Name: Création de souches du cancer de cultures de cellules de Human ostéosarcome conventionnel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules souches cancéreuses à partir de biopsies d'ostéosarcome humain. Cette méthode démontre l'essai de formation de sarcosphères pour la recherche en oncologie et le développement de thérapies ciblées.

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Cette étude a été financée par la proposition de subvention ITT (Istituto Toscano Tumori) 2010.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêt financier concurrent.

CSCs ont plusieurs propriétés qui permettent l&#39;identification de ce sous-ensemble cellulaire particulier dans la masse de la tumeur. Sur la base de ces caractéristiques, telles que la résistance acquise cytotoxiques des agents chimiothérapeutiques pour la surexpression de l&#39; ATP-binding cassette multirésistantes transporteurs d&#39;efflux 28, 32, 33, ou pour la régulation positive de l&#39;expression des enzymes de détoxication tels que ALDH 32, pour l&#39;expression d&#39;un marqueur de surface particulier, tel que le CD133, CD44, CD34, CD90, et les autres 30, 34, 35, 41, plusieurs méthodes différentes pour isoler des cellules souches cancéreuses ont été développés 42-44. Une de ces techniques est le test de formation sphère, qui est basée sur la capacité des cellules souches cancéreuses à se développer dans des conditions non-adhérentes. La capacité des cellules souches des tissus et cellules souches cancéreuses pour former des sphères a été décrite dans les études sur l&#39;identification des cellules souches neurales par Reynolds et al. , 37. Par la suite, Gibbs et al. Nous 38ed ces études pour commencer à isoler les cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs solides, en particulier, de sarcomes des os. Nous avons décidé d&#39;utiliser la méthode de test de formation de la sphère illustrée par Gibbs et al. Pour isoler CSCs partir de lignées cellulaires OSA obtenues à partir de biopsies OS classiques. Nous avons adapté la méthode originale pour améliorer les résultats de cet essai et de faciliter sa reproductibilité d&#39;autres lignées de cellules cancéreuses. En ce qui concerne la mise en place de l&#39;essai de formation de la sphère, nous avons vérifié que le placage de 40.000 cellules / est bien une bonne pratique pour le maintien des cellules dans l&#39;isolement au début de l&#39;essai. Cette astuce est très important d&#39;éviter la possibilité que les colonies sphériques proviennent de l&#39;agrégation cellulaire et non pas de la capacité particulière et exclusive d&#39;un seul SCC à se développer dans des conditions non-adhérentes et former une colonie sphérique. Cette capacité est un point particulièrement critique de cet essai. Nous avons également certifié que pour obtenir un bon taux de formation de la sphèreIl suffit pour rafraîchir des aliquotes de facteurs de croissance, tous les 3 jours et pas tous les jours, comme décrit dans la méthode originale. Dans cette étude, nous avons également établi et largement décrit une bonne méthode pour isoler les colonies sphériques qui se sont formées lorsqu&#39;elles sont cultivées dans des conditions non-adhérentes. Cette étape est essentielle dans cet essai car il est très important d&#39;essayer d&#39;isoler le plus grand nombre de sphères possibles qui sont formées dans chaque puits sans les endommager. Il est également important d&#39;isoler uniquement les sphères et non les cellules individuelles, ce qui pourrait rester en suspension pendant toute la durée de l&#39;essai. Pour surmonter ces points critiques, nous avons mis au point une méthode d&#39;isolement particulière, qui, comme indiqué ci-dessus, a donné de bons résultats pour l&#39;isolement du SCC. De toute évidence, il existe la possibilité que toutes les sphères qui se sont formés peuvent être récupérés, mais le pourcentage de perte est très faible. En effet, nous avons aussi la possibilité d&#39;utiliser un filtre de 40 um pores pour isoler les sphères après qu&#39;ils deviennent grandes (formeed environ 100 - 200 cellules). Cet isolement arrête la formation sphère mais permet aux cellules individuelles, une partie du résidu de méthylcellulose, et les plus petites sphères à filtrer. Cette élimination est effectuée par filtration complète comme décrit dans le protocole. Par ailleurs, la sélection des colonies les plus grandes sphériques à travers les mailles de 40 um, avec la perte des plus petites colonies sphériques permet de sélectionner les cellules souches cancéreuses avec la plus grande capacité à former des colonies sphériques et avec une plus grande stemness. Toutes ces modifications ont été réalisées pour améliorer l&#39;analyse et d&#39;aider les chercheurs qui étudient CSCs à comprendre et à reproduire l&#39;étape la plus critique de la méthode originale de l&#39;essai de formation de la sphère. Parmi les études portant sur des méthodes in vitro pour CSCs isolement, cette étude visait à montrer comment ce test de formation de la sphère adaptée pourrait être une bonne méthode pour isoler CSCs delignées cellulaires OSA. Les adaptations à la méthode originale et la technique d&#39;isolation détaillée décrit l&#39;amélioration de son efficacité. En peu de temps, un bon nombre de CSCs peut être obtenu et utilisé pour plusieurs expériences. Par conséquent, il est possible de confirmer rapidement les phénotypes de souches ressemblant et, en particulier, pour étudier la double phénotype de tige qui caractérise OS-CSCs. Ainsi, cet essai modifié pourrait être une bonne technique pour isoler CSCs et étudier leur biologie. Dans l&#39;avenir, cette méthode, avec des adaptations supplémentaires, peuvent également être utilisés pour isoler les cellules souches cancéreuses provenant d&#39;autres lignées de cellules cancéreuses fini obtenues par des biopsies de tumeurs solides rares. La possibilité d&#39;isoler CSCs de tumeurs solides rares, comme OS, permet non seulement l&#39;amélioration des études sur ce cancer particulier, mais étend également à des études de différents types de cancer pour développer de meilleures méthodes pour leur isolement et à des études futures de la biologie de ce sous-ensemble cellulaire importante. Par conséquent, nousont fait dans cette étude, il est important d&#39;améliorer les méthodes de CSC isolement par l&#39;étude de CSC biologie, avec l&#39;objectif final de trouver des cibles moléculaires et le développement d&#39;un traitement anticancéreux très spécifique dirigé contre ce sous-ensemble cellulaire particulier, ce qui est probablement responsable de le maintien de la tumeur primaire, le développement de sa récurrence, et l&#39;origine de métastases dans plusieurs organes. L&#39;étude de la biologie du SCC est également important pour trouver des thérapies qui pourraient être incisive dans le traitement de cancers, tels que OS, pour lesquels le taux de survie après un traitement néoadjuvant reste très pauvre.

