Name: Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: Laugmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez une technique d'immunocoloration sur embryons de puceron du pois Acyrthosiphon pisum pour améliorer la perméabilité tissulaire et réduire le bruit de fond. Cette méthode optimise la détection d'expression protéique.

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Nous sommes reconnaissants à Chau-Ti Ting (Fly Core à Taïwan) pour avoir fourni l’anticorps monoclonal 4D9, à Technology Commons (TechComm) du College of Life Science NTU pour la microscopie confocale, à Hsiao-Ling Lu pour la relecture du manuscrit et à Chen-yo Chung pour son aide au tournage. CC remercie tout particulièrement Charles E. Cook pour ses suggestions stratégiques et pour l’édition critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie (101-2313-B-002-059-MY3 et 104-2313-B-002-022-MY3 pour GWL et CC), et l’Université nationale de Taiwan (NTU-CESRP 101R4602D3 pour CC ; 103R4000 pour GWL).

1. Culture de pucerons NOTE:. La souche de laboratoire de l&#39;parthénogénétique vivipare puceron du pois A pisum été initialement collectées dans le centre de Taiwan et a été élevé sur les plantes hôtes (le sativum jardin pois Pisum ou la fève Vicia faba) sous photopériode de jours longs pour plus de 300 générations (une génération: ~ 10 jours). <ol><li> Germination des graines <ol><li> Faire tremper les graines de plantes hôtes dans l&#39;eau du robinet pendant 3-5 jours à température ambiante. Remplir avec de l&#39;eau fraîche une fois par jour. NOTE: Vous pouvez également mettre des graines de plantes hôtes directement dans un sol humide peut induire la germination ainsi. </li><li> Croître de 10 graines en germination dans un petit pot (9 cm de diamètre x 7 cm de haut) avec le sol dans la chambre de croissance sous photopériode de 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 20 ° C. </li><li> Environ 10 jours après le début de la croissance, de transférer les pucerons sur les plantes dont la hauteur est de plus de 8 cm. </li></ol></li><li> Transfert des pucerons <ol&gt; <li> Gardez chaque pot de plantes dans un bécher de 1 L de verre, transférer 8 pucerons adultes sur les plantes à l&#39;aide d&#39;un pinceau, puis sceller le bécher avec une couverture perméable à l&#39;air comme de la gaze mailles pour empêcher les pucerons de se échapper. </li><li> Incuber les pucerons dans une chambre de croissance sous photopériode de 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 20 ° C. Arrosez chaque pot de plantes une fois par jour. </li><li> Pour l&#39;obtention de la prochaine génération de pucerons, réitérer les étapes 1.1.3-1.2.2 dix jours après le transfert de pucerons primaire. </li></ol></li></ol> 2. Dissection et la fixation des ovaires <ol><li> Fraîchement préparer paraformaldehyde à 4% (PFA) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme tampon de fixation. </li><li> Remplir un puits d&#39;une plaque de place avec PFA (environ 500 pi), placer la plaque sous un microscope stéréo à faible grossissement, et plonger un puceron adulte au sein de la PFA pour la dissection. </li><li> Disséquer ovaires en tenant la tête et l&#39;abdomen avec un jeu de pinces, coupe ouverte la dorsalecuticule de l&#39;abdomen, et en faisant glisser les ovaires loin de la cavité abdominale. </li><li> Fixer trois paires d&#39;ovaires dans un tube de 1,5 ml contenant 1 ml de PFA à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Tampon de fixation Décanter avec une pipette de transfert (verre ou jetable), puis lavez ovaires avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1X (PBST) 3 fois pour 10 minutes chacun. Secouant doux sur un mélangeur / rotateur (angle de rotation: 60 ° (F60) / vitesse de rotation: 8 RPM) est recommandée à la fois pour la fixation et le lavage. </li></ol> 3. traitement à la protéinase K (PK) pour augmenter la perméabilité des tissus embryonnaires NOTE: le traitement de PK est appliquée à partir d&#39;embryons extension de bande de germe en avant (stade 11 de développement). Pour les plus jeunes embryons, cette étape est facultative. <ol><li> Série diluer la solution stock de PK (10 mg / ml) avec 1x PBS à la concentration de travail 1 pg / ml. </li><li> Incuber ovaires avec 1 ug / ml de PK (environ 500 ul) pendant 10 minutes sous agitation douce. </li><li> Décanter PK solutisur, puis lavez les ovaires avec 700 pi de glycine (2 mg / ml) 3 fois pendant 5 minutes chacun. </li><li> Laver ovaires avec 0,2% PBST deux fois pour 10 minutes chacun. </li><li> Fixer ovaires nouveau avec un tampon de fixation pour 15 min à température ambiante sous agitation légère. </li><li> Rejeter le surnageant et laver ovaires avec 0,2% PBST