>Institut Pasteur,</td> <td>Paris-mousse</td> <td>acoustique + plexiglas ; dimensions intérieures (L x H x P) : 32 cm x 33 cm x 32 cm</td></tr><tr><td>thermister de petite surface + thermocouple à sonde unique</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td> <td>599814 + stylo</td></tr> <tr><td>inodore</td> 601956 <td>par exemple : Giotto-ink</td><td></td> <td>à l’eau, lavable : ces stylos sont conçus pour les bébés</td></tr><tr><td>Éthanol absolu (100 %)</td><td>Sigma Aldrich,&nbsp ; Saint-Quentin Fallavier, France</td><td>24103</td><td>dilué 1/10</td></tr><tr><td>Microphone à ultrasons à condensateur Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Allemagne</td><td>#40011</td><td>fourni avec des câbles d’extension par la société Avisoft</td></tr><tr><td>Ultrasound Gate 416H</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Allemagne</td><td>#34163</td><td>carte son</td></tr><tr><td>Avisoft Recorder USGH</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Allemagne</td><td>#10301 ; #10302</td><td>logiciel d’enregistrement pour Windows Vista, 7 et 8</td></tr><tr><td>Avisoft SASLab Pro</td><td>Avisoft Bioacoustics, Berlin, Allemagne</td><td>#10101, 10111 ; #10102, 10112 ; &nbsp ;</td><td>Windows 10, 8.1, 8, 7 ou Vista, y compris les Apple Macintosh à processeur Intel exécutant Boot Camp, Parallels ou un logiciel de virtualisation similaire.</td></tr><tr><td>Ordinateur portable ou Apple Macintosh exécutant Boot Camp</td> <td>-</td><td></td> <td>fonctionnant sous Windows 10, 8.1, 8, 7 ou Vista ; pour l’Apple Macintosh, Boot Camp est préféré aux logiciels de virtualisation tels que Parallels en raison de contraintes de mémoire</td></tr><tr><td>Destinataire en plastique (enregistrements de chiots)</td><td>Verrouiller et Lock, Chatswood, États-Unis</td><td>HPL932D</td><td>Lock & Lock Conteneur hermétique empilable rond 700&nbsp ; Ml; utiliser sans le couvercle ; Dimensions : 9&nbsp ; cm de diamètre, 10 cm de hauteur</td></tr><tr><td>PBS 1x (pH = 7,4)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10010-023-slides</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Menzel-Gl&auml ; ser, Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>May-Gr&uuml ; solution nwald 500 ml</td><td>RAL R&eacute ; actifs, Martillac, France</td><td>320070-0500-Giemsa</td><td></td></tr> <tr><td>R 500 ml</td><td>RAL R&eacute ; actifs, Martillac, France</td><td>720-1107</td><td>dilué 1/20 dans une solution tampon de phosphate</td></tr><tr><td>Solution tampon de phosphate (faite maison)</td><td>-</td><td>-</td><td>pH = 7, 0,1 M : 39 ml NaH2PO4 0,2 M + 61 ml de Na2HPO4 0,2 M + 100&nbsp ; ml H2O (volume final : 200&nbsp ; </td></tr><tr><td>Cage d’essai</td><td>Institut Pasteur,</td> <td>Paris-50</td><td>&nbsp ; x&nbsp ; 25 ans ; cm, 30&nbsp ; cm de hauteur ; Chambre</td></tr> insonorisée en plexiglas <tr><td>(enregistrements adultes)</td><td>Institut Pasteur, Paris-mousse</td><td></td> <td>acoustique + PVC ; dimensions intérieures (L x H x P) : 66 cm x 90 cm x 46 cm</td></tr><tr><td>Caméra vidéo</td><td>de Noldus Information Technologies, Wageningen, Pays-Bas</td><td></td> <td>Caméra vidéo haute résolution CamTech Super-Hi-Res ; 25 ips&nbsp ;</td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus Information Technology, Wageningen, Pays-Bas</td><td>http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt</td><td>logiciel d’acquisition vidéo</td></tr><tr><td>Mice Profiler Tracker plugin de la plateforme ICY</td><td>Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker</td><td>logiciel de suivi pour analyser les événements comportementaux lors des interactions sociales</td></tr></tbody></table>

enregistrement souris vocalisations ultrasoniques pour évaluer la communication sociale

Recording Mouse Ultrasonic Vocalizations to Evaluate Social Communication