Les sarcomes sont un groupe hétérogène de tumeurs rares du tissu conjonctif malignes provenant principalement du mésoderme embryonnaire 1. Les différents types comprennent les sarcomes osseux et des sarcomes des tissus mous. sarcomes osseux, un groupe de tumeurs primaires relativement rares, se composent de plusieurs sous-types, y compris l&#39;ostéosarcome (OS). Système d&#39; exploitation, l&#39; un des tumeurs primaires les plus courantes de l&#39;os, est une tumeur maligne mésenchymateuse qui présente une étendue cliniques, histologiques et hétérogénéités moléculaire 2, 3. Malheureusement, le système d&#39; exploitation se produit principalement chez les enfants et les jeunes adultes 4, 5 et représente 60% les sous - types histologiques communs de sarcome des os dans l&#39; enfance 6, 7. OS affecte habituellement les zones du squelette, qui se caractérisent par une croissance rapide des os (par exemple, la métaphyse des os longs). Parmi les différents sous-types histologiques d&#39;OS, OS classique, également appelé médullaires ou OS central, a un haut degré de malignité et un sha de quotasre de 8 à 80%. Cette 80% est composé de 60% OS classique ostéoblastique, 10% chondroblastique OS, OS et 10% fibroblastique 6, 8-10. D&#39;autres sous-types de systèmes d&#39;exploitation comprennent anaplasique, télangiectasique, géant riche en cellules et un petit OS cellulaire. Malgré les progrès de la chirurgie combinée et de la chimiothérapie dans la gestion du système d&#39;exploitation, le résultat reste faible, avec un taux de survie à long terme de 65-70% chez les patients sans métastases 11, 12. Récurrences Distant se produisent fréquemment comme des métastases pulmonaires ou, moins fréquemment, comme les métastases aux os lointains et récurrences locales 13. Les métastases sont souvent résistantes aux traitements conventionnels. Cette résistance est la raison pour laquelle la survie sans maladie à 10 ans est d&#39; environ 30% chez les patients présentant une maladie métastatique au moment du diagnostic 14, 15. Comme dans le cas des tissus normaux, les tissus cancéreux se compose d&#39;un ensemble hétérogène de types de cellules. Cellules au sein de la tumeur semblent correspondre à différents stades de développement. Dans tout nOrmal tissu réside une sous-population de cellules ayant la capacité de selfrenew, fournissant ainsi des progéniteurs et des cellules matures de l&#39;homéostasie tissulaire. De même, le cancer est composé d&#39;une population hétérogène de cellules semblables à différents stades de développement, avec différents degrés de prolifération et le potentiel tumorigène. Un sous - ensemble de ces cellules cancéreuses, appelés cellules souches cancéreuses (CCM), constitue un réservoir de selfsustaining cellules ayant la capacité exclusive selfrenew et de maintenir le potentiel de malignité de tumeurs, générant ainsi les différentes lignées cellulaires qui constituent la majeure partie de la tumeur 16. Dans les années 1990, des études sur la leucémie myéloïde aiguë ont fourni la première preuve convaincante de l&#39;existence de sous - populations du SCC 17, 18. CSCs ont depuis été isolé à partir d&#39; un grand nombre de tumeurs solides 19, devenant ainsi l&#39; un des sujets les plus étudiés dans la recherche sur le cancer. CSCs peut en effet provenir de cellules souches normales par des mutations dans les gènes qui rendent la normaleles cellules souches cancéreuses 20-23. mutations transformant multiples et les interactions avec le microenvironnement pourraient également contribuer à progéniteurs saines et les cellules matures acquièrent la capacité selfrenewal et de l&#39;immortalité qui caractérisent CSCs. Il existe plusieurs hypothèses au sujet de cette transformation. Progéniteurs