Name: Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices dinsuline à partir des adultes fibroblastes cutanés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez la conversion épigénétique des fibroblastes cutanés en cellules sécrétant l'insuline sans pluripotence ni vecteurs rétroviraux. Cette méthode sécurisée offre des applications prometteuses pour la thérapie cellulaire du diabète.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et la Fondation européenne pour l&#39;étude du diabète (EFSD). GP est soutenu par une bourse post-doc de l&#39;Université de Milan. Les auteurs sont membres de l&#39;Action COST FA1201 Epiconcept: Epigénétique et périconceptionnelle environnement et l&#39;action COST partage BM1308 avance sur les grands modèles animaux (SALAAM). TALB est membre du COST Action CM1406 épigénétique Chemical Biology (EPICHEM).

Remarque: Toutes les procédures décrites ci-après doivent être effectuées sous hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. Assurez-vous que toutes les procédures de culture sont effectués sur les stades thermostatiques et les cellules sont maintenues à 37 ° C tout au long de leur traitement. 1. Peau Fibroblast Isolation <ol><li> Préparer Culture Solution Dish Coating <ol><li> Dissoudre 0,1 g de gélatine de porc dans 100 ml d&#39;eau (concentration finale 0,1%). Stériliser solution avec autoclave. </li><li> Ajouter 1,5 ml de stérile à 0,1% de gélatine porcine à 35 mm des boîtes de Pétri. Attendre 2 heures pour enrober, de les maintenir à la température ambiante. Nota: Les biopsies de peau humaines sont recueillies par excision sous anesthésie locale d&#39;une zone avasculaire de la face antérieure de l&#39;avant-bras et stockés dans un tampon phosphate salin de Dulbecco (PBS) additionné de 2% d&#39;une solution antimycosique antibiotique à 4 ° C avant utilisation. </li></ol></li><li> biopsies Laver avec de nouvelles PBS additionné de 2% Antibisolution antimycosique otique. </li><li> La place des biopsies dans un plat de 100 mm de Pétri et coupées en environ 2 mm 3 fragments avec scalpels stériles. </li><li> Retirer la solution revêtement en excès immédiatement avant le placage des fragments. </li><li> Placez 5-6 fragments de peau dans le plat pré-enduit de 35 mm de Pétri. </li><li> Préparer un milieu de culture de fibroblaste: 77% de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) riche en glucose, 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de solution de L-glutamine et 2% d&#39;une solution antibiotique antimycotique. </li><li> Ajouter une goutte de milieu sur chaque fragment fibroblaste (habituellement 100 ul par fragment) et les cultiver à 37 ° C dans 5% de CO2. </li><li> Après 24 h, ajouter 500 pi de milieu de culture de fibroblastes sur les fragments pour les garder humide à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Changer le support avec une pipette au moins une fois toutes les 48 heures. </li><li> Après 6 jours d&#39;incubation, éliminer les fragments de tissus soigneusement et jetez-les. Remarque: Après 6 jours, fibroblastes commencent à se développer à partir de fragments de tissus et commencent à former une monocouche cellulaire. </li><li> Actualiser la moyenne, ajouter 2 ml de milieu de culture de fibroblastes et de continuer la culture monocouche de cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li></ol> 2. Fibroblast Culture <ol><li> Des fibroblastes de culture à 37 ° C dans 5% de CO 2 jusqu&#39;à 80% de confluence </li><li> Pour les passages, Aspirer le milieu de culture de fibroblastes à partir des boîtes de culture tissulaire. Laver les cellules trois fois avec 4 ml de PBS supplémenté avec 1% de solution antibiotique antimycotique. </li><li> Ajouter une couche mince (10% du volume du milieu de culture) de solution de trypsine-EDTA (0,5 g / l de trypsine porcine et 0,2 g / L d&#39;EDTA) et on incube à 37 ° C jusqu&#39;à la monocouche cellulaire commence à se détacher de la partie inférieure du tissu boîte de culture et les cellules se dissocient. </li><li> Diluer la suspension cellulaire avec 9 parties de milieu de culture de fibroblaste pour neutraliser l&#39;action de la trypsine. La centrifugation est pas nécessaire. </li><li> cellules en plaques dans de nouvelles boîtes de culture (avecen gélatine) et la culture à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Gardez le rapport de passage entre 1: 2 et 1: 4, en fonction du taux de croissance. </li><li> Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, le passage entre eux (habituellement deux fois par semaine). </li></ol> 3. Fibroblast Placage pour la conversion épigénétique <ol><li> Ajouter 0,26 ml / cm 2 de 0,1% de gélatine porcine (comme décrit dans la préparation 1.1) dans des boîtes de culture cellulaire. Attendre 2 heures pour enrober. </li><li> On élimine la solution de revêtement en excès de 10 à 30 minutes avant le