Les souris émettent des vocalisations ultrasonores dans différents contextes tout au long du développement et à l’âge adulte. Ces signaux vocaux sont aujourd’hui utilisés comme approximations pour modéliser les bases génétiques des déficits de communication vocale. La caractérisation du comportement vocal de modèles murins porteurs de mutations dans les gènes associés à des troubles neuropsychiatriques tels que les troubles du spectre autistique permettra de comprendre les mécanismes conduisant aux déficits de communication sociale. Nous fournissons ici des protocoles pour provoquer de manière fiable des vocalisations ultrasonores chez les petits et chez les souris adultes. Cette normalisation contribuera à réduire la variabilité entre les études en raison des contextes expérimentaux. Les cris d’isolement des petits sont enregistrés tout au long du développement à partir de petits isolés de la mère et de leurs compagnons de portée. À l’âge adulte, les vocalisations sont enregistrées lors d’interactions homosexuelles (sans composante sexuelle) en exposant des mâles ou des femelles socialement motivés à un congénère inconnu du même sexe. Nous fournissons également un protocole pour enregistrer les vocalisations des mâles adultes exposés à une femelle en œstrus. Dans ce contexte, il y a une composante sexuelle dans l’interaction. Ces protocoles sont établis pour provoquer une grande quantité de vocalisations ultrasonores chez les souris de laboratoire. Cependant, nous soulignons l’importante variabilité interindividuelle du comportement vocal des souris, qui doit être prise en compte en enregistrant un nombre minimal d’individus (au moins 12 dans chaque condition). Ces enregistrements de vocalisations ultrasonores sont utilisés pour évaluer le taux d’appels, le répertoire vocal et la structure acoustique des appels. Les données sont combinées à l’analyse d’enregistrements vidéo synchrones pour fournir une vue plus complète de la communication sociale chez la souris. Ces protocoles sont utilisés pour caractériser les déficits de communication vocale chez les souris dépourvues de ProSAP1/Shank2, un gène associé aux troubles du spectre autistique. D’autres enregistrements de vocalisations ultrasonores peuvent également être trouvés sur la base de données mouseTube, développée pour favoriser l’échange de ces données.

Avec les présents protocoles, nous avons caractérisé le comportement vocal des souris dépourvues ProSAP1 / SHANK2, un gène associé à des troubles du spectre autistique (TSA) 23-25. ASD se caractérisent par des déficits dans la communication sociale et les comportements stéréotypés 1. Nos SHANK2 - / - souris affichent l&#39; hyperactivité, l&#39; augmentation de l&#39; anxiété et la communication vocale atypique 18,26. En effet, nous avons constaté que SHANK2 - / - souris affiche un profil de développement atypique dans leur taux d&#39;appels d&#39;isolement de chiot d&#39;émission par rapport à l&#39;inverse courbe typique en forme de U dans leurs congénères de type sauvage SHANK2 -. / - Souris affiche un taux d&#39;appel a augmenté à P4 et une diminution de taux d&#39;appel à P6 en comparaison avec leurs congénères de type sauvage (figure 2). Nous avons également observé un taux d&#39;appel a diminué dans les interactions femelles impliquant un SHANK2 - / - femelle dans COMPARAISOn avec des interactions impliquant un littermate de type sauvage (Figure 2). Nous avons examiné le répertoire des 5 catégories d&#39;appels différents. Il a semblé être différent entre les petits (par exemple ici P2, P6 et P10) et les adultes (figure 3). différences liées Génotype-étaient significatives pour la plupart à l&#39;âge adulte. Pendant les interactions sociales impliquant des adultes SHANK2 - / - mâles ou des femelles avec un C57BL / 6N femelle, appels plus courts et des appels non structurés ont été enregistrés par rapport aux interactions impliquant leurs congénères de type sauvage (Figure 3D et E). Appels et la fréquence des sauts moins complexes appels ont également été enregistrées au cours des interactions avec C57BL / 6N femme impliquant SHANK2 adulte - / - femelles par rapport aux interactions impliquant SHANK2 + / + femelles (Figure 3E). Enfin, nous avons également mesuré les variables acoustiques manuellement. Il n&#39;y avait pas liée génotype différence significative dule développement de l&#39;anneau. En revanche, la