saines, les cellules matures saines, et les cellules cancéreuses, peuvent dédifférencier aux cellules souches, l&#39; obtention d&#39; un phénotype de tige en activant des gènes selfrenewal associée 24-28. Malgré plusieurs études récentes, les origines de CSCs ont encore à découvrir. Une caractéristique particulière de CSCs est que leur capacité à résister à l&#39;approche multi-thérapie, qui se compose de la chirurgie et de la chimiothérapie combinée avec différents médicaments. Des études récentes ont montré que CSCs peut également acquérir une résistance aux cytotoxiques des agents de chimiothérapie. Les explications possibles de cette résistance comprennent la surexpression de l&#39; ATP-binding cassette (ABC) transporteur multidrogue (ie,MDR1 et BCRP1), la surexpression d&#39;enzymes métabolisant chimiothérapeutiques tels que l&#39; aldéhyde déshydrogénase 1 (ALDH1), et / ou des modifications dans la cinétique du cycle cellulaire , 30-33. La conséquence directe de tous ces concepts qui ont été décrits à ce jour est que le traitement du cancer serait efficace que si la sous-population du SCC ont été complètement éliminé, alors que la récidive locale ou de métastases à distance pourraient se produire si un seul SCC a survécu. La découverte de CSCs dans les sarcomes humaine 34, en particulier OS 35, ou dans d&#39;autres cancers des os et des tissus mous, a une grande importance clinique , car il offre une explication possible pour expliquer pourquoi de nombreux traitements semblent être efficaces au début, mais les patients plus tard rechute. Par conséquent, l&#39;espoir pour la future bataille contre OS classique consiste à trouver de nouvelles et spécifiques thérapies ciblées sur la base du développement de médicaments innovants destinés aux OS-CCM grâce à la caractérisation moléculaire de ce sousla population et à l&#39;étude de CSC biologie. En 1992, Reynolds et collègues, qui cherche à déterminer si un sous - ensemble de cellules souches est présente dans le cerveau adulte de mammifère, ont développé une méthode pour isoler des cellules suspectées d&#39;être des cellules 36, 37 souches analogues. Cette méthode est basée sur l&#39;aptitude particulière de ces cellules pour former des colonies sphériques lorsqu&#39;elles sont cultivées dans des conditions non adhérentes. Des techniques similaires ont été employés par Gibbs et ses collègues en 2005 pour étudier une sous - population de cellules souches comme dans l&#39; os sarcomes 38. Pour isoler et caractériser OS-CSCs à partir de cultures de cellules primaires de différents types d&#39;OS classique, nous avons décidé d&#39;adapter cette technique pour les lignées cellulaires OS. Ici, nous décrivons cette méthode adaptée de l&#39;essai de formation de la sphère, appelée &quot;test sarcosphere&quot;, qui peut être utilisé pour isoler les cellules souches cancéreuses OS à partir de lignées de cellules primaires dérivées finies à partir de biopsies humaines du système d&#39;exploitation classique. Nous décrivons également toutes les techniques used pour valider la tige comme CSC phénotype des lignées de cellules isolées par ce test: 1) l&#39;évaluation de l&#39;expression des gènes qui caractérisent les cellules souches embryonnaires pluripotentes (CES) et du gène CD133, qui est un marqueur de CSCs; 2) (UFC) Essai de formation de colonies unité; 3) l&#39;évaluation de la capacité de ces cellules à se différencier en ostéoblastes et les adipocytes dans des conditions de différenciation appropriées; 4) étude des marqueurs de surface de cellules souches mésenchymateuses (CSM) (c. -à- CD44, CD105 et Stro-1) par immunofluorescence et par analyse de cytométrie de flux; 5) l&#39;évaluation de l&#39;activité de ALDH de ces cellules.