deux fois pour 10 minutes chacun. </li></ol> 4. Méthanol incubation pour la répression de la peroxydase endogène (POD) activité NOTE: Le méthanol incubation est pas appliquée aux embryons soumis à la phalloïdine coloration ou d&#39;anticorps des epitopes qui sont sensibles methanol. <ol><li> Déshydrater en série avec ovaires pourcentage différent de methanol dans du PBST 0,2% (v / v: 1: 3, 1: 1, 3: 1) en incubant les ovaires à chaque concentration de la solution de methanol pendant 10 minutes avec agitation douce. </li><li> Déshydrater ovaires avec 100% de méthanol pendant 1 heure à température ambiante sous agitation légère. REMARQUE: Les résultats satisfaisants des taches pourraient encore être obtenus à partir de tissus de pucerons qui ont été stockées dans 100% de méthanol à -20 &amp;# 176; C pendant un mois. </li><li> Réhydrater en série avec ovaires pourcentage différent de methanol dans du PBST 0,2% (v / v: 3: 1, 1: 1, 1: 3) en faisant incuber les ovaires à chaque concentration de la solution de methanol pendant 10 minutes avec agitation douce. </li></ol> 5. Anticorps Coloration <ol><li> Diluer la solution 10x de blocage de l&#39;ensemble de tampon à base-DIG (DIG-B) à 1x. REMARQUE: La solution de blocage 1x DIG-B est plus efficace pour réduire l&#39;arrière-plan de la coloration que le réactif de type blocage composée de 5% (v / v) de sérum de chèvre normal (NGS) et 0,5% (v / v) de sérum-albumine bovine (BSA ) dans du PBST à 0,2%. </li><li> Incuber les ovaires avec la solution DIG-B 1x blocage pendant 2,5 à 4 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation douce. NOTE: Pour les trois paires d&#39;ovaires dans un tube de 1,5 ml, 200 pl est le volume minimum pour le blocage de l&#39;échantillon et l&#39;anticorps coloration. </li><li> Décanter le surnageant et la remplacer par une nouvelle solution de blocage 1x DIG-B contenant l&#39;anticorps primaire à diluti appropriéele ratio. Colorer les ovaires pendant 4 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation légère. REMARQUE: Pour l&#39;expérience décrite ici, utiliser les dilutions optimales suivantes d&#39;anticorps primaires: (1) anticorps ApVas1: 1: 500 pour la coloration chromogène, 1:50 pour immunofluorescence; (2) un anticorps anti-tubuline α: 1: 500; (3) anticorps monoclonal 4D9 de: 01:25. </li><li> Laver ovaires avec 0,2% PBST 4 fois pendant 15 min chacune. </li><li> Incuber ovaires avec une solution de blocage 1x DIG-B pendant 1 heure à température ambiante avec une agitation douce. </li><li> Décanter le surnageant et le remplacer par une solution fraîche 1x de blocage DIG-B contenant l&#39;anticorps secondaire à taux de dilution approprié. Colorer les ovaires pendant 4 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C avec une agitation légère. <ol><li> Utilisez les rapports de dilution suivantes d&#39;anticorps secondaires: (1) Pour immunofluorescence: 1: 500 pour Alexa Fluor 633 de chèvre anti-IgG de lapin ou Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris; (2) Pour la coloration chromogène: 1: 200 de chèvre biotinylé anti-IgG de lapin. NOTE: L&#39;anticorps secondaire biotinylé est appliquée pour interagir avec l&#39;avidine-biotine-complexe (ABC) dans le (chromogène) détection à base de substrat, à travers laquelle les signaux de coloration sont considérablement amplifiés. </li><li> Pour immunofluorescence, effectuer coloration dans l&#39;obscurité parce que l&#39;anticorps secondaire est sensible à la lumière. </li></ol></li><li> Laver anticorps secondaire avec 0,2% PBST 4 fois chacune pendant 10 minutes. </li></ol> 6. nucléaire et F-coloration de l&#39;actine NOTE: Ceci est appliqué seulement pour immunofluorescence. <ol><li> Colorer ovaires avec du PBST contenant 0,2% DAPI (2 ng / ul) et phalloïdine-TRITC (100 nM) pendant 2 heures à la température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver ovaires avec 0,2% PBST 4 fois chacune pendant 10 minutes. </li><li> Incuber ovaires avec le milieu de montage O / N à 4 ° C avec une agitation légère. </li></ol> 7. Développement Signal Note: Ceci est appliqué uniquement pour la coloration chromogène. <ol><li> Préparer 100 pi deréactif avidine-biotine-complexe (ABC) pour améliorer les signaux en ajoutant 1 pl de réactif A (avidine) dans 98 ul de 0,2% PBST, mélanger soigneusement par pipetage doux, et en ajoutant 1 pl de réactif B (biotine conjugué à la peroxydase de raifort ), suivi par un mélange immédiat. Incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante avec une agitation douce. </li><li> Incuber ovaires (y compris les chambres d&#39;oeuf dissociés) dans le mélange de réactifs A et B pendant 30 min à température ambiante avec une agitation douce. </li><li> Laver