placage des fibroblastes. </li><li> Éliminer le milieu de culture des fibroblastes à partir de boîtes de culture. Laver les cellules trois fois avec du PBS additionné de 1% solution antifongique antibiotique. </li><li> Ajouter une couche mince (10% du volume du milieu de culture) de solution de trypsine-EDTA (0,5 g / l de trypsine porcine et 0,2 g / L d&#39;EDTA) et on incube à 37 ° C jusqu&#39;à la monocouche cellulaire commence à se détacher de la partie inférieure du tissu boîte de culture et les cellules se dissocient. </li><li> Diluer la suspension cellulaire avec 9 parties de fibroblMilieu de culture ast pour neutraliser l&#39;action de la trypsine. </li><li> Nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage au microscope à température ambiante. Calculer le volume requis de milieu de culture de fibroblaste pour remettre en suspension les cellules, pour obtenir une concentration cellulaire de 7,8 x 10 4 fibroblastes / cm2. Cela dépendra du type particulier de chambre utilisée. Cellules / pl = Nombre moyen de cellules par petite grille x 90 (facteur de multiplication) x dilution </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 150 g pendant 5 min à température ambiante. Éliminer les cellules surnageant et remettre le volume précédemment calculé de milieu de culture de fibroblastes. </li><li> Cellules de plaques sur 0,1% de gélatine plats et la culture les pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur pré-revêtues. </li></ol> 4. Augmenter la plasticité cellulaire Utilisation du De-méthylation Agent 5-aza-CR <ol><li> jour 0 <ol><li> Préparer 5-aza-CR solution mère en dissolvant 2,44 mg de 5-aza-CR dans 10 ml de DMEM haute medi de glucoseum. Stériliser par filtration. Préparer 5-aza-CR actions immédiatement avant l&#39;utilisation. </li><li> Diluer 1 pl de 5-aza-CR solution mère dans 1 ml de milieu de culture de fibroblastes (concentration finale de 1 uM). </li><li> Pour augmenter la plasticité des cellules, 24 heures après l&#39; étalement des cellules (sous - position 3.8), éliminer le milieu de culture à partir de fibroblastes ensemencés et ajouter 1 uM 5-aza-CR solution mère et de la culture pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li></ol></li><li> jour 1 <ol><li> Préparer pluripotentes humaines (HP) du milieu frais comme décrit dans le tableau 1. </li><li> Après incubation avec 1 pM de 5-aza-CR, éliminer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS pour veiller à ce que 5-aza-CR est rincé. </li><li> Incuber 5-aza-CR fibroblastes traités avec du milieu HP pendant 3 h (période de récupération) à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Après la période de récupération, éliminer le milieu, laver trois fois avec PBS. </li><li> Pour surveiller l&#39;efficacité du traitement-CR 5-aza, vérifier dans cette étape fou la présence de changements morphologiques (détaillée dans la section des résultats). Les cellules perdent la morphologie allongée typique de fibroblastes et d&#39;acquérir une forme ronde ou ovale, devenant de plus petite taille, avec des noyaux agrandis. </li><li> Procéder à la différenciation pancréatique. </li></ol></li></ol> 5. Pancreatic Protocole Différenciation <ol><li> Jours 1-6 <ol><li> Préparer Pancreatic Basal Medium , comme décrit dans le tableau 2. </li><li> Préparer activine Une solution mère: dissoudre 5 pg d&#39;activine Une protéine humaine recombinante dans 166,6 pi d&#39;eau stérile. </li><li> Culture 5-aza-CR fibroblastes traités dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium, additionné de 1 pl / ml activine Une solution mère (voir 5.1.2) pendant 6 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Changer le milieu tous les jours. </li></ol></li><li> Jours 7-8 <ol><li> Préparer rétinoïque solution mère d&#39;acide en ajoutant 16,6 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 50 mg de aci rétinoïqueré. </li><li> Cellules de culture dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium supplémenté avec 1 pl / ml activine Une solution mère (voir 5.1.2) et / ml de solution mère d&#39; acide rétinoïque 1 pl (voir 5.2.1) pendant 2 jours à 37 ° C à 5% de CO 2. Changer le milieu tous les jours. </li></ol></li><li> Jours 9-36 <ol><li> Cellules de culture dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium supplémenté avec 1% (v / v) Insulin-transferrine-Sélénium (ITS), 2% (v / v) B27 et 0,1% (v / v) recombinant FGF humain de base (bFGF) solution mère (voir le tableau 1) à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Changer le support quotidien pour les 15 premiers jours. </li><li> A partir du jour 16 avant, rafraîchir milieu tous les deux jours, sous un microscope, étant donné que les cellules formant des agrégats peut se détacher de la partie inférieure de la boîte de culture. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent avoir aucun intérêt financier concurrents.

