Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L'augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

L'objectif général de ce protocole d'immunomarquage est de détecter l'expression protéique dans les embryons de pucerons. Des conditions critiques sont identifiées afin d'augmenter la perméabilité des tissus et de réduire la coloration de fond, deux problèmes persistants lors de la coloration des tissus embryonnaires de pucerons. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle fournit des conditions spécifiques permettant une pénétration efficace des anticorps et une réduction de la coloration de fond, conditions qui ne sont généralement pas décrites dans un protocole d'immunomarquage standard.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette mesure lorsque nous étudiions la façon dont les cellules germinales sont spécifiées chez le puceron du pois, un modèle d'insecte utilisé pour des études génomiques et environnementales. La souche de laboratoire du puceron du pois, a. pisum, a été initialement collectée dans le centre de Taïwan et a été élevée sur des plantes hôtes pendant plus de 300 générations.

Pour la germination, faire tremper les graines des plantes hôtes dans de l'eau du robinet pendant trois à cinq jours à température ambiante. Renouveler l'eau fraîche une fois par jour. Faire pousser dix graines en germination dans un petit pot avec du sol, dans une chambre de croissance sous un photopériode de 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité, à 20 degrés Celsius.

Environ 10 jours après le début de la croissance, la hauteur des plantes dépasse généralement huit centimètres. Maintenir chaque pot de plantes dans un bécher en verre d'un litre et transférer les pucerons adultes sur les plantes à l'aide d'un pinceau. Ensuite, sceller le bécher avec un couvercle perméable à l'air, tel qu'une maille en gaze, afin d'empêcher les pucerons de s'échapper.

Incuber les pucerons dans une chambre de croissance sous un photopériode de 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité, à 20 degrés Celsius, en arrosant chaque pot de plantes une fois par jour. Remplir une cavité d'une plaque de culture avec environ 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 pour cent. Placer la plaque sous un stéréomicroscope à faible grossissement, puis immerger un puceron adulte dans le paraformaldéhyde pour la dissection.

Dissez les ovaires en tenant la tête et l'abdomen avec une pince, en incisant la cuticule dorsale de l'abdomen et en extrayant les ovaires de la cavité abdominale. Ensuite, fixez trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 millilitre contenant un millilitre de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 20 minutes, avec un léger agitation sur un agitateur. Éliminez le tampon de fixation à l’aide d’une pipette en verre, puis lavez les ovaires avec du PBST trois fois pendant 10 minutes, avec un léger agitation.

Pour traiter les ovaires, commencez par les incuber avec la protéinase K pendant 10 minutes sous agitation douce afin d'augmenter la perméabilité des tissus embryonnaires. Après l'incubation, éliminez la solution de protéinase K, puis lavez les ovaires avec 700 microlitres de glycine, trois fois pendant cinq minutes. Ensuite, lavez les ovaires avec du PBST deux fois pendant 10 minutes.

Fixer à nouveau les ovaires avec le tampon de fixation pendant 15 minutes à température ambiante sous agitation douce. Pour supprimer l'activité peroxydase endogène, déshydrater successivement les ovaires à l'aide de différents pourcentages de méthanol dans du PBST à 0,2 pour cent selon des rapports volumétriques de un à trois, un à un et trois à un, puis poursuivre l'incubation des ovaires avec du méthanol à 100 pour cent pendant une heure à température ambiante sous agitation douce. Ensuite, réhydrater progressivement les ovaires, comme indiqué dans le protocole écrit.

Pour trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 millilitre, 200 microlitres est le volume minimal requis pour le blocage de l'échantillon et la coloration par anticorps. Incuber les ovaires avec la solution de blocage DIG-B 1x pendant quatre heures à température ambiante, ou toute une nuit à quatre degrés Celsius, sous agitation douce. Après l'incubation, éliminer le surnageant et le remplacer par une solution de blocage DIG-B 1x fraîche, contenant l'anticorps primaire au ratio de dilution approprié.