le mélange des réactifs A et B avec du PBST 0,2% 4 fois pendant 10 min chacune. </li><li> Transfert ovaires immergés dans du PBST à un puits sur la plaque de place avec un compte-gouttes en plastique. </li><li> Préparer la solution de substrat de la 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB): dissoudre une pastille de DAB plus une autre contenant de l&#39;urée peroxyde d&#39;hydrogène dans 1 ml de O 2 ddH par tourbillonnement vigoureux pendant 1 min. REMARQUE: DAB, un substrat précipitant de peroxydase, est un chromogène populaire pour immunocoloration. Il produit une brprécipité propre et insoluble après avoir été oxydé par la peroxydase. Des signaux faibles peuvent être améliorées par addition de chlorure de nickel à la solution de substrat (concentration finale de 0,05 à 0,08% de). </li><li> Retirer la solution de PBST restant dans le puits et le remplir avec 100 ul de la solution de substrat DAB pour le développement du signal. </li><li> Surveiller l&#39;intensité des signaux sous un microscope stéréo à faible grossissement. </li><li> Arrêtez réactions en retirant la solution DAB, suivie par le remplissage avec 1x PBS immédiatement. Répéter deux fois le lavage. </li><li> Transfert ovaires vers le tube de 1,5 ml, puis laver avec 1x PBS ou de PBST deux fois pour 15 minutes chacun. </li><li> Incuber ovaires dans un milieu de montage à base de glycérol (70% de glycerol) O / N à 4 ° C avec une agitation douce. </li></ol> 8. Montage du puceron embryons REMARQUE: L&#39;épaisseur des embryons de pucerons varie entre stades de développement. Stratégies de montage sont ainsi modifiées pour tenir début (germaria et les étapes 0-10), MID (stades11-18), et des embryons (stades tardifs 19-20), qui sont démontrées sur la figure 2B - D. Mise en scène embryonnaire suivi Miura et al 12. <ol><li> Transfert des ovaires avec un milieu de montage sur le plateau de la cellule avec un compte-gouttes en plastique et d&#39;observer les échantillons sous un microscope stéréo à faible grossissement. </li><li> Couper les calices associés à l&#39;oviducte latéral utilisant des broches insectes et ensuite transférer un ovariole isolé à un verre vide bien avec un compte-gouttes. Compléter le volume final à 50-100 ul en utilisant un milieu de montage. </li><li> Transférer un ovariole sur la lame avec un compte-gouttes de verre et ensuite disséquer chambres d&#39;œufs d&#39;insectes à l&#39;aide de broches. NOTE: Pour les embryons âgés de plus de 6 stade du développement, la séparation des chambres d&#39;œufs est suggéré; pour germaria et les deux premières chambres d&#39;œufs de moins de l&#39;étape 6, la séparation est facultative. </li><li> Relocaliser une chambre d&#39;oeuf disséqué à une lame propre en utilisant un compte-gouttes en verre. </li><li> Mettez une lamelle (taille: 22 x 22mm) sur les germaria disséqués ou chambres d&#39;œufs (contenant des embryons à des stades du développement 1-10) lentement pour éviter les bulles. <ol><li> Mont chambres d&#39;œufs (contenant des embryons à des stades du développement 11-18) sur une diapositive avec pont de lamelle d&#39;un côté et de placer une autre lamelle (taille: 18 x 18 mm) sur le dessus de l&#39;échantillon. </li><li> Mont chambres d&#39;œufs (contenant des embryons âgés de plus de 19 stade du développement) sur une lame à double-face pont lamelle et placer un autre lamelle (taille: 18 x 18 mm) sur le dessus de l&#39;échantillon. </li></ol></li><li> Remplir l&#39;espace sous la lamelle supérieure avec les médias de montage pour éviter le dessèchement de l&#39;échantillon. </li><li> Légèrement rouler l&#39;embryon en faisant glisser la lamelle pour obtenir le droit d&#39;orientation pour l&#39;observation. </li><li> Sceller le pourtour de lamelles (y compris les lamelles de pont) avec du vernis à ongles. </li></ol> 9. Analyse d&#39;imagerie <ol><li> Photo contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) des images de l&#39;ensemble du montage embryons avec un compound microscope optique équipé d&#39;DIC et une lentille d&#39;objectif sec (10X, 20X, 40X) relié à une caméra. Installez le logiciel de transfert d&#39;image entre la caméra et l&#39;ordinateur en utilisant les instructions du fabricant. </li><li> Acquérir projections des embryons marqués par fluorescence avec un laser à balayage microscope confocal 14. Suivez les instructions du fabricant pour photographier, z-empilage, et 3D projection avec un logiciel d&#39;imagerie. <ol><li> Tournez la lame à l&#39;envers, trouver l&#39;échantillon monté avec objectif 10x, et encercler la zone de l&#39;échantillon avec un stylo à base huilée bien. NOTE: Cela rend l&#39;identification de l&#39;échantillon plus facile lors de la