La présente manuscrit décrit un procédé qui permet la conversion des fibroblastes de peau humaine dans des cellules productrices d&#39;insuline, par une exposition transitoire et de courte durée à 5-aza-CR, suivi d&#39;un protocole d&#39;induction spécifique d&#39;un tissu. Cette approche permet un passage du mésoderme aux cellules de l&#39; endoderme liées, sans l&#39;expression forcée de facteurs de transcription ou de microARN , ni l&#39;acquisition d&#39;un état ​​pluripotent stable, qui rend les cellules plus insta...

Un objectif fondamental de la médecine régénérative est la génération de nouvelles cellules, fonctionnels qui peuvent être utilisés pour réparer ou remplacer endommagé, dégénéré tissus. Refaire cellules adultes facilement disponibles dans de nouveaux, en les convertissant d&#39;un type de cellule à une autre, est une approche particulièrement attrayante, surtout lorsque la population de cellules requises ne sont pas abondants ou difficiles d&#39;accès. Cependant, les cellules adultes sont remarquablement stables. Ils acquièrent leur état ​​différencié à travers une restriction progressive de leurs options et, une fois qu&#39;ils atteignent la spécialisation terminale mature, ils conservent de manière stable , il 1. Dans les dernières années , un certain nombre de protocoles ont été développés, qui permettent la reprogrammation de la pluripotence d&#39;une cellule somatique (iPS) obtenue par l&#39;expression forcée d&#39;un ensemble de facteurs de transcription 2,3. Alternativement, la conversion de cellules peut être obtenue par transdifférenciation lignée directe, l&#39; introduction d&#39; un seul 4 </sup&gt; ou une combinaison de facteurs de transcription 5-7. Cette stratégie ne concerne pas le passage par un état ​​de différenciée mais nécessite une forte expression de facteurs de transcription spécifiques 8. Nous avons récemment développé un protocole de conversion basé sur la brève exposition des cellules adultes aux propriétés de déméthylation de la cytidine analogique 5-azacytidine (5-aza-CR), un inhibiteur de l&#39;ADN méthyltransférase bien caractérisé. L&#39;étape de déméthylation est immédiatement suivie par un protocole de différenciation spécifique 11/09 qui permet d&#39;obtenir le phénotype de terminal requis. Ce procédé est capable de transformer des cellules matures différenciées en cellules d&#39;une lignée différente et présente l&#39;avantage considérable d&#39;éviter à la fois l&#39;utilisation de vecteurs viraux et la transfection de facteurs de transcription exogènes. L&#39;acquisition d&#39;un état pluripotent stable, et une sensibilité accrue liée à la cellule d&#39;instabilité est également évitée. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Le protocole détaillé qui permet la conversion des fibroblastes adultes de peau humaine en cellules sécrétrices d&#39;insuline entièrement fonctionnel est présenté ici. Toutefois, il convient de noter que la technique a été appliquée à différents types de cellules et a donné des résultats positifs, lorsque les cellules d&#39;adressage vers différentes voies de différenciation. En outre, la conversion épigénétique a été utilisé avec succès dans l&#39;espèce humaine et porcine 9-13, ainsi que chez le chien (manuscrit soumis) , suggérant une grande efficacité et la robustesse de l&#39;approche.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS ; pour le lavage cellulaire et la préparation de solutions</td></tr><tr><td>Solution antibiotique antimycosique</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>Composant du fibroblaste, de l’HP et du milieu pancréatique</td></tr><tr><td>100 mm Boîte de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>Pour l’isolement des fibroblastes</td></tr><tr><td>Gélatine porcine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Pour l’enrobage de la vaisselle</td></tr><tr><td>Eau</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Pour la préparation de la solution</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>Pour l’isolement des fibroblastes</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>Pour la culture de fibroblastes</td></tr> Sérum <tr><td>fœtal</td><td>Bovin Life Technologies</td><td>10500064</td><td>FBS ; Composant des fibroblastes et des supports HP</td></tr><tr><td>Solution de L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Composant des médias des fibroblastes, des HP et du pancréas</td></tr><tr><td>Solution de trypsine-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Pour la dissociation des fibroblastes</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Comptage cellulaire</td></tr><tr><td>5-Azacytidine</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, pour l’augmentation des cellules plasticité dans les fibroblastes</td></tr><tr><td>Ham Ham’s F-10 Nutrient Mix</td><td>Life Technologies</td><td>31550031</td><td>Pour HP medium</td></tr><tr><td>DMEM, low glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>31885023</td><td>Pour HP medium</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Life</td><td>Technologies</td><td>10828028</td><td>Composant de HP medium</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life</td><td>Technologies</td><td>11140035</td><td>Composant du milieu basal HP et pancréatique</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Composant du milieu basal HP et pancréatique</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>Mélange de nucléosides composant du milieu HP</td></tr><tr><td>Adénosine</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td>Composant du mélange de nucléosides composant du milieu HP</td></tr><tr><td>Cytidine</td><td>Sigma</td><td>C4654</td><td>Composant du mélange de nucléosides du milieu HP</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td>Composant de mélange de nucléosides de HP medium</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T1895</td><td>Composant de mélange de nucléosides de HP medium</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &micro ; m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Pour la stérilisation de la solution</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life</td><td>Technologies</td><td>PHG0261</td><td>bFGF ; Composant de HP et du milieu basal pancréatique</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>BSA ; Composant du milieu basal pancréatique</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td>Pour le milieu basal pancréatique</td></tr><tr><td>Supplément B-27 moins de vitamine A Life</td><td>Technologies</td><td>12587010</td><td>Composant du milieu pancréatique</td></tr><tr><td>N-2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Composant du milieu basal pancréatique</td></tr><tr><td>Activine A Recombinant Human</td><td>Protein Life Technologies</td><td>PHG9014</td><td>Pour le milieu pancréatique</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Pour le milieu pancréatique</td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO ; pour la préparation de l’acide rétinoïque</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-Transferrin-Selenium</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>ITS ; pour le milieu final pancréatique</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Vimentine&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:100</td></tr><tr><td>4&prime ;,6-Diamidino-2-phénylindole dichlorhydrate</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI. Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail&nbsp ; 1 et micro ; g/ml</td></tr><tr><td>5-Methylcytidine</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-peptide C&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps anti-PDX1&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia Insuline ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>Pour la détection de la libération d’insuline</td></tr></tbody></table>

conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d&#39;insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