<table><tbody><tr><td>Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec Ca2+ et Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco&nbsp ; sans Ca2+ et Mg2+ (DPBS)</td><td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>Trypsine porcine 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>Solvant : DPBS. Concentration de la matière : Poudre</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Solvant : DPBS. Concentration de la matrice :</td></tr><tr><td>Poudre de collagénase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td>Solvant : solution tampon, pH 7,4. Concentration de la matière : Poudre</td></tr><tr><td>de diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>BDH Chemicals-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>Mélange de nutriments F-12 Jambon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>Solvant : Ultrapur dH2O. Concentration de la matière : Poudre</td></tr> de <tr><td>sel trisodique d’acide 2-phospho-L-ascorbique Sigma-Aldrich</td><td></td><td>49752</td><td>Solvant : DPBS. Concentration de la crosse : 5 mg/mL</td></tr><tr><td>&beta ;-Phosphate de glycérol sel disodique pentahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : 1 M</td></tr><tr><td>d’insuline. Humain recombinant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td><td>Solvant : NaOH 0,1 M. Concentration de la matrice : 10 mM</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Solvant : DMSO. Concentration de la matière : 500 mM</td></tr><tr><td>Indométacine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>Solvant : DMSO. Concentration de la matière : 200 mM</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>Solvant : DMSO. Concentration du stock :&nbsp ; 1 mM / 100 &micro ;M. Stocker dans de l’azote liquide pour maintenir l’activité biologique</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin Amérique du Sud&nbsp ;</td><td>EUROCLONE</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (PEN-STREP) 10 000 U/mL</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>Solvant : Ultrapur dH2O. Concentration du stock : 2 %</td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de putrescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>Solvant : Ultrapur dH2O. Concentration du stock : Poudre</td></tr><tr><td>apo-Transferrin&nbsp ;</td><td>Solvant Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>: DPBS. Concentration de la pâte : 25 mg/mL</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique humain (EFGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>Solvant : DPBS pH 7,4. Concentration du stock : 10 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de facteur de croissance des fibroblastes - Sigma-Aldrich humain basique</td><td></td> Solvant <td>F0291</td><td>: DPBS + 0,2 % BSA. Concentration du stock : 25 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>d’acide séléné</td><td></td><td>211176</td><td>Solvant : DPBS. Concentration de la matière : 30 mM</td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>Solvant : ETOH. Concentration de la matière : 10 mM</td></tr><tr><td>Bleu de toluidine O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Solvant : ultra-pur dH2O. Concentration de la matière : Poudre</td></tr><tr><td>Huile Rouge O</td><td>ICN Produits biochimiques</td><td>155984</td><td>Solvant : 2-Propanol. Concentration du stock :</td></tr><tr><td>Poudre Naphtol AS-MX Phosphate Sel disodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>Solvant : DMSO. Concentration de la crosse : Poudre</td></tr><tr><td>Fast Blue BB Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3378</td><td>Solvant : Tris HCL, pH 9,0. Concentration du stock : Poudre</td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB Sel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td>Solvant : Tris HCL, pH 9,1. Concentration du stock :</td></tr><tr><td>Poudre d’albumine sérique bovine, Fraction V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td>Solvant : DPBS. Concentration de la masse : 2 %</td></tr> <tr><td>Rouge d’alizarine S</td><td>ICN Biochemicals</td><td>100375</td><td>Solvant : Ultrapur dH2O. Concentration de la masse : Poudre</td></tr><tr><td>de formaldéhyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4 %</td></tr><tr><td>Triton-100X</td><td>MERCK</td><td>11869</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : 0,2 %. Danger - Utiliser uniquement sous le capot chimique</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>MERCK</td><td>2315</td><td>Solvant : DPBS . Concentration du stock : 200 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>MERCK</td><td>109634</td><td>Danger - Utiliser uniquement sous capot chimique</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (Souris monoclonale [SN6] à CD105 (FITC))</td><td>Abcam</td><td>ab11415</td><td>Liquide. Application :&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Cytométrie en flux (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (Souris monoclonale&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; [F10-44-2] à CD44 (PE/Cy7&reg ;) )</td><td>Abcam</td><td>ab46793</td><td>Liquide. Application :&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Cytométrie en flux (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD45&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (Souris monoclonale&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; [MEM-28] vers CD45 (PerCP))&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab65952</td><td>Liquide. Application :&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Cytométrie en flux (Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (Anticorps humain purifié CD105)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD10500</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : Lyophilisé. Application : Coloration par immunofluorescence (IF)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (Anticorps anti-CD44)&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>EPR1013Y(ab51037)</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : Lyophilisé. Application : Coloration par immunofluorescence (IF)</td></tr><tr><td>Ab-Stro-1&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (Souris anti-STRO-1)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>398401</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : Lyophilisé. Application :&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Cytométrie en flux (Flow Cyt)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Coloration par immunofluorescence (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (IgG anti-lapin (Alexa Fluor 488 IgG anti-lapin âne (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : Lyophilisé. Application : Coloration par immunofluorescence (IF)</td></tr><tr><td>FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>61-6511</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : Lyophilisé. Application :&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Cytométrie en flux (Flow Cyt)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Coloration par immunofluorescence (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 635 Phalloidin&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A34054</td><td>Solvant : DPBS. Concentration du stock : Lyophilisé. Application : Coloration par immunofluorescence (IF)</td></tr><tr><td>AutoMACS&trade ; Tampon de fonctionnement MACS Tampon de séparation</td><td>Miltenyi</td><td>130,091,221</td><td>liquide. Conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>QIAzol&reg ; Réactif de lyse</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td>Danger - Utiliser uniquement sous capot chimique</td></tr><tr><td>QUANTITECT&reg ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Kit de transcription inverse</td><td>QIAGEN</td><td>205314</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorophorm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Liquide. Danger - Utiliser uniquement sous une hotte chimique</td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>GELAIRE</td><td>BSB6A</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hotte chimique</td><td>ARREDI TECNICI&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Villa</td><td>Modello&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; DYNAMICA</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>EPPENDORF</td><td>5415R</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscopie confocale à balayage laser LSM 5109 Meta&nbsp ;</td><td>ZEISS_</td><td>&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>iCycler PCR Thermalcycler&nbsp ;</td><td>BIORAD_</td><td>&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>CyFlow&reg ; ESPACE&nbsp ;</td><td>(PARTEC)</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micrposcope inversé Axiovert 200M&nbsp ;</td><td>ZEISS_</td><td>&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Conteneur de congélation ,</td><td>Nalgene</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pipet-Aid original</td><td>pbiBrand</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>EPPENDORF</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre</td><td>SIGMA</td><td></td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>VICTOR3&Commerce ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>PERKIN ELMER_</td><td>&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes coniques&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (15 et 50 mL)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD FALCON</td><td>352096 (pour 15 mL)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 352070 (pour 50 mL)</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire multipuits traitée TC à 24 puits transparente et à fond plat</td><td>BD FALCON</td><td>353047</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaques à puits multiples à 6 puits transparents à fond plat ultra faible</td><td>CORNING</td><td>3471</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (5 et 10 mL)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD FALCON</td><td>357543 (pour 5 mL)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 357551 (pour 10 ml)</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Seringue (5mL)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>B|BRAUN</td><td>4617053V</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 100X20 mm&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>R&ouml ; hren Tubes&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (3,5 ml, 55 x 12 mm, PS)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>SARSTEDT</td><td>55,484</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60X15 mm&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD FALCON</td><td>353004</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques 1,5 mL&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>NALGENE</td><td>5000-1020</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fioles de culture cellulaire 25 cm&sup2 ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD FALCON</td><td>353014</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Filtre en filet en nylon, hydrophile</td><td>MERCK</td><td>NY4104700</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Porte-filtre Swinnex</td><td>MERCK</td><td>SX0002500</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pince à épiler en perry&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td><td>_&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dénoncer</td><td>_</td><td>_</td><td>_</td></tr></tbody></table>