recherche à travers des objectifs d&#39;un microscope confocal. </li><li> Ajouter une goutte d&#39;huile sur le dessus de la zone de lamelle dont le côté opposé est marqué comme décrit au point 9.2.1. </li></ol></li><li> Trouver le plan focal à 40X objectif à immersion d&#39;huile puis changer pour un objectif à immersion d&#39;huile 63X. Déplacer manuellement le réglage fin de mise au point et faireWN pour capturer le meilleur plan focal. NOTE: Pour observer des détails structurels de germaria et embryons précoces, nous vous conseillons d&#39;utiliser 40X objectifs ou ceux avec un plus fort grossissement. </li><li> Balayez l&#39;embryon dans différents canaux d&#39;excitation et d&#39;obtenir une image z-stack. NOTE: Pour les tissus de pucerons du pois, de réduire l&#39;épaisseur de chaque section optique jusqu&#39;à 1,5 um ou moins. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons identifié des conditions optimales critiques immunocoloration succès dans le puceron du pois A. Pisum, un organisme modèle émergent des études de génomique et de développement 3,15. Des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité du tissu et réduire la coloration de fond amélioré l&#39;intensité et la spécificité des signaux. Ils diffèrent des protocoles standard pour immunocoloration dans d&#39;autres modèles animaux dans les étapes de création de pores dans les membrane...

Les pucerons sont des insectes hémiptères avec des petits (1-10 mm) corps mous. Ils se nourrissent de plantes en suçant la sève de phloème pièces buccales perçants. En outre, ils comptent sur ​​une bactérie endosymbiotique obligatoire, Buchnera aphidicola, pour synthétiser des acides aminés essentiels qui sont déficients dans le régime alimentaire de la sève du phloème. Les pucerons ont une histoire de vie complexe qui comprend la reproduction vivipare parthénogénétique au printemps et en photopériode longue journée d&#39;été et la reproduction ovipare sexuelle déclenchée par une photopériode de jours courts pendant laquelle ils pondent un nombre limité de 1,2 œufs d&#39;hiver. Au printemps ces œufs éclosent pour produire la première génération de toutes les femelles fondatrices (pucerons), à la suite de nombreux cycles de reproduction parthénogénétique jusqu&#39;à l&#39;automne. La parthénogenèse cyclique chez les pucerons, où les phases sexuée et asexuée alternent dans le cycle de vie annuel, a été considéré comme une nouveauté 1,2 évolutif. Dans les pucerons vivipares parthé, L&#39;embryogenèse a lieu dans des chambres d&#39;œufs des tubules ovariens (de ovarioles). En revanche, les embryons ovipares sexuels se développent dans les œufs fécondés. En dehors de la plasticité de la reproduction, les pucerons peuvent afficher polyphénisme aile transgénérationnel: en réponse aux signaux de la surpopulation et des menaces de prédateurs, les femelles asexuées sans ailes peuvent vivipares produire une descendance ailée pour la migration à longue distance. Publication de la séquence du génome du puceron du pois Acyrthosiphon pisum -la première séquence du génome d&#39;une base insectes permet hémimétaboles poursuite de l&#39;exploration de la plasticité de la reproduction, polyphénisme de l&#39;aile, et d&#39;autres fonctionnalités, y compris les interactions insectes-plantes, vectorisation virale et la symbiose de pucerons sur une moléculaire base 3. En plus de la séquence du génome, les outils permettant de caractériser la fonction des gènes et l&#39;expression sont nécessaires pour promouvoir le puceron du pois comme un organisme modèle mûre 4. Nous avons décrit les protocoles robustes de l&#39;ensemble de montage <em&gt; hybridation in situ pour détecter l&#39;expression de l&#39;ARNm dans les embryons de pucerons 5-7. L&#39;interférence ARN (ARNi) par injection d&#39;ARN double brin et de l&#39;alimentation a été utilisée pour le silençage génique dans nymphes de pucerons et les adultes, mais des conditions stables pour knockdown gène dans les embryons ont pas encore été signalé 8-10. Immunocoloration, une approche basée sur les anticorps qui peuvent détecter l&#39;expression de la protéine dans des échantillons avant et après knockdown ARNi, a été réalisée sur les embryons du puceron du pois 11-13. Cependant, l&#39;augmentation de la perméabilité des tissus et l&#39;élimination de la coloration de fond sont encore insatisfaisants utilisant des protocoles standards pour immunocoloration dans les embryons asexués vivipares du puceron du pois. Par exemple, nous avons trouvé que la pénétration des anticorps dans les tissus a diminué chez les embryons gastrulating (étapes 8 à 10) et que les embryons avec bourgeons des membres morphologiquement identifiables (étapes 13-14) ont