La médecine régénérative nécessite de nouvelles cellules entièrement fonctionnelles qui sont livrées aux patients afin de réparer les tissus dégénérés ou endommagés. Lorsque de telles cellules ne sont pas facilement disponibles, elles peuvent être obtenues en utilisant différentes approches qui incluent, parmi les nombreuses suivantes, la reprogrammation et la transdifférenciation, avec des avantages et des limites spécifiques aux différentes techniques. Ici, une nouvelle stratégie pour la conversion d’un fibroblaste adulte mature en une cellule sécrétant de l’insuline, arbitrairement désignée comme cellules converties épigénétiques (EpiCC), est décrite. La méthode a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes contrôlant la régulation épigénétique du destin et de la différenciation cellulaires. En particulier, la première étape utilise un modificateur épigénétique, à savoir la 5-aza-cytidine, pour conduire les cellules adultes dans un état « hautement permissif ». Il profite ensuite de cette fenêtre brève et réversible de plasticité épigénétique, pour réadresser les cellules vers une lignée différente. L’approche est appelée « conversion cellulaire épigénétique ». Il s’agit d’un moyen simple et robuste d’obtenir un commutateur inter-lignage cellulaire efficace, contrôlé et stable. Étant donné que le protocole n’implique l’utilisation d’aucune transfection de gènes, qu’il est exempt de vecteurs viraux et qu’il n’implique pas d’état pluripotent stable, il est très prometteur pour les applications de médecine translationnelle.

Mise en place de la culture primaire à partir de biopsies de peau Des biopsies cutanées ont été découpées en petits morceaux et placés dans des boîtes pré-revêtues de gélatine. Au bout de 6 jours, les fibroblastes commencent à croître à partir de fragments de tissus et ont formé une monocouche de cellules (figure 1A). Les cellules ont montré une forme typique allongée et, comme prévu, affichent une immuno-positivité uniforme pour le fibroblaste spécifique marqueur...

Ici, une nouvelle méthode qui permet de convertir les fibroblastes de la peau adulte en cellules sécrétant de l’insuline est présentée. Cette technique est basée sur la conversion épigénétique, n’implique pas l’utilisation de vecteurs rétroviraux ni l’acquisition d’un état pluripotent stable. Il est donc très prometteur pour les applications de la médecine translationnelle.

Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d&#39;insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

