Name: TRUE Gene Silencing: Projection dun heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez le criblage d'une bibliothèque d'ARN guide heptamère pour identifier des agents thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Cette méthode optimise la découverte de médicaments ciblés.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le Programme de transfert Adaptable et de la technologie Seamless par la R &amp; D, la technologie Agence japonaise pour la science et le Fonds de promotion de la recherche en sciences de la Société de promotion et d&#39;aide mutuelle pour les écoles privées du Japon Target-driven, et les numéros JSPS KAKENHI Grant 24300342 et 15H04313 .

1. Construction d&#39;un type heptamère ARNsg Library <ol><li> Sélectionnez un sous - ensemble des 16.384 (4) 7 séquences 7 nt moins que la bibliothèque à grande échelle doit être construite. NOTE: Les séquences peuvent être aléatoires et / ou conçu pour cibler des ARN cellulaires spécifiques. Pour ce dernier, trouver des structures en épingle à cheveux ressemblant à la T-bras de l&#39; ARNt dans un ARN cible à l&#39;aide d&#39;un programme approprié d&#39;ordinateur et / ou visuellement, et sélectionnez des séquences complémentaires de séquences 7 nt immédiatement en aval des structures en épingle à cheveux 4,10, 17,18. </li><li> Synthétiser chacun des heptamères sélectionnés comme entièrement 2&#39;O -methylated, 5 &#39;et 3&#39; de l&#39; ARN-phosphorylée avec un synthétiseur d&#39; ADN / ARN. En utilisant la méthode au phosphoramidite sur le verre à pores contrôlés (CPG) de soutien, et de laisser de l&#39;extrémité 5 4,4&#39;-diméthoxytrityle (DMT), le groupe protecteur dans le dernier cycle (l&#39;ajout de phosphate 5 &#39;) de la synthèse, 23. REMARQUE: sy personnaliséenthetic ARN peut également être obtenu auprès de fournisseurs d&#39;oligonucléotides. </li><li> Après l&#39;achèvement du dernier cycle de synthèse, transférer la CPG avec l&#39;oligonucléotide synthétisé à partir de la colonne dans un flacon en verre avec un capuchon vissé en téflon-liner, ajouter 1 ml de 29% d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium et incuber à 55 ° C pendant 8 h à cliver l&#39;oligonucléotide de la CPG et éliminer les groupes protecteurs des bases et des phosphates. </li><li> Evaporer l&#39;hydroxyde d&#39;ammonium avec un évaporateur centrifuge à 40 ° C et re-dissoudre l&#39;oligonucléotide dans 0,2 ml de 0,1 M de n-hexylammonium acétate d&#39;éthyle. </li><li> On purifie l&#39;oligonucléotide synthétique par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse en utilisant une colonne de polystyrène-divinylbenzène avec un tampon contenant 10-50% d&#39;acétonitrile / 0,1 M d&#39;acétate de n-hexylammonium. Exécutez la colonne à 2,0 ml / min pendant 25 min à 80 ° C. </li><li> Ajouter 0,25-0,5 ml d&#39;acide acétique concentré à l&#39;échantillon fractionné (1-2 ml) pour préparer une solution d&#39;acide acétique à 20% et incubate cette solution pendant 1 h à température ambiante pour éliminer le groupe DMT. </li><li> Sécher l&#39;échantillon dans un évaporateur centrifuge à 40 ° C, re-dissoudre dans 1 ml de 29% d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium, et incuber la solution pendant 15 min à température ambiante pour éliminer la chaîne latérale du phosphate 5 &#39;. </li><li> Réduire le volume (1 ml) de l&#39;échantillon à environ 0,3 ml avec un évaporateur centrifuge à 40 ° C. </li><li> Dialyser l&#39;ensemble de l&#39;échantillon concentré à l&#39;eau