été à peine perméable à l&#39;anticorps. En outre, la coloration de fond a été visualisée dans le vivíparo asexuéenous pois embryons de pucerons colorées utilisant un anticorps contre le marqueur de la lignée germinale Vasa ainsi que celle contre la protéine Engrailed / invected exprimé dans les segments embryonnaires 12,13. En fait, la coloration de fond était encore bien visible dans les embryons colorées avec l&#39;anticorps secondaire seul. Afin d&#39;augmenter la perméabilité sans endommager l&#39;intégrité des tissus de pucerons, nous augmentée avec précaution la concentration de protéinase K et déterminé les conditions optimales pour la digestion du tissu sur les embryons de pucerons. Afin d&#39;éviter la coloration non-spécifique dans le puceron du pois, nous avons cherché des composés qui pourraient bloquer efficacement les embryons et supprimer l&#39;activité de peroxydase endogène (POD), une enzyme utilisée pour amplifier des signaux pendant immunocoloration. Un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) jeu de tampons à base plutôt le sérum de chèvre normal traditionnellement utilisé (NGS) / sérum albumine bovine (BSA), réduit de façon significative la coloration de fond. En outre, le methanol a été trouvé à INHIbit l&#39;activité de POD endogène plus efficace que le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2). Les détails concernant ces conditions spécifiques pucerons pour un marquage sur les embryons seront décrits dans les sections suivantes.

<table><tbody><tr><td>30 % d’hydrogène perxidase (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Pour le blanchiment de la peroxydase endogène des embryons.</td></tr><tr><td>4' 6-diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Pour le marquage de l’ADN double brin. TOXIQUE. Porter des gants, distribuer dans de petites aliquotes et feeze pour minimiser l’exposition</td></tr><tr><td>4D9 anticorps monoclonal de souris anti-engrêlée/invectivée Études</td><td>de développement banque d’hybridomes</td><td>AB_528224</td><td>Pour l’étiquetage des segments en développement de l’embryon.</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal de lapin ApVas1</td><td>Notre laboratoire</td><td>N/A</td><td>Pour le marquage de la protéine Vas1 spécifique de la lignée germinale du puceron dans les embryons. Cet anticorps a été fabriqué par notre laboratoire.</td></tr><tr><td>Austerlitz Épingles à insectes</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Pour séparer chaque chambre d’œuf d’un ovariole. Taille 000, ÉMAILLÉ NOIR.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps.</td></tr><tr><td>Appareil photo connecté au microscope composé</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>Pour la photographie d’embryons de pucerons.</td></tr><tr><td>Plateau colorimétrique à 8 cellules</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Pour développer le signal de coloration des embryons de pucerons. Diamètre 95 x 57 mm, profondeur de la cellule 2 mm.</td></tr><tr><td>Microscope composé avec optique DIC</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>Pour la photographie d’embryons de pucerons montés sur les lames.</td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Sigma-Aldrich (Roche 11585762001</td><td></td> <td>Pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps. Nous avons dilué la solution de blocage 10x en 1x comme réactif de blocage.</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>Pour la dissection des ovaires des pucerons. Pièce du fabricant n° 5 : 5 SA.</td></tr><tr><td>Compte-gouttes en verre</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour le transfert des ovaires des pucerons de la plaque à splot aux tubes. 150 mm de longueur totale et 5 3/4" de longueur de pointe.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Pour l’élimination des embryons de pucerons et le montage.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Pour bloquer l’activité enzymatique de la protéinase K (PK).</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG conjuguée Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Pour la détection de l’anticorps primaire de la souris.</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG conjuguée Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Pour la détection de l’anticorps primaire du lapin.</td></tr><tr><td>Mélangeur Intelli</td><td>ELMI équipement de laboratoire</td><td>RM-2M</td><td>Pour améliorer la réaction globale des réactifs avec les ovaires.</td></tr><tr><td>Microscopie confocale à balayage laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Pour la photographie d’embryons de pucerons montés sur les lames avec étiquette florécente.