durée des appels enregistrés au cours des interactions impliquant des SHANK2 adultes - / - femelles étaient plus courtes que celles enregistrées au cours des interactions impliquant leurs congénères de type sauvage (figure 4A). Nous avons également souligné que la fréquence maximale de vocalisations ultrasoniques a augmenté au cours du développement des petits sans différence significative liée génotype-26. Pendant les interactions impliquant SHANK2 - / - mâles ou femelles avec C57BL / 6N femelle, vocalisations ultrasoniques avaient une fréquence de crête inférieure en comparaison avec les appels enregistrés pendant les interactions impliquant leurs congénères de type sauvage (figure 4B). En outre, le présent Protocole a également permis d&#39;étudier le contexte de l&#39; émission des vocalisations ultrasoniques en combinant les données à partir d&#39; enregistrements audio aux données comportementales extraites de MiceProfiler (logiciel ICY, Institut passéeseur, Paris). Par exemple, dans les interactions femmes-femmes, la plupart des vocalisations ultrasoniques ont été émis lorsque les animaux étaient en contact et plus précisément l&#39;occupant renifler la région ano-génitale du nouveau venu, ou au moins l&#39;occupant étant derrière le nouveau venu. Les souris également émis de nombreuses vocalisations ultrasoniques lorsque l&#39;occupant a approché le nouveau venu (figure 5, panneau supérieur). Moins vocalisations ont été enregistrés lorsque le SHANK2 des occupants - / - souris ont été en contact physique avec le nouveau venu (par exemple, reniflant la région ano-génitale du nouveau venu) que lorsque l&#39;occupant est une souris de type sauvage. Moins vocalisations ont été déclenchées lorsque l&#39;occupant derrière le nouveau venu était un SHANK2 - / - souris que quand il était une souris de type sauvage. Plus de vocalisations ont également été enregistrés au moment où le nouveau venu était dans le champ visuel de la souris de l&#39; occupant, et plus encore dans les types sauvages que dans les mutants (figure 5, panneau inférieur). s = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig2.jpg" /> Figure 2:. Taux d&#39;émission des vocalisations ultrasoniques au cours du développement et chez les mâles adultes et SHANK2 femme - / - souris et littermates de type sauvage taux de chiots Appel (tous les deux jours de P2 à P12, n = 18-19 SHANK2 + / +, n = 15-16 SHANK2 - / -) et les adultes au cours mâle-oestrus interactions femelles (n = 15 SHANK2 + / +, n = 16 SHANK2 - / -) et les interactions femme-femmes (n = 15 SHANK2 + / +, n = 13 SHANK2 - / -) chez les souris de type sauvage (panneau de gauche) et SHANK2 - / - souris (panneau de droite). Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM et des points individuels (non apparié tests de Wilcoxon: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001).ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig3.jpg" /> Figure 3:. Répertoire vocal de SHANK2 - / - souris et littermates de type sauvage Proportions des cinq différents types d&#39;appels émis par les petits P2 (A; n = 20 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), chiots P6 (B; n = 19 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), chiots P10 (C; n = 20 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), les mâles adultes avec une femelle oestrus (D n = 16 SHANK2 + / +, n = 16 SHANK2 - / -) et les femelles adultes avec une autre femelle (E; n = 15 SHANK2 + / +, n = 13 SHANK2 </em&gt; - chez les souris de type sauvage (panneaux de gauche) et SHANK2) - - / / - souris (panneaux de droite). Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM et des points individuels (tests de chi carré: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig4.jpg" /> Figure 4:. Les variables acoustiques extraites de vocalisations ultrasoniques dans SHANK2 - / - souris et littermates de type sauvage (A) Durée de tous les types d&#39;appels confondus émis par les petits P2 (n = 20 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / - ), les petits P6 (n = 19 SHANK2 + / +, n = 18 SHANK2 - / -), les petits P10 (n = 20 SHANK2 + / + </sup&gt;, n = 18 SHANK2 - / -), les mâles adultes avec une femelle oestrus (n = 16 SHANK2 + / +, n = 16 SHANK2 - / -) et les femelles adultes avec une autre femelle (n = 15 SHANK2 + / +, n = 13 SHANK2 - / -) chez les souris de type sauvage ( à gauche) et SHANK2 - / - souris (panneau de droite). (B) la fréquence maximale de crête mesurée sur tous les types d&#39;appels confondus dans les chiots P2, P6 chiots, chiots P10, les mâles adultes avec une femelle oestrus et femelle adulte avec une autre femelle (même Ns comme ci - dessus). Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM et des points individuels (non appariés teste Wilcoxon: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig5.jpg" /> Figure 5: Contexte. s d&#39;émission des vocalisations ultrasoniques de souris dans les interactions adulte femelle-femelle sociale Proportion des vocalisations ultrasoniques émises par des paires comportant un SHANK2 + / + une / souris 6N C57BL (n = 16, A) et les paires comportant une SHANK2 - / - avec a / souris 6N C57BL (n = 13, B) pendant les types d&#39;événements comportementaux suivants (rouge: occupant, vert: nouveau venu): contacts sociaux, oro orale contact, ano-génitales sniffing de la souris occupant, ano- génitales renifler de la souris nouveau venu, occupant derrière nouveau venu, nouveau venu derrière l&#39;occupant, l&#39;immobilité de l&#39;occupant, l&#39;immobilité du nouveau venu, l&#39;approche de l&#39;occupant et échapper au nouveau venu, l&#39;approche du nouveau venu &amp; échapper à l&#39;occupant, l&#39;approche et échapper à l&#39;occupant, l&#39;approche et échapper au nouveau venu, occupant suivant le nouveau venu, nouveau venu dans le domaine de l&#39;occupant, occupant la vision dans le domaine du nouveau venu vision. Les données sont pressentie comme moyenne +/- SEM et des points individuels (tests non apparié de Wilcoxon: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01). Les données non publiées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> types d&#39; appels </td><td> La description </td></tr><tr><td> court </td><td> durée ≤5 msec et la fréquence gamme ≤6.25 kHz </td></tr><tr><td> simple </td><td> durée&gt; 5 ms et la fréquence gamme ≤6.25 kHz (plat), ou la modulation de fréquence dans une seule direction (vers le haut ou vers le bas) avec la gamme de fréquence&gt; 6,25 kHz </td></tr><tr><td> complexe </td><td> modulations de fréquence dans plus d&#39;une direction et de fréquence&gt; 6,25 kHz (modulation), ou l&#39;inclusion d&#39;un ou plusieurs autres fréquences component (phénomènes harmoniques ou non-linéaires, mais pas de saturation), mais aucune contrainte sur la gamme de fréquences (complexe) </td></tr><tr><td> sauts de fréquence </td><td> inclusion d&#39;un saut (un saut de fréquence) ou plusieurs sauts (sauts de fréquence, d&#39;autres) en fréquence sans intervalle de temps entre les composantes de fréquence consécutives, avec (mixte) ou sans une partie bruyante au sein de l&#39;appel de son pur </td></tr><tr><td> non structurées </td><td> pas identifiable composant son pur; appels &quot;bruyants&quot; </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Caractéristiques des cinq types de vocalisations ultrasoniques de souris Des exemples de critères de durée, gamme de fréquences, modulations de fréquence et de sauts de fréquence utilisées pour déterminer 5 différents types d&#39;appel au sein de vocalisations ultrasoniques de souris.

Les vocalisations ultrasonores de souris sont utilisées comme substituts pour modéliser les bases génétiques des déficits de communication vocale dans les modèles murins pour les troubles neuropsychiatriques. Le présent protocole décrit trois contextes expérimentaux qui déclenchent de manière fiable des vocalisations ultrasonores chez les petits (tout au long du développement) et les souris adultes (interactions entre personnes du même sexe, interactions entre mâles et femelles avec œstrus).

Enregistrement souris vocalisations ultrasoniques pour évaluer la Communication Sociale

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies ...