Colorer les ovaires pendant quatre heures à température ambiante, ou toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation douce. Après avoir lavé les ovaires comme décrit dans le protocole, jeter le surnageant et le remplacer par une solution de blocage DIG-B 1x fraîche contenant l'anticorps secondaire dilué au rapport approprié, puis colorer les ovaires comme précédemment. Pour la coloration immunofluorescente, effectuer la coloration à l'abri de la lumière, car l'anticorps secondaire est sensible à la lumière.

L'épaisseur des embryons de pucerons varie selon les stades de développement. Les stratégies de montage sont donc adaptées aux embryons précoces, intermédiaires et tardifs. Transférez les ovaires, accompagnés du milieu de montage, dans le plateau de cellules à l’aide d’une pipette en plastique, puis observez les échantillons au microscope stéréo à faible grossissement.

Couper les callosités associées à l'oviducte latéral à l’aide d’aiguilles entomologiques, puis transférer un ovariole isolé dans une cavité en verre vide à l’aide d’une pipette. Ajuster le volume final entre 50 et 100 microlitres à l’aide du milieu de montage. Ensuite, transférer un ovariole sur la lame à l’aide d’une pipette en verre.

Disséquez les chambres ovariennes à l'aide d'épingles à insectes. Pour les embryons âgés de plus de six stades de développement, il est recommandé de séparer les chambres ovariennes. Pour les germariums et les deux premières chambres ovariennes, la séparation est facultative.

Déplacer une chambre œuf disséquée sur une lame propre à l’aide d’une pipette en verre. Pour les embryons aux stades 1 à 10 de développement, poser lentement une lamelle sur les germariums ou chambres œuf disséqués afin d’éviter les bulles. Alternativement, pour les embryons aux stades 11 à 18 de développement, monter les chambres œuf sur une lame avec un pont de lamelle unilatéral, puis placer une autre lamelle par-dessus l’échantillon.

Pour les embryons dont le stade de développement est supérieur au stade 19, monter les caméras à œufs sur une lame à l’aide d’un pont constitué de deux lamelles collées, puis placer une autre lamelle par-dessus l’échantillon. Ensuite, remplir l’espace sous la lamelle supérieure avec un milieu de montage afin d’éviter que l’échantillon ne s’assèche. Faire rouler doucement la lamelle supérieure afin d’obtenir l’orientation adéquate pour l’observation.

Enfin, sceller le pourtour des lamelles, y compris les lamelles de pont, avec du vernis à ongles avant d'effectuer l'analyse d'image, comme décrit dans le protocole écrit. On observe ici une paire d'ovaires disséqués à partir d'une femelle adulte. Un ovariole est composé d'un germarium, d'un à deux sites O, ainsi que de cinq à sept embryons, tous logés dans des chambres ovariennes selon un mode de disposition en chaîne de montage.

Après fixation par le paraformaldéhyde, il est fortement recommandé de digérer les ovaires dans une solution de protéinase K à une concentration d'un microgramme par millilitre pendant 10 minutes. Les résultats de coloration montrent que l'intensité du signal est significativement accrue dans les embryons traités à la protéinase K. L'incubation des embryons dans la solution de blocage provenant d'un jeu tampon basé sur la DIG réduit davantage la coloration de fond par rapport à celle des embryons placés dans du sérum de chèvre normal et de l'albumine sérique bovine.

L'activité endogène de la peroxydase peut également entraîner une coloration de fond élevée. Ces études révèlent que l'immersion des embryons de pucerons dans du méthanol peut supprimer l'activité peroxydase de manière beaucoup plus efficace que le traitement des embryons avec du peroxyde d'hydrogène. Les conditions critiques mises en évidence dans cette étude peuvent être appliquées pour la détection du signal aussi bien dans les cellules germinales que dans les cellules somatiques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière réaliser une immunomarquage réussi sur des embryons de pucerons, y compris l'amélioration de l'intensité du signal et la réduction de la coloration de fond. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement chaque embryon afin d'obtenir une bonne forme des embryons.

N'oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde et le DAPI peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure. Après cette procédure, d'autres mesures comme l'hybridation in situ peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si l'ARN messager est localisé avec son produit protéique dans les cellules embryonnaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie environnementale des insectes, telles que la manière dont les cellules germinales sont spécifiées, et comment les cellules ovulaires sont déterminées lors des phases reproductrices distinctes chez les pucerons.