distillée (500 ml) en utilisant un tube de dialyse ayant une masse moléculaire de coupure de 1 000 à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dialysé à partir du tube de dialyse dans un tube de 1,5 ml avec une pipette, sécher avec un évaporateur centrifuge à 40 ° C, puis re-dissoudre dans l&#39;eau de l&#39;eau pour injection de qualité, dont le volume devrait être suffisamment petit pour obtenir une solution supérieure à 100 uM. </li><li> Mesurer une densité optique de l&#39;échantillon d&#39;ARN à 260 nm avec un spectrophotomètre et d&#39;ajuster sa concentration à 100iM par addition d&#39;eau de l&#39;eau pour injection de qualité. Conserver la solution d&#39;ARN au-dessous de -20 ° C avant utilisation. </li></ol> 2. Projection de la Bibliothèque ARNsg pour la viabilité cellulaire <ol><li> Préparer 10 3 cellules / 99 ul / puits (par exemple, HL60 et le milieu RPMI-8226) sur un plat de 96 puits dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin et une solution de pénicilline-streptomycine 1%. Préparer les puits contenant les médias que pour la soustraction de fond. Pour éliminer les effets de bord, ajouter de l&#39;eau stérile pour vider les puits entourant les puits d&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 1 pl de type heptamère ARNsg (100 uM) dissous dans l&#39;eau de l&#39;eau pour injection de qualité à chaque puits. Doser chaque ARNsg en triple. Incuber la plaque à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 humidifiée pendant 3 jours. </li><li> Ajouter un volume approprié d&#39;un WST-8 solution disponible dans le commerce dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans le même incubateur pendant 1 à 4, h. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance d&#39;unt 450 nm avec un lecteur de microplaque. NOTE: Dans la plupart des cas, la linéarité entre l&#39;absorbance et le nombre de cellules viables semble être maintenu à moins que la valeur d&#39;absorbance dépasse 1,0. </li></ol> 3. Évaluation des sgRNAs efficace par cytométrie de flux <ol><li> Préparer 10 3 cellules / 99 ul / puits (par exemple, HL60) sur un plat de 96 puits dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin et une solution de pénicilline-streptomycine 1%. Préparer au moins 10 puits pour une ARN sg à tester. Pour éliminer les effets de bord, ajouter de l&#39;eau stérile pour vider les puits entourant les puits d&#39;échantillon. </li><li> Ajouter 1 pl de type heptamère ARNsg (100 uM) dissous dans l&#39;eau de l&#39;eau pour injection de qualité à chaque puits. Incuber la plaque à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 humidifiée pendant 3 jours. </li><li> Recueillir les cellules traitées avec le même ARN sg d&#39;au moins 10 puits dans un tube de 5 ml avec une pipette. Spin le tube pendant 5 min dans une centrifugeuse à 300 xg, et jeter les médias. </li><li> Ajouter 2 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS) pour le tube et remettre en suspension les cellules. Spin le tube pendant 5 min dans une centrifugeuse à 300 xg et jeter PBS. Ajouter 150 pi de tampon de liaison 1x annexine V dans le tube, et remettre en suspension les cellules. </li><li> Ajouter 2 pl de phycoérythrine (PE) conjugué avec la solution de l&#39;annexine V et 1 pi de 7-aminoactinomycine D (7AAD) solution au tube, mélangez-les bien, et incuber le tube pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. Analyser l&#39;échantillon en utilisant un cytomètre de flux 24. </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