L'objectif général de cette procédure est de convertir des fibroblastes en cellules sécrétant de l'insuline sans induire de pluripotence ni utiliser de vecteurs rétroviraux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, et en particulier dans la thérapie cellulaire du diabète. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir un changement de phénotype sans induire un état pluripotent stable dans les cellules en cours de conversion et sans recourir à des vecteurs rétroviraux.La procédure sera démontrée par Georgia Pennarossa, post-doctorante dans notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez 1,5 millilitre de gélatine porcine stérile à 0,1 % dans les boîtes de Pétri de 35 millimètres et laissez recouvrir pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, lavez les biopsies de peau humaine avec du PBS supplémenté d'une solution antibiotique antimycotique à 2 %.Ensuite, placer les biopsies dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et les découper en fragments d'environ deux millimètres cubes à l'aide de scalpels stériles. Puis, placer cinq à six fragments de peau dans la boîte de Pétri pré-enrobée de 35 millimètres. Ajouter une goutte de milieu pour fibroblastes au-dessus de chaque fragment et les cultiver à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone.Après six jours d'incubation, éliminer soigneusement les fragments de tissu. Les fibroblastes devraient commencer à sortir des fragments de tissu et à former une monocouche cellulaire. Dans cette procédure, cultiver les fibroblastes à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone jusqu'à une confluence de 80 %.Ensuite, ensemencez les cellules dans de nouvelles boîtes de culture. Incubez-les à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone et maintenez un rapport de passage compris entre un pour deux et un pour quatre, selon la vitesse de croissance. Ajoutez ensuite 0,1 % de gélatine porcine dans les boîtes de culture et laissez le revêtement agir pendant deux heures.Retirer l'excès de solution d'enduction 10 à 30 minutes avant la mise en place des fibroblastes. Ensuite, éliminer le milieu de culture des fibroblastes des boîtes de culture. Laver les cellules trois fois avec du PBS supplémenté d'une solution antibiotique antimycosique à 1 %.Ensuite, ajoutez une fine couche de solution de trypsine-EDTA. Incubez à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la monocouche cellulaire commence à se détacher du fond de la boîte de culture tissulaire et que les cellules se dissocient. Ensuite, diluez la suspension cellulaire avec neuf parties de milieu de culture de fibroblastes afin de neutraliser l'action de la trypsine.Ensuite, comptez les cellules à l'aide d'une chambre de comptage au microscope à température ambiante. Calculez le volume de milieu de culture de fibroblastes nécessaire pour re-suspendre les cellules et obtenir une concentration cellulaire de 7,8 × 10⁴ fibroblastes par centimètre carré. Par la suite, centrifugez la suspension cellulaire à 150 × g pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, retirez le surnageant et re-suspendez les cellules dans un volume calculé de milieu de culture de fibroblastes. Puis, mettez les cellules en culture dans des plaques pré-enduites de gélatine à 0,1 % et incubez-les pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. Au jour zéro, immédiatement avant utilisation, préparez une solution mère de 5-aza-CR en dissolvant 2,44 milligrammes de 5-aza-CR dans 10 millilitres de milieu DMEM à haute teneur en glucose.Stérilisez-le par filtration. Ensuite, diluez un microlitre de solution mère de 5-aza-CR dans un millilitre de milieu de culture de