Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d'insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

L’objectif global de cette procédure est de convertir les fibroblastes en cellules sécrétant de l’insuline sans induire de pluripotence ou utiliser de vecteurs rétrovitaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative et en particulier dans la thérapie cellulaire du diabète. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir un commutateur dans le phénotype sans induire un état pluripotent stable dans les cellules en conversion et sans vecteurs rétroviraux.

Georgia Pennarossa, post-doctorante dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, ajoutez 1,5 millilitre de gélatine porcine stérile à 0,1 % dans les boîtes de Pétri de 35 millimètres et laissez enrober pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, lavez les biopsies de la peau humaine avec du PBS complété par une solution antimycosique antibiotique à 2 %.

Ensuite, placez les biopsies dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et coupez-les en fragments d’environ deux millimètres cubes avec des scalpels stériles. Ensuite, placez cinq à six fragments de peau dans la boîte de Pétri pré-enrobée de 35 millimètres. Ajoutez une gouttelette de milieu de fibroblaste sur chaque fragment et cultivez-les à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Après six jours d’incubation, jetez soigneusement les fragments de tissu. Les fibroblastes devraient commencer à se développer à partir des fragments de tissu et commencer à former une monocouche cellulaire. Dans cette procédure, cultivez les fibroblastes à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à 80 % de confluence.

Ensuite, plaquez les cellules dans de nouvelles boîtes de culture. Cultivez-les à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone et maintenez le rapport de passage entre un à deux et un à quatre, en fonction du taux de croissance. Ensuite, ajoutez 0,1 % de gélatine porcine dans les boîtes de culture cellulaire et laissez enrober pendant deux heures.

Retirer l’excès de solution de revêtement 10 à 30 minutes avant de plaquer les fibroblastes. Ensuite, retirez le milieu de culture de fibroblastes des boîtes de culture. Lavez les cellules trois fois avec du PBS complété par une solution antimycosique antibiotique à 1 %.

Ensuite, ajoutez une fine couche de solution de trypsine-EDTA. Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la monocouche cellulaire commence à se détacher du fond de la boîte de culture tissulaire et que les cellules se dissocient. Après cela, diluez la suspension cellulaire avec neuf parties de milieu de culture de fibroblastes afin de neutraliser l’action de la trypsine.

Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage sous le microscope à température ambiante. Calculez le volume de milieu de culture de fibroblastes nécessaire pour remettre les cellules en suspension et obtenir la concentration cellulaire de 7,8 fois 10 puissance 4 fibroblaste par centimètre carré. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 150 g pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension avec un volume calculé de milieu de culture de fibroblastes. Ensuite, placez les cellules sur les boîtes pré-enrobées de gélatine à 0,1 % et cultivez-les pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5 %. Le jour zéro, immédiatement avant l’utilisation, préparer la solution mère de 5-aza-CR en dissolvant 2,44 milligrammes de 5-aza-CR dans 10 millilitres de milieu à haute teneur en glucose DMEM.

Stérilisez-le par filtration. Ensuite, diluez un microlitre de solution mère de 5-aza-CR dans un millilitre de milieu de culture de fibroblastes. Pour augmenter la plasticité cellulaire, 24 heures après le placage cellulaire, retirez le milieu de culture des fibroblastes ensemencés.

Ajouter une solution mère micromolaire de 5-aza-CR et cultiver pendant 18 heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Le premier jour, préparez des HP moyens frais. Après l’incubation avec une micromolaire 5-aza-CR, retirez le milieu et lavez les cellules trois fois avec un milieu HP pour vous assurer que le 5-aza-CR est rincé.

Ensuite, incubez les fibroblastes traités au 5-aza-CR avec un milieu HP pendant trois heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Pour surveiller l’efficacité du traitement au 5-aza-CR, vérifiez s’il y a des changements morphologiques. Les cellules doivent perdre la morphologie allongée typique des fibroblastes et acquérir une forme ronde ou ovale plus petite avec des noyaux élargis.

Du premier au sixième jour, préparez le milieu basal pancréatique et la solution mère d’Activin A. Ensuite, cultivez les fibroblastes traités au 5-aza-CR dans un milieu basal pancréatique complété par une solution mère d’Activin A pendant six jours à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone et changez le milieu tous les jours. Du septième au huitième jour, préparez une solution mère d’acide rétinoïque en ajoutant 16,6 millilitres de DMSO à 50 milligrammes d’acide rétinoïque.

Cultivez les cellules dans un milieu basal pancréatique complété par une solution mère d’Activine A et une solution mère d’acide rétinoïque pendant deux jours à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5 % et changez le milieu tous les jours. Du neuvième au 36e jour, cultivez les cellules et le milieu basal pancréatique complété par ITS, B27 et BFGS et changez le milieu tous les jours pendant les 15 premiers jours et rafraîchissez le milieu tous les deux jours à partir du 16e jour. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Cette figure montre les changements morphologiques qui se produisent au cours de la différenciation endocrinienne du pancréas. Après sept jours d’induction, les cellules humaines s’organisent progressivement en grappes. En réponse à l’ajout d’acide rétinoïque, ils se réorganisent selon un motif réticulaire et se regroupent en agrégats distincts.

Ces formations progressent avec le temps, recrutant des cellules et agrégeant des colonies 3D agrandies. Enfin, les colonies deviennent des structures sphériques qui ont tendance à se détacher et à s’écouler librement dans le milieu de culture, rappelant les îlots pancréatiques typiques in vitro. Après 36 jours d’induction pancréatique, les niveaux globaux de méthylation de l’ADN des cellules humaines converties par épigénétique sont revenus à ceux observés dans les fibroblastes non traités.

La co-localisation de PDX1 avec CPEP est observée à la fin de la période de conversion alors que ces marqueurs pancréatiques endocriniens sont totalement absents dans les fibroblastes non traités. Ce graphique montre la quantité d’insuline libérée par les cellules converties épigénétiques en réponse à une exposition de 20 millimolaires de D-glucose et de 20 millimolaires de L-glucose. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 38 jours si elle est correctement exécutée.

Après son développement, cette recherche a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative pour explorer la thérapie cellulaire du diabète chez l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de convertir les fibroblastes en cellules sécrétant de l’insuline sans induire de pluripotence ni utiliser de vecteurs rétroviraux.