</td></tr><tr><td>méthanol&nbsp ;</td><td>Burdick et Jackson</td><td>AH2304</td><td>Pour le blanchiment de la peroxydase endogène des embryons.</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>Pour le montage des embryons. Chants rectifiés SUPERFROST, env. 76 x 26 millimètres.</td></tr><tr><td>Microscope Lunettes de protection</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>Pour le montage des embryons sur les lames. Taille 18 x 18 mm. Epaisseur n° 1 (0,13 à 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Microscope Lunettes de protection</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Pour le montage des embryons sur les lames. Taille 22 x 22 mm. Epaisseur n° 1 (0,13 à 0,16 mm)</td></tr>anticorps <tr><td>monoclonal anti-alphatubuline de souris (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Pour le marquage de la distribution de l’alpha-tubuline des cellules.</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour sceller les lamelles sur les lames.</td></tr><tr><td>Sérum normal de chèvre (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Pour la fixation des ovaires des pucerons.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>Pour le marquage de la distribution de l’actine F sur les embryons.</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Comme solution isotonique pour les ovaires de pucerons.</td></tr><tr><td>Compte-gouttes en plastique</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour le transfert des ovaires des pucerons du tube au plateau cellulaire. Contenance 3 ml.</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>Pour créer des pores (poinçonnage) sur la membrane cellulaire et faciliter l’accès des anticorps.</td></tr><tr><td>Plaque spot en pyrex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour la dissection et les réactions de couleur des ovaires des pucerons sous microscopie. Chaque cavité d’un diamètre de 22 mm et&nbsp ; profondeur 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzidine (DAB) comprimés&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Pour le développement de signaux substrats. Aussi appelé ensemble de comprimés de substrat de peroxydase DAB.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Pour la dissection et l’observation des ovaires de pucerons.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Pour créer des pores (poinçonnage) sur la membrane cellulaire.&nbsp ;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Laboratoires vectoriels</td><td>PK-6101</td><td>Pour l’amélioration du signal. Y compris d’anticorps secondaires IgG anti-lapin de chèvre biotinylés, de réactifs A et B.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Support de montage</td><td>Laboratoires vectoriels</td><td>H1000</td><td>Pour l’élimination des embryons de pucerons et le montage.</td></tr></tbody></table>

identification des conditions critiques pour immunocoloration dans le puceron du pois embryons: l&#39;augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Le Acyrthosiphon pisum du puceron, avec un génome séquencé et la plasticité phénotypique abondante, est devenue un modèle émergent des études de génomique et de développement. Comme d&#39;autres pucerons, A. Pisum propager rapidement par reproduction vivipare parthénogénétique, où les embryons se développent dans des chambres d&#39;œufs dans une chaîne de montage dans le ovariole. Auparavant, nous avons établi une plate-forme robuste de l&#39;ensemble de montage hybridation in situ permettant la détection de l&#39;expression des ARNm dans les embryons de pucerons. Pour l&#39;analyse de l&#39;expression de la protéine, cependant, les protocoles établis pour immunocoloration les ovarioles de pucerons vivipares asexués n&#39;a pas produit de résultats satisfaisants. Nous rapportons ici des conditions optimisées pour augmenter la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond, qui étaient tous deux des problèmes lors de l&#39;application des approches établies. Optimisations incluent: (1) l&#39;incubation de la protéinase K (1 pg / ml, 10 min), qui a été trouvé f essentielleou la pénétration d&#39;anticorps dans les embryons à moyen et pucerons en fin de ligne; (2) le remplacement de sérum-albumine de sérum de chèvre / bovin normal avec un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) à base de jeu de tampons et (3) l&#39;application de méthanol au lieu du peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pour le blanchiment de peroxydase endogène; qui réduit de manière significative le bruit de fond dans les tissus de pucerons. Ces conditions critiques optimisés pour un marquage permettra une détection efficace des produits de gènes dans les embryons de A. Pisum et autres pucerons.