fibroblastes. Pour augmenter la plasticité cellulaire, retirez le milieu de culture des fibroblastes semés 24 heures après le semis des cellules.Ajouter une solution mère de 5-aza-CR à une concentration d'un micromolaire et cultiver pendant 18 heures à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone. Au jour un, préparer un milieu HP frais. Après l'incubation avec le 5-aza-CR à un micromolaire, retirer le milieu et laver les cellules trois fois avec le milieu HP afin de s'assurer que le 5-aza-CR est éliminé.Ensuite, incuber les fibroblastes traités au 5-aza-CR dans un milieu HP pendant trois heures à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone. Pour surveiller l'efficacité du traitement au 5-aza-CR, vérifier la présence de changements morphologiques. Les cellules doivent perdre la morphologie allongée typique des fibroblastes et adopter une forme plus petite, ronde ou ovale, avec des noyaux agrandis.Les jours 1 à 6, préparez le milieu basal pancréatique et la solution mère d'Activine A. Ensuite, cultivez les fibroblastes traités par le 5-aza-CR dans le milieu basal pancréatique supplémenté par la solution mère d'Activine A pendant six jours à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone, et changez le milieu quotidiennement. Les jours 7 à 8, préparez la solution mère d'acide rétinoïque en ajoutant 16,6 millilitres de DMSO à 50 milligrammes d'acide rétinoïque.Incuber les cellules dans un milieu basal pancréatique supplémenté en solution mère d'Activine A et en solution mère d'acide rétinoïque pendant deux jours à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone et changer le milieu quotidiennement. Du neuvième au trente-sixième jour, cultiver les cellules dans un milieu basal pancréatique supplémenté en ITS, B27 et solution mère de BFGS, renouveler le milieu quotidiennement pendant les 15 premiers jours, puis rafraîchir le milieu tous les deux jours à partir du jour 16. Maintenir la culture des cellules à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone.Cette figure montre les changements morphologiques qui se produisent pendant la différenciation pancréatique endocrine. Après sept jours d'induction, les cellules humaines s'organisent progressivement en amas. En réponse à l'ajout d'acide rétinoïque, elles s'organisent selon un motif réticulé et s'agglomèrent en agrégats distincts.Ces formations évoluent au fil du temps, recrutant des cellules et formant des colonies tridimensionnelles agrandies. Enfin, les colonies deviennent des structures sphériques ayant tendance à se détacher et à flotter librement dans le milieu de culture, rappelant les îlots pancréatiques typiques in vitro. Après 36 jours d'induction pancréatique, les niveaux globaux de méthylation de l'ADN des cellules converties épigénétiquement reviennent à ceux observés dans les fibroblastes non traités.La co-localisation de PDX1 avec CPEP est observée à la fin de la période de conversion, tandis que ces marqueurs pancréatiques endocriniens sont complètement absents dans les fibroblastes non traités. Ce graphique montre la quantité d'insuline libérée par les cellules converties épigénétiquement en réponse à une exposition au D-glucose 20 millimolaire et au L-glucose 20 millimolaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 38 jours si elle est effectuée correctement.Après son développement, cette recherche a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative pour explorer la thérapie cellulaire du diabète chez l'humain. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de convertir des fibroblastes en cellules sécrétant de l'insuline sans induire de pluripotence ni utiliser de vecteurs rétroviraux.

