Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

L'objectif général de l'application de ces approches de immunoprécipitation de la chromatine à des cellules souches embryonnaires en cours de différenciation ou à des tissus embryonnaires cardiaques est de découvrir la régulation épigénétique du développement cardiaque. Étant donné que le réglage fin de la transcription des gènes au cours du développement embryonnaire du cœur est contrôlé par des composants épigénétiques, l'immunoprécipitation de la chromatine constitue une approche adaptée pour comprendre ce processus.

Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons cibler spécifiquement un locus et examiner les marques épigénétiques présentes sur ce fragment d'ADN précis. Cette méthode peut fournir des informations sur la régulation épigénétique du développement cardiaque. Elle peut également être appliquée à d'autres organes ou à tout type cellulaire.

Ceci est Imen. Elle est étudiante au doctorat dans le laboratoire et elle ferait l'expérience aujourd'hui. Cette procédure utilise des cellules souches embryonnaires ou cellules ES.

Corps embryonnaires générés à partir de cellules ES et tissus cardiaques embryonnaires disséqués à partir d'embryons de souris E9,5. Fixer les cellules et les tissus. Utiliser du formaldéhyde à 1 % dans du PBS pour les cellules et un tampon de perméabilisation PB2 pour les tissus embryonnaires.

Placer les tubes sur un agitateur orbital à une vitesse de 60 tr/min à température ambiante pendant exactement 10 minutes. Arrêter la réaction de réticulation en ajoutant de la glycine jusqu'à une concentration finale de 125 millimolaire et incuber pendant cinq minutes à température ambiante sur l'agitateur orbital à une vitesse de 60 tr/min. Pour commencer cette procédure, resuspendre le culot dans 10 millilitres de PBS.

Et les tissus embryonnaires dans un millilitre de PB2. Centrifuger à 1000 ×g pendant cinq minutes à 4 °C. Jeter le surnageant et ajouter le tampon respectif pour un deuxième lavage.

Ajouter des inhibiteurs de protéase aux tampons PB1 et PB2 sur glace. Ajouter un millilitre de tampon PB1 complété par des inhibiteurs de protéase au culot cellulaire et pipeter plusieurs fois de haut en bas pour resuspendre les cellules. De la même manière, resuspendre les tissus embryonnaires dans un millilitre de tampon PB2 complété par des inhibiteurs de protéase.

Ensuite, utilisez une seringue d'un millilitre munie d'une aiguille de calibre 21 pour homogénéiser les cellules ou les tissus. Transférez la suspension cellulaire dans un tube propre de 1,5 millilitre. Incubez les cellules et tissus homogénéisés à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Centrifuger à 3000 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et resuspendre chaque culot dans 300 microlitres du tampon de sonication respectif, supplémenté avec des inhibiteurs de protéases. Transférer la suspension cellulaire dans un tube certifié sans RNase, sans DNase et sans pyrogène afin d'éviter toute dégradation de l'ADN, puis incuber de 15 à 30 minutes sur de la glace.

Pour cisailler la chromatine, soniquez les échantillons à quatre degrés Celsius en utilisant le programme de sonication approprié pour chaque matériau. Ajustez la durée de la sonication selon que l'ADN sera utilisé pour la PCR ou le séquençage. Ensuite, centrifugez les lysats cellulaires soniqués pendant 10 minutes.

Transférez le surnageant, qui correspond à la chromatine en solution, de chaque échantillon dans un tube propre de 1,5 millilitre et jetez le culot. Prélevez un aliquot de 1,5 microlitre de chaque échantillon et diluez-le 1:10 avec de l'eau. Évaluez la densité optique de tous les échantillons à l'aide d'un nanospectrophotomètre afin de déterminer la concentration en protéines.

Avant la chromatine immunoprécipitation, préparez les billes conjuguées à la protéine A en les lavant comme décrit dans le texte du protocole. Dans un tube propre de 1,5 millilitre, mélangez l'anticorps dirigé contre les histones modifiées ou les facteurs de transcription, 20 microlitres des billes conjuguées à la protéine A lavées et un millilitre de tampon C supplémenté en inhibiteurs de protéases. Incubez les échantillons sur un agitateur rotatif à 40 tr/min pendant au moins deux heures à quatre degrés Celsius.

Lavez les complexes d'anticorps liés aux billes trois fois avec un millilitre de tampon C, comme décrit dans le texte du protocole. Préparez deux tubes, l'un contenant 150 microgrammes de chromatine et les complexes d'anticorps liés aux billes, l'autre contenant 150 microgrammes de chromatine et 20 microlitres de billes lavées. Ajoutez un millilitre de tampon C supplémenté d'inhibiteurs de protéase à chaque tube et incubez les échantillons sur une roue rotative à 40 tr/min toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Lorsque l'immunoprécipitation de nuit est terminée, placer les échantillons sur le support magnétique et récupérer le surnageant contenant l'anticorps non lié à la chromatine. Éluer la protéine liée à l'anticorps en ajoutant 150 microlitres de tampon D1 aux matériaux lavés. Incuber les échantillons pendant 20 minutes à 50 degrés Celsius dans un bloc chauffant.