Dans cette étude, nous avons effectué tout le montage immunocoloration sur des embryons de pucerons du pois asexuées (figure 1A). Ces femelles produisent progéniture par parthénogenèse et vivipares. Ces embryons femelles se développent dans des chambres d&#39;œufs des tubules ovariens (de ovarioles) (figure 1B et figure 2A). Avant la microscopie, les ovarioles disséqués sont les cibles de coloration; Toutefois, la séparation des chambres...

Un protocole d’immunomarquage complet sur des embryons de pucerons est présenté, dans lequel les conditions critiques pour diminuer la coloration de fond et augmenter la perméabilité tissulaire sont abordées. Ces conditions sont spécifiquement développées pour la détection efficace de l’expression des protéines dans les tissus embryonnaires des pucerons.

Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L&#39;augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

L'objectif général de ce protocole d'immunomarquage est de détecter l'expression protéique dans les embryons de pucerons. Des conditions critiques sont identifiées afin d'augmenter la perméabilité des tissus et de réduire la coloration de fond, deux problèmes persistants lors de la coloration des tissus embryonnaires de pucerons. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle fournit des conditions spécifiques permettant une pénétration efficace des anticorps et une réduction de la coloration de fond, conditions qui ne sont généralement pas décrites dans un protocole d'immunomarquage standard.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette mesure lorsque nous étudiions la façon dont les cellules germinales sont spécifiées chez le puceron du pois, un modèle d'insecte utilisé pour des études génomiques et environnementales. La souche de laboratoire du puceron du pois, a. pisum, a été initialement collectée dans le centre de Taïwan et a été élevée sur des plantes hôtes pendant plus de 300 générations.Pour la germination, faire tremper les graines des plantes hôtes dans de l'eau du robinet pendant trois à cinq jours à température ambiante. Renouveler l'eau fraîche une fois par jour. Faire pousser dix graines en germination dans un petit pot avec du sol, dans une chambre de croissance sous un photopériode de 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité, à 20 degrés Celsius.Environ 10 jours après le début de la croissance, la hauteur des plantes dépasse généralement huit centimètres. Maintenir chaque pot de plantes dans un bécher en verre d'un litre et transférer les pucerons adultes sur les plantes à l'aide d'un pinceau. Ensuite, sceller le bécher avec un couvercle perméable à l'air, tel qu'une maille en gaze, afin d'empêcher les pucerons de s'échapper.Incuber les pucerons dans une chambre de croissance sous un photopériode de 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité, à 20 degrés Celsius, en arrosant chaque pot de plantes une fois par jour. Remplir une cavité d'une plaque de culture avec environ 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 pour cent. Placer la plaque sous un stéréomicroscope à faible grossissement, puis immerger un puceron adulte dans le paraformaldéhyde pour la dissection.Dissez les ovaires en tenant la tête et l'abdomen avec une pince, en incisant la cuticule dorsale de l'abdomen et en extrayant les ovaires de la cavité abdominale. Ensuite, fixez trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 millilitre contenant un millilitre de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 20 minutes, avec un léger agitation sur un agitateur. Éliminez le tampon de fixation à l’aide d’une pipette en verre, puis lavez les ovaires avec du PBST trois fois pendant 10 minutes, avec un léger agitation.Pour traiter les ovaires, commencez par les incuber avec la protéinase K pendant 10 minutes sous agitation douce afin d'augmenter la perméabilité des tissus embryonnaires. Après l'incubation, éliminez la solution de protéinase K, puis lavez les ovaires avec 700 microlitres de glycine, trois fois pendant cinq minutes. Ensuite, lavez les ovaires avec du PBST deux fois pendant 10 minutes.Fixer à nouveau les ovaires avec le tampon de fixation pendant 15 minutes à température ambiante sous agitation douce. Pour supprimer l'activité peroxydase endogène, déshydrater successivement les ovaires à l'aide de différents pourcentages de méthanol dans du PBST à 0,2 pour cent selon des rapports volumétriques de un à trois, un à un et trois à un, puis poursuivre l'incubation des ovaires avec du méthanol à 100 pour cent pendant une heure à température ambiante sous agitation douce. Ensuite, réhydrater progressivement les ovaires, comme indiqué dans le protocole écrit.Pour trois paires d'ovaires dans un tube de 1,5 millilitre, 200 microlitres est le volume minimal requis pour le blocage de l'échantillon et la coloration par anticorps. Incuber les ovaires avec la solution de blocage DIG-B 1x pendant quatre heures à température ambiante, ou toute une nuit à quatre degrés Celsius, sous agitation douce. Après