epigenetic-conversion-as-safe-simple-method-to-obtain-insulin

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous décrivons ici un protocole pour générer des cellules souches pluripotentes induites humaines du sang périphérique en utilisant une stratégie de reprogrammation de episome base et les inhibiteurs d'histone déacétylase.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la génération efficace d’iPSC sans intégration à partir de cellules sanguines périphériques humaines adultes. Grâce à l’utilisation de quatre vecteurs épisomaux basés sur oriP/EBNA pour exprimer les facteurs de reprogrammation, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 et SOX2, des milliers de colonies d’iPSC peuvent être obtenues à partir de 1 mL de sang périphérique.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Reprogrammation neuronale directe génère des neurones qui maintiennent l’âge de la cellule somatique départ. Nous décrivons ici une méthode basée sur un vecteur unique pour générer des neurones induites de fibroblastes dermiques provenant de donneurs humains adultes.

Génération simple d’une Culture de haut rendement de neurones induits des fibroblastes de la peau humaine adulte

Ici, nous décrivons une méthode cliniquement pertinente, haute efficacité, exempte d’engraissement pour reprogrammer les fibroblastes humains primaires sur les cellules souches pluripotentes induites à l’aide de mis à jour l’ARNm codant pour des facteurs de reprogrammation et mature microARN-367/302 imite. Est également inclus les méthodes pour évaluer l’efficacité de reprogrammation, développez colonies clonales iPSC et confirmer l’expression du marqueur de pluripotence TRA-1-60.

Base d’ARN reprogrammation des fibroblastes humains de primaires sur les cellules souches pluripotentes induites

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Nous présentons ici une méthode qui combine l’utilisation de l’effacement épigénétique chimique avec des indices liés à la mécanosension pour générer efficacement des cellules pluripotentes de mammifères, sans avoir besoin de transfection de gènes ou de vecteurs rétroviraux. Cette stratégie est donc prometteuse pour la médecine translationnelle et représente une avancée notable dans la technologie des organoïdes de cellules souches.

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Nous décrivons un protocole pour reprogrammer les fibroblastes peau-dérivés humains en cellules neuronales induites d’ancêtre (iNPCs), et leur différentiation suivante dans les astrocytes induits (iAs). Cette méthode conduit à une génération rapide et reproductible d’iNPCs et d’iAs en grande quantité.

Modélisation in vitro pour les maladies neurologiques à l’aide de la conversion directe de fibroblastes en cellules progénitrices neuronales et différenciation en astrocytes

Nous décrivons ici un système de reprogrammation directe optimisé pour les mélanocytes et un système d’emballage de virus concentré à haute efficacité qui assure une reprogrammation directe en douceur.

Reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Découvrez la conversion épigénétique des fibroblastes cutanés en cellules sécrétant l'insuline sans pluripotence ni vecteurs rétroviraux. Cette méthode sécurisée offre des applications prometteuses pour la thérapie cellulaire du diabète.

Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices dinsuline à partir des adultes fibroblastes cutanés (Vidéo) | JoVE Journal

Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d'insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

Explorer plus de vidéos