création de souches du cancer de cultures de cellules de human ostéosarcome conventionnel

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Les améliorations actuelles dans la thérapie contre l&#39;ostéosarcome (OS) ont prolongé la vie des patients atteints de cancer, mais le taux de cinq ans de survie reste médiocre lorsque des métastases sont apparues. Le cellules souches du cancer (SCC) théorie soutient qu&#39;il existe un sous-ensemble de cellules tumorales dans la tumeur qui ont des caractéristiques de souches de type, y compris la capacité de maintenir la tumeur et de résister à la chimiothérapie polychimiothérapie. Par conséquent, une meilleure compréhension de la biologie et de la pathogenèse OS est nécessaire pour faire avancer le développement de thérapies ciblées pour éradiquer ce sous-ensemble particulier et de réduire la morbidité et la mortalité chez les patients. Isoler CSCs, établir des cultures de cellules de CSCs, et l&#39;étude de leur biologie sont des étapes importantes pour améliorer notre compréhension de la biologie et de la pathogenèse OS. La mise en place d&#39;OS-CSCs d&#39;origine humaine à partir de biopsies de l&#39;OS a été rendu possible en utilisant plusieurs méthodes, y compris la capacité de créer des cultures de cellules souches en 3 dimensions sous nonadhereconditions nt. Dans ces conditions, les CSC sont en mesure de créer des colonies flottantes sphériques formées par les cellules souches filles; ces colonies sont appelées «sphères cellulaires». Ici, nous décrivons une méthode pour établir les cultures du SCC à partir de cultures de cellules primaires d&#39;OS classique obtenu à partir de biopsies OS. Nous décrivons clairement les plusieurs passages nécessaires pour isoler et caractériser CSCs.