L’objectif global de ce protocole est d’enregistrer et d’analyser les vocalisations ultrasonores de bébés souris ou d’adultes, puis de rendre les données accessibles au public dans la base de données mouseTube. Nous avons donc précédemment identifié des mutations dans l’autisme, alors nous voulons maintenant comprendre le rôle de ces gènes. Nous utilisons des modèles de souris, et surtout, nous étudions la vocalisation ultrasonore des souris.Ce modèle peut aider à comprendre des questions clés dans le domaine des neurosciences. Par exemple, comment les mutations génétiques affectent la communication sociale dans un modèle murin pour les troubles neuropsychotiques tels que l’autisme. Le principal avantage de ce protocole est que les vocalisations d’adressage de la souris sont provoquées de manière fiable.Il devrait favoriser une standardisation des informations contextuelles pour améliorer la comparaison entre les études. Cette méthode permettra également d’améliorer les connaissances sur la communication intrasonique chez la souris à l’aide de la base de données mouseTube. Après avoir préparé les souris et obtenu les chiots nouveau-nés, installez une cage pour enregistrer leurs appels.Utilisez une boîte insonorisée ou une boîte en polystyrène. Tout d’abord, installez un thermomètre pour surveiller la température interne. Ensuite, à travers un trou dans le haut de la boîte, abaissez un microphone à ultrasons à condensateur de sorte que la membrane du microphone soit à environ 12 à 15 centimètres au-dessus du sol.Maintenant, connectez le microphone à une carte son d’ordinateur. Placez le chiot non expérimental dans un support en plastique propre à l’intérieur de la boîte d’enregistrement et fermez-le. Faites en sorte que le son d’enregistrement de pointe utilise toute l’amplitude disponible sans distorsion.Ne modifiez pas ce paramètre pendant l’expérience. Maintenant, pour des mesures expérimentales, placez le chiot aussi doucement et rapidement que possible dans un gobelet en plastique propre. Ensuite, placez le chiot sous le microphone et fermez la boîte aussi doucement et silencieusement que possible.Ensuite, effectuez un enregistrement 16 bits, 300 kilohertz pour un ensemble de données de haute qualité. Après jusqu’à cinq minutes d’enregistrement, retirez le chiot. Prenez note de son tatouage de patte, puis mesurez la température de sa peau à l’aide d’un thermomètre numérique.Maintenant, faites une petite marque sur le chiot à l’aide d’encre à base d’eau et remettez-le dans son nid. Entre les tests, lavez la tasse avec de l’éthanol à 10 % et laissez-la sécher complètement. Pour une cage d’essai adulte, utilisez une cage en plexiglas qui s’insère dans une boîte insonorisée éclairée par une lumière blanche de faible intensité.Nettoyez la cage avec de l’eau savonneuse, séchez-la et remplissez-la de deux centimètres de litière fraîche. Fixez le microphone dans un coin de la cage et ajustez l’angle du microphone pour capturer les sons de toute la cage. Ensuite, placez une caméra vidéo sur la chambre insonorisée afin qu’elle puisse voir la surface de la cage d’essai sans que le microphone n’obscurcisse un coin.À l’aide d’une paire d’animaux non expérimentaux, réglez le gain de l’enregistrement comme précédemment. Pour l’expérience, introduisez d’abord un animal dans la cage pour remplir le rôle d’occupant. Laissez-le s’habituer pendant 20 minutes.Un enregistrement de référence peut être effectué pendant cette période. Ensuite, commencez les enregistrements vidéo et audio, et présentez le deuxième animal du même sexe pour remplir le rôle de nouveau venu. Synchronisez les enregistrements en déclenchant un bip sonore lorsque le second touche la cage.Enregistrez les interactions avec les animaux aussi longtemps que nécessaire, par exemple quatre minutes. Pour vous préparer à ce test, tôt le matin du jour du test, faites des frottis vaginaux de chaque femelle afin de déterminer leur statut dans le cycle de l’œstrus. Tenez la femelle par la queue et laissez-la s’agripper à la grille de la cage.