l'incubation, éliminer le surnageant et le remplacer par une solution de blocage DIG-B 1x fraîche, contenant l'anticorps primaire au ratio de dilution approprié.Colorer les ovaires pendant quatre heures à température ambiante, ou toute la nuit à quatre degrés Celsius avec agitation douce. Après avoir lavé les ovaires comme décrit dans le protocole, jeter le surnageant et le remplacer par une solution de blocage DIG-B 1x fraîche contenant l'anticorps secondaire dilué au rapport approprié, puis colorer les ovaires comme précédemment. Pour la coloration immunofluorescente, effectuer la coloration à l'abri de la lumière, car l'anticorps secondaire est sensible à la lumière.L'épaisseur des embryons de pucerons varie selon les stades de développement. Les stratégies de montage sont donc adaptées aux embryons précoces, intermédiaires et tardifs. Transférez les ovaires, accompagnés du milieu de montage, dans le plateau de cellules à l’aide d’une pipette en plastique, puis observez les échantillons au microscope stéréo à faible grossissement.Couper les callosités associées à l'oviducte latéral à l’aide d’aiguilles entomologiques, puis transférer un ovariole isolé dans une cavité en verre vide à l’aide d’une pipette. Ajuster le volume final entre 50 et 100 microlitres à l’aide du milieu de montage. Ensuite, transférer un ovariole sur la lame à l’aide d’une pipette en verre.Disséquez les chambres ovariennes à l'aide d'épingles à insectes. Pour les embryons âgés de plus de six stades de développement, il est recommandé de séparer les chambres ovariennes. Pour les germariums et les deux premières chambres ovariennes, la séparation est facultative.Déplacer une chambre œuf disséquée sur une lame propre à l’aide d’une pipette en verre. Pour les embryons aux stades 1 à 10 de développement, poser lentement une lamelle sur les germariums ou chambres œuf disséqués afin d’éviter les bulles. Alternativement, pour les embryons aux stades 11 à 18 de développement, monter les chambres œuf sur une lame avec un pont de lamelle unilatéral, puis placer une autre lamelle par-dessus l’échantillon.Pour les embryons dont le stade de développement est supérieur au stade 19, monter les caméras à œufs sur une lame à l’aide d’un pont constitué de deux lamelles collées, puis placer une autre lamelle par-dessus l’échantillon. Ensuite, remplir l’espace sous la lamelle supérieure avec un milieu de montage afin d’éviter que l’échantillon ne s’assèche. Faire rouler doucement la lamelle supérieure afin d’obtenir l’orientation adéquate pour l’observation.Enfin, sceller le pourtour des lamelles, y compris les lamelles de pont, avec du vernis à ongles avant d'effectuer l'analyse d'image, comme décrit dans le protocole écrit. On observe ici une paire d'ovaires disséqués à partir d'une femelle adulte. Un ovariole est composé d'un germarium, d'un à deux sites O, ainsi que de cinq à sept embryons, tous logés dans des chambres ovariennes selon un mode de disposition en chaîne de montage.Après fixation par le paraformaldéhyde, il est fortement recommandé de digérer les ovaires dans une solution de protéinase K à une concentration d'un microgramme par millilitre pendant 10 minutes. Les résultats de coloration montrent que l'intensité du signal est significativement accrue dans les embryons traités à la protéinase K. L'incubation des embryons dans la solution de blocage provenant d'un jeu tampon basé sur la DIG réduit davantage la coloration de fond par rapport à celle des embryons placés dans du sérum de chèvre normal et de l'albumine sérique bovine.L'activité endogène de la peroxydase peut également entraîner une coloration de fond élevée. Ces études révèlent que l'immersion des embryons de pucerons dans du méthanol peut supprimer l'activité peroxydase de manière beaucoup plus efficace que le traitement des embryons avec du peroxyde d'hydrogène. Les conditions critiques mises en évidence dans cette étude peuvent être appliquées pour la détection du signal aussi bien dans les cellules germinales que dans les cellules somatiques.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière réaliser une immunomarquage réussi sur des embryons de pucerons, y compris l'amélioration de l'intensité du signal et la réduction de la coloration de fond. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement chaque embryon afin d'obtenir une bonne forme des embryons.N'oubliez pas que le travail avec le paraformaldéhyde et le DAPI peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure. Après cette procédure, d'autres mesures comme l'hybridation in situ peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si l'ARN messager est localisé avec son produit protéique dans les cellules embryonnaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie environnementale des insectes, telles que la manière dont les cellules germinales sont spécifiées, et comment les cellules ovulaires sont déterminées lors des phases reproductrices distinctes chez les pucerons.

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