La présence de cellules souches cancéreuses (CCF) dans sarcomes osseux a récemment été liée à leur pathogénie. Dans cet article, nous présentons l&#39;isolement des cellules souches cancéreuses à partir de cultures de cellules primaires obtenues à partir de biopsies humaines d&#39;ostéosarcome classique (OS) en utilisant la capacité de CSCs à croître dans des conditions non adhérentes.

Création de souches du cancer de cultures de cellules de Human ostéosarcome conventionnel

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

L'objectif général de cet article est d'isoler des cellules souches cancéreuses à partir d'une lignée cellulaire limitée provenant d'ostéosarcomes humains. Le principal avantage de cette étude est de montrer clairement aux chercheurs du domaine de l'oncologie comment isoler, in vitro, les cellules souches cancéreuses. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour étudier des thérapies dirigées contre l'ostéosarcome et d'autres tumeurs solides.En général, les personnes novices dans ce domaine éprouveront des difficultés s’ils ne savent pas comment isoler les colonies de sarcome. Une démonstration visuelle est essentielle, car l’étape d’isolement est complexe à réaliser et à comprendre. Nous avons eu l’idée de cette technique pour la première fois en lisant un article sur le test de formation de sphéroïdes.Décrit par Gypsum et ses collaborateurs. La procédure sera démontrée par le Dr. Gaia Palmini, étudiante au doctorat, et le Dr. Roberto Zonefrati, technicien de mon laboratoire. Pour commencer, préparez tous les milieux de culture nécessaires.Des tampons de digestion et d'autres solutions nécessaires pour la procédure. Ensuite, établir une lignée cellulaire finie d'ostéosarcome en isolant l'ostéosarcome à partir d'une biopsie aiguille ou chirurgicale confirmée, puis en sous-cultivant les cellules obtenues comme décrit dans l'article de texte accompagnant.Une fois la culture cellulaire d'ostéosarcome établie et la plaque proche de la confluence, retirez le milieu par aspiration et trypsinez les cellules pour les détacher de la plaque. Transférez les cellules dans un tube neuf et pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas afin de disperser les éventuels agrégats cellulaires.Ensuite, prélvez dix microlitres de la suspension cellulaire et transférez-les dans une chambre de cytocompteur. Placez la chambre de cytocompteur sous un microscope à contraste de phase et calculez la concentration des cellules dans la suspension. Puis, ajoutez 280 000 cellules à 35 millilitres de milieu de croissance de sarcosphères contenant de la méthocellulose, et mélangez délicatement la solution à l’aide d’une pipette afin de disperser les agrégats éventuels.Transférez cinq millilitres du mélange cellulaire dans chaque puits de plaques à six puits à attachement ultra faible. Une fois ensemencées, utilisez un microscope inversé pour observer l'aspect des cellules et vérifier si elles sont bien isolées. Incubez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Tous les trois jours, ajoutez des alcoolates frais de bFGF et d'EGF dans chaque puits afin de renouveler la concentration des facteurs de croissance. Examinez l'évolution du test des sarcosphères en observant les cellules au microscope aux jours 7, 14, 20, 21 et 28. Lorsque vous observez la présence de grandes sarcosphères noires regroupées au centre du puits, arrêtez la culture et commencez le processus de désagrégation.Quand vient le moment d'isoler le sarcosphère, utilisez une pipette stérile de 1 000 microlitres pour transférer le milieu contenant les sarcosphères vers une seringue munie d'un support de filtre membrane stérile. Après avoir complètement retiré le milieu contenant les sarcosphères, ajoutez cinq millilitres de milieu de croissance dans le puits, puis rincez soigneusement et récupérez toutes les sphères restantes.Ensuite, utiliser un microscope pour confirmer si toutes les sarcosphères ont été récupérées. Dans l'affirmative, rincer à nouveau la cavité jusqu'à ce que la collecte des sphères soit complète. Puis, filtrer la suspension à travers le support de filtre à membrane par gravité afin de ne pas endommager les sphères, et s'assurer qu'aucune sarcosphère ne traverse le filtre.Au cours de ce processus, éliminer toute bulle d'air en utilisant délicatement une pipette Pasteur stérile en verre. Une fois que tous les sarcosphères ont été filtrés, laver l'unité de filtration en ajoutant dix millilitres de milieu de croissance directement dans la seringue et en laissant le liquide s'écouler sans pression afin de s'assurer de l'élimination des cellules isolées. Une fois la suspension de sarcosphères filtrée, il est nécessaire de jeter le filtrat liquide et d'accorder une attention particulière à la récupération des sarcosphères qui sont emmêlés dans le filtre en réseau.