À l’aide d’une pipette, rincez son vagin plusieurs fois en injectant et en prélevant 20 microlitres de PBS. Faites attention au PBS lorsqu’il est évacué du vagin. Lorsqu’il est légèrement trouble, il contient suffisamment de cellules.Faites-le avec précaution pour éviter de créer du mucus. Étalez l’échantillon sur une lame. Jusqu’à quatre peuvent être examinés à la fois.Laissez sécher les échantillons avant de continuer. Sous une hotte, incubez les lames dans un bain de solution de May-Grunwald à 0,1 molaire dans du PBS pendant trois minutes. Ensuite, transférez les lames dans un bain PBS pendant une minute.Ensuite, transférez les lames dans un bain de 5 % en poids par volume Giemsa R dans PBS. Après 10 minutes, rincez les lames dans du PBS frais pendant une minute supplémentaire. Ensuite, examinez les lames tachées.Si l’échantillon ne montre que de grandes cellules épithéliales cornées qui n’ont pas de noyau et qui sont colorées en bleu, la femelle est en plein œstrus. Seules ces femelles peuvent être utilisées pour le test. Maintenant, installez la cage d’essai avec le mâle comme occupant.Laissez-le s’habituer pendant 10 minutes et faites un enregistrement audio de base si nécessaire. Ensuite, commencez les enregistrements vidéo et audio et présentez la femelle en plein œstrus. Synchronisez les enregistrements comme avant à l’aide d’un bip.Ensuite, laissez les animaux interagir aussi longtemps que nécessaire, par exemple pendant une période de quatre minutes. Une fois l’enregistrement terminé, remettez les souris dans leurs cages respectives. Pour télécharger des données sur le site mouseTube de l’Institut Pasteur, connectez-vous d’abord.Vérifiez si la souche de souris enregistrée existe dans la base de données mouseTube en cliquant sur le bouton Souches. Si ce n’est pas le cas, demandez aux administrateurs de le créer. Ensuite, créez des sujets animaliers.Entrez les codes d’identification des animaux enregistrés. Rassemblez-les en groupes pour faciliter la récupération ultérieure des données. Ensuite, fournissez une description du protocole utilisé.Maintenant, créez une expérience pour chaque session d’enregistrement. Précisez le protocole, le groupe d’individus qui a été enregistré, le matériel et les logiciels utilisés, ainsi que leurs spécificités. L’expérience rassemble toutes les métadonnées correspondant aux fichiers de vocalisation.Ensuite, créez le lien vers les fichiers de vocalisation. Tout d’abord, sélectionnez l’expérience dans la liste. Ensuite, copiez et collez l’URL du fichier de vocalisation dans le champ correspondant de la colonne Fichiers à lier.Il est possible que le lien que vous mettez vers cette base de données ne soit pas vraiment bon. Assurez-vous que le serveur hébergeant vos fichiers de vocalisation est accessible de l’extérieur de votre établissement pour les membres de la communauté. Dans la section Détails, dans la section Notes, à fournir au besoin.Par exemple, spécifiez qu’un lien vers un fichier vidéo qui accompagne un fichier audio a été saisi. Enfin, après avoir effectué les entrées, validez-les. Il n’est pas nécessaire de remplir chaque case pour chaque fichier.Si nécessaire, modifiez les liens saisis. Des souris dépourvues d’expression de Shank2, un gène associé aux troubles du spectre autistique, ont été caractérisées. Ces souris ont montré une communication vocale atypique, d’abord observable sous la forme d’une diminution du taux d’appels dans les interactions féminines.Ensuite, le répertoire standard de cinq appels qui changent du chiot à l’âge adulte a été évalué. Les mesures ont d’abord été effectuées avec des chiots P2. Le répertoire vocal n’a pas changé chez les chiots P6.À la P10, le répertoire vocal était toujours le même. Jusqu’à présent, il n’y avait pas beaucoup de déficit montré par les souris nulles Shank2. Cependant, à l’âge adulte, des différences liées au génotype sont devenues apparentes.Lorsque les mâles interagissaient avec les femelles en œstrus, il y avait une augmentation notable de la proportion d’appels courts et non structurés émis par des mâles mutants. Dans les modèles de cris entendus entre femelles, les femelles nulles Shank2 ont émis plus de cris courts et non structurés, ainsi que des appels moins complexes et moins de cris de saut de fréquence lorsqu’elles étaient appariées à des femelles normales. Paires de souris nules Shank2, mâles ou femelles, vocalisées avec une fréquence de crête plus faible que les paires de compagnons de portée de type sauvage.La synchronisation de l’analyse des événements comportementaux et de l’émission de vocalisations a permis d’identifier des altérations dans le cadre de l’émission de vocalisations ultrasonores chez les souris mutantes. Les souris nuls Shank2 vocalisent moins souvent lorsqu’elles sont en contact physique avec des nouveaux arrivants, et plus particulièrement lorsqu’elles reniflent la région anogénitale. D’autres vocalisations ont été entendues lorsque les nouveaux arrivants étaient dans le champ visuel des souris nulles Shank2.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer les vocalisations ultrasonores de la souris et de télécharger des données dans la base de données mouseTube. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’enregistrer suffisamment d’individus préconditionnés compte tenu de la hauteur et de la viabilité interne de la barrière vocale de la souris.

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