L’Université de pharmacie et des sciences de la vie appliquées de Niigata a déposé une demande de brevet sur un sous-ensemble d’ARNsg de type heptamère.

Dans la plupart des cas, les ARNsg de type heptamère entièrement 2′-O-méthylés, 5′ et 3′-phosphorylés dissous dans de l’eau pour injection (à la concentration de 100 μM) semblent être stables à moins de -20 °C pendant au moins un an, à en juger par leur activité à induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses. Cependant, leur stabilité changerait en fonction de leur séquence, de leur qualité et de leur pureté. Dans certains cas, le 5′- ou 3′-phosphate d’une partie des molécules d’ARNsg semble être éliminé spo...

Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silençage génique) est l&#39; une des technologies de silençage génique ARN-1. Cette technologie a été développée en fonction des propriétés de tRNase Z L (ou 3 &#39;tRNase), ARNt 3&#39; traitement endoribonucléase: il peut cliver tout ARN cible sur un site prévu sous la direction d&#39;un petit ARN guide artificiel (ARNsg) en reconnaissant un structure pré-ARNt ou un micro-pré-ARNt formé entre l&#39;ARN cible et l&#39;ARN sg 2-9. ARNsg, qui est habituellement 7-31 nt de long, sont classées en quatre groupes, 5&#39;-demi-ARNt, l&#39;ARN heptamère, un ARN linéaire 14-nt, et de l&#39;ARN du crochet. Nous avons démontré l&#39;efficacité de silençage génique TRUE en introduisant divers sgRNAs artificiellement conçus dans des cellules vivantes 10 - 15. Nous avons également montré que sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules wiThoout tous les réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d&#39;ARN cible et / ou induire l&#39; apoptose dans les cellules cancéreuses humaines 16 - 18. Silençage génique TRUE semble fonctionner sur le intracellulaire et le gène intercellulaire système de réseau de régulation via tRNase Z L et sgRNAs naturelles 19 - 21. Nous avons construit une bibliothèque ARNsg contenant 156 sgRNAs de type heptamère pour rechercher thérapeutiques sgRNAs potentiels de type heptamère pour les cancers du sang 22. Nous avons criblé pour l&#39;effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d&#39;entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Et 4 d&#39;entre eux ont été montré pour réduire les taux de croissance de la tumeur dans les expériences de xénogreffe de souris. Nous présentons ici un protocole de criblage d&#39;une banque d&#39;ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend commentpour construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l&#39;effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et la façon d&#39;évaluer davantage les sgRNAs efficaces par cytométrie en flux. Analyse pour ARN cibles cellulaires de ARNsg et l&#39; évaluation des sgRNAs efficaces dans des modèles de xénogreffes de souris peuvent être effectuées selon des méthodes classiques 17,22, bien que ceux - ci ne sont pas inclus dans ce protocole.

<table><tbody><tr><td>Cartouche d’ARN heptamère personnalisé</td><td>Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoSep Prep HC</td><td>Transgenomic</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité injectable</td><td>Otsuka Pharmaceutical&nbsp ;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 moyen</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine Solution Mixte</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96 Puits Plaque</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>Kit de comptage cellulaire-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 solution</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques, Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tube à fond rond</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Tampon de liaison</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

true gene silencing: projection d&#39;un heptamère type petit guide arn bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

Silençage génique TRUE (appelé après tR Nase Z L - u tilizing e fficacious silençage génique) est un gène d&#39;ARN dirigée silencing technologies, qui utilise un petit ARN guide artificiel (ARN sg) pour guider ARNt 3 «traitement endoribonucléase, tRNase ZL de reconnaître un ARN cible. sgRNAs peuvent être absorbés par les cellules sans réactifs de transfection et peuvent réguler négativement les taux d&#39;ARN cible et / ou induire l&#39;apoptose dans les cellules cancéreuses humaines. Nous avons criblé une bibliothèque contenant ARNsg 156 sgRNAs type heptamère de l&#39;effet sur la viabilité des cellules de myélome et de leucémie humaine, et ont découvert que 20 d&#39;entre eux peuvent efficacement induire une apoptose dans au moins une des lignées cellulaires du cancer. Nous présentons ici un protocole de criblage d&#39;une banque d&#39;ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Le protocole comprend comment construire la bibliothèque ARNsg, comment évaluer l&#39;effet de chaque ARN sg sur la viabilité cellulaire, et comment fucomplémen évaluer les sgRNAs efficaces par cytométrie de flux. Environ 2.000 résultats seraient censés être obtenus par criblage de la banque d&#39;ARN sg pleine échelle composée de 16.384 heptamères.

Les six sgRNAs type heptamère 5 &#39;AUCUUCA-3&#39; (H1885), 5&#39;-ACACACA-3 &#39;(H3277), 5&#39;-GGGGGCG-3&#39; (H10927), 5&#39;-GGGGCCC-3 &#39;(H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287) et 5&#39;-CACCAGC-3&#39; (H13260) ont été synthétisés chimiquement comme 2&#39;- O -méthyl contenant de l&#39; ARN 5 &#39;et 3&#39; des phosphates. Ces sgRNAs ont été examinés pour leurs effets sur la viabilité d&#39;une lignée cellul...