Après 20 minutes, retirez les échantillons du bloc chauffant et placez-les sur le support magnétique. Récupérez le surnageant dans un tube propre de 1,5 millilitre et éliminez les billes. Pour inverser la réticulation, ajoutez du chlorure de sodium à cinq molaire au surnageant afin d'obtenir une concentration finale de 200 millimolaire.

Préparez un échantillon témoin de chromatine dans un tube propre de 1,5 millilitre. Utilisez la même quantité de chromatine que celle utilisée pour l'échantillon d'immunoprécipitation, dans un volume final de 150 microlitres d'eau libre de RNase et de DNase, et ajoutez du chlorure de sodium à cinq molaire afin d'obtenir une concentration finale de 200 millimolaire. Incubez les échantillons toute la nuit à 65 degrés Celsius.

Le jour suivant, retirez les échantillons du bloc chauffant. Ajoutez de l'EDTA à une concentration finale de 12,5 millimolaire et de la protéinase K à une concentration finale de 250 microgrammes par millilitre, puis effectuez une digestion à 55 degrés Celsius pendant deux heures. Commencez cette procédure en préparant les billes.

Tout d'abord, laissez les billes atteindre la température ambiante pendant au moins 30 minutes. Ensuite, vortexez soigneusement les billes et pipetez rapidement un millilitre de billes dans un tube propre de 1,5 millilitre. Placez le tube contenant les billes sur l'aimant pendant deux à trois minutes afin que la solution s'éclaircisse, puis jetez le surnageant.

Retirer le tube de l'aimant. Ajouter un millilitre de EDTA 0,5 M et mélanger par vortexage bref. Laver les billes deux fois de cette manière et éliminer le surnageant après le dernier lavage.

Retirer le tube de l'aimant. Ajouter un millilitre de tampon E et redisperser lentement les billes. Transférer l'ensemble du mélange dans 50 millilitres de tampon E. Placer sur un agitateur et laisser mélanger doucement à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, tester les billes de liaison à l'ADN à l'aide d'un marqueur d'ADN de 1 kb et de trois rapports différents entre le volume de billes et le volume d'ADN. Le rapport 2,5/1 s'est révélé le plus efficace pour la liaison de l'ADN. Pour utiliser les billes dans la purification de l'ADN, ajouter 425 microlitres, soit 2,5 volumes, de billes à chaque échantillon d'ADN et resuspendre lentement en pipetant environ 10 fois vers le haut et vers le bas.

Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Placer sur l'aimant pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer et jeter le surnageant.

Laver deux fois avec de l'éthanol 80 % fraîchement préparé en ajoutant 600 microlitres à chaque tube. Attendre une minute, puis aspirer et jeter le surnageant. Faire une courte centrifugation des tubes.

Placez les tubes sur l'aimant. Retirez les dernières gouttes d'éthanol et laissez sécher une minute à température ambiante. Retirez l'échantillon de l'aimant et éluisez l'ADN en ajoutant 20 microlitres d'eau libre de DNase et de RNase. Vortexez.

Une électrophorèse sur gel d'agarose a révélé la taille des fragments d'ADN obtenus après réversibilité de la réticulation de l'ADN soniqué total extrait de cellules souches embryonnaires murines, de corps embryonnaires et de tissu cardiaque embryonnaire. Une expérience de immunoprécipitation de chromatine a été conçue afin d'étudier la régulation épigénétique des gènes impliqués dans la transition épithélio-mésenchymateuse dans des cellules de type sauvage ou mutées génétiquement, lorsque les cellules souches se différencient vers un destin cellulaire mésodermique. La liaison d'histones modifiées a été suivie par PCR des promoteurs ou des activateurs des gènes E-Cadhérine et Twist.

Une immunoprécipitation chromatinienne séquentielle a été réalisée sur de la chromatine extraite de quatre lignées de cellules souches embryonnaires humaines à l'aide d'anticorps dirigés contre une marque d'activation chromatinienne, suivis d'anticorps dirigés contre une marque de répression. Ces marques sont modifiées lorsque les cellules sont exposées à des morphogènes, mais varient selon les lignées de cellules souches embryonnaires humaines, probablement en raison des blastocystes d'origine dont elles sont dérivées.

La précipitation immunologique de la chromatine peut également être appliquée à la chromatine extraite de régions cardiaques embryonnaires spécifiques. Cette figure montre des régions génomiques des gènes cardiaques Nkx2.5 et TBx5 enrichies en histone modifiée, ainsi qu'une région génomique du gène spécifique du marqueur cardiaque Shox2, non enrichie et non exprimée dans le ventricule. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de mesurer l'efficacité de la sonication avant de commencer le protocole d'IP. Après cette procédure, d'autres méthodes comme Eth-ek-se-ek peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'interrogation de l'état ancien de la chromatine, qu'elle soit ouverte ou fermée, ou le suivi de l'espacement des nucléosomes. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'épigénétique pour explorer tout mécanisme de régulation épigénétique des décisions du destin cellulaire dans tout type cellulaire ou organe embryonnaire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière dont les dosages d'immunoprécipitation de la chromatine peuvent être réalisés.