Nous présentons ici un protocole de criblage d&#39;une banque d&#39;ARN sg de type heptamère pour les médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang.

TRUE Gene Silencing: Projection d&#39;un heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

L'objectif général de ce criblage est de trouver des médicaments thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Commencez cette procédure en sélectionnant un sous-ensemble de séquences Heptamères. Les séquences peuvent être aléatoires ou conçues pour cibler des ARN cellulaires spécifiques. Pour cibler des ARN cellulaires spécifiques, utilisez un programme informatique approprié afin d'identifier des structures en épingle à cheveux ressemblant au bras T dans un ARN cible. Sélectionnez des séquences complémentaires de sept nucléotides situées immédiatement en aval de l'épingle à cheveux. À l'aide de la méthode phosphoramidite sur du verre poreux contrôlé, ou support CPG, synthétisez chacun des Heptamères sélectionnés sous forme d'ARN entièrement O-méthylé en 2'-position, phosphorylé en 5' et 3', à l'aide d'un synthétiseur ADN-ARN. Laissez le groupe protecteur DMT en 5' terminal lors du dernier cycle de synthèse. Une fois le dernier cycle terminé, transférez le CPG portant l'oligonucléotide synthétisé de la colonne vers un flacon en verre muni d'un bouchon vissé avec revêtement en téflon. Ajoutez 1 mL d'hydroxyde d'ammonium à 29 % et incubez le tube à 55

true-gene-silencing-screening-heptamer-type-small-guide-rna-library

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Ici, nous utilisons une bibliothèque esiRNA homme dans un écran à haut débit pour les gènes impliqués dans la division cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et mener une esiRNA écrans, ainsi que la façon d'analyser et de valider les résultats.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

Ici, nous utilisons une bibliothèque LentiPlex humains mis en commun et des méthodes de séquençage d'traditionnelle identifier les gènes cibles de promouvoir la survie cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et de déconvoluer un écran LentiPlex et valider les résultats.

LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d&#39;Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

L'interférence ARN (ARNi) possède de nombreux avantages sur inactivation du gène et a été largement utilisé comme un outil dans les études fonctionnelles de gènes. L'invention de l'ADN à base de vecteurs ARNi la technologie a fait à long terme et inactivation génique inductible possible, et a également augmenté la faisabilité de l'inactivation du...

ADN vecteur basé sur l&#39;interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

Atteindre un niveau compréhension des systèmes de processus cellulaires est un objectif de la biologie cellulaire moderne. Nous décrivons ici les stratégies pour les journalistes luciférase multiplexage de diverses fonctions cellulaires points d'extrémité pour interroger la fonction des gènes en utilisant l'échelle du génome bibliothèques ARNi.

Une plateforme de criblage à base de luciférase multiplexé pour interroger associée au cancer transduction du signal dans des cellules cultivées

Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .

HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).

Dépistage en pool de la bibliothèque d’ARNH pour identifier les facteurs qui modulent un phénotype de résistance aux médicaments

Nous avons développé une approche d’oncogénomique comparative inter-espèces utilisant des analyses génomiques et des criblages génomiques fonctionnels pour identifier et comparer des cibles thérapeutiques dans les tumeurs apparaissant dans des modèles murins génétiquement modifiés et le type de tumeur humaine correspondant.

Profilage génétique et criblage de décrochage à l’échelle du génome pour identifier des cibles thérapeutiques dans des modèles murins de tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique

Découvrez le criblage d'une bibliothèque d'ARN guide heptamère pour identifier des agents thérapeutiques potentiels contre les cancers du sang. Cette méthode optimise la découverte de médicaments ciblés.

TRUE Gene Silencing: Projection dun heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer (Vidéo) | JoVE Journal

TRUE Gene Silencing: Projection d'un heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer

Explorer plus de vidéos