À ce stade, démontez l'unité de filtration en la retirant de la seringue et placez-la dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Retirez le filtre en filet du support de filtre membranaire à l'aide d'une pince stérile à épiler.Et transférez le filtre dans une nouvelle boîte de Pétri de 60 millimètres. Ensuite, lavez le filtre par secouage doux. En ajoutant 5 millilitres de milieu de croissance, afin de libérer les sarcosphères de l’emmêlement de la membrane.Ensuite, placez la membrane dans un puits et vérifiez par observation microscopique qu’il n’y a plus de sphères emmêlées dans la membrane. Rincez à nouveau la membrane, puis réexaminez-la au microscope s’il reste des sphères emmêlées. Lorsqu’aucune sphère ne reste plus dans la membrane, incubez-la dans un milieu de croissance afin de permettre la croissance des sarcosphères en une monocouche.Surveiller la croissance des cellules souches cancéreuses d'ostéosarcome, obtenues à partir des sarcosphères, jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence d'environ 90 % dans une boîte de Pétri de 60 millimètres. Outre les nombreux protocoles établis présentés dans cet article, les méthodes d'évaluation de la capacité de différenciation, de l'activité de l'ALDH, de la cytométrie en flux, de l'immunofluorescence et de l'analyse par RT-PCR sont décrites en détail dans le protocole textuel accompagnant.Les échantillons d'ostéosarcome sont obtenus par aspiration à l'aiguille ou par sursection chirurgicale. Et s'ils sont correctement traités, ils mettent environ un mois pour atteindre la confluence dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Après expansion, les cellules sont ensemencées dans des plaques à six puits à adhérence ultra faible, afin d'initier le test de sarcosphère.Cette plaque maintient les cellules en état de suspension et empêche leur attachement au substrat. Après sept jours, plusieurs petites colonies sphériques entourées de cellules isolées sont observées. Après 28 jours, plusieurs grandes sarcosphères sont observées.Une fois les colonies sphériques isolées, les cellules cancéreuses de type souche peuvent être mises en culture à partir des sarcosphères uniques en les plaçant sur des plaques d’attachement normales. Les colorations immunofluorescentes ont révélé un phénotype similaire à celui des cellules souches mésenchymateuses, les cellules étendues étant positives pour CD44 et CD105, et modérément positives pour Stro-1. La RT-PCR a également confirmé positivement le phénotype des cellules souches embryonnaires par l’expression de trois gènes marqueurs des cellules souches embryonnaires.Nanog, Oct3/4 et Sox2. Et le gène CD133, un marqueur des cellules souches cancéreuses de l'ostéosarcome. La technique détaillée d'isolement que nous avons présentée dans cette vidéo ouvrira la voie à d'autres chercheurs pour l'étude des cellules souches cancéreuses, en leur montrant comment comprendre et reproduire les étapes les plus critiques du test de formation de sphéroïdes.Cet essai modifié constitue une bonne technique pour isoler les cellules souches cancéreuses et étudier leur biologie. Ce protocole, avec des adaptations supplémentaires, peut également être utilisé pour isoler des cellules souches cancéreuses à partir d'autres lignées cellulaires cancéreuses finies, obtenues par biopsie de tumeurs solides.En conclusion, l'isolement de cellules souches cancéreuses à partir de plusieurs types de tumeurs permettra l'étude de leur biologie. Dans le but ultime d'identifier des cibles moléculaires et de développer des thérapies anticancéreuses très spécifiques dirigées contre des sous-ensembles cellulaires particuliers.

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Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment...

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

L'isolement des cellules souches cancéreuses (CCM) directement à partir de tissus humains est nécessaire pour leur caractérisation biologique. Ce manuscrit décrit une méthodologie pour l'isolement des CSC de la prostate à partir de tissus humains, tout en offrant des conseils sur le dépannage des mesures difficiles.

Isolement de cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons cancer de la prostate humaine

cellules souches du cancer (CCM) sont impliqués dans la rechute de la tumeur en raison de la chimiorésistance. Nous avons optimisé un protocole pour la sélection et l'expansion de la CCF de lignées cellulaires de cancer de l'ovaire. En traitant les cellules avec le cisplatine chimiothérapeutique et la mise en culture d'une cellule souche promotion de médias nous enrichir en cultures SCC non adhérentes.

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

Les dosages de sphères in vitro sont couramment utilisés pour identifier les cellules souches cancéreuses. Ici, nous comparons les dosages à sphère unique et à plusieurs cellules. Les tests basés sur des cellules uniques plus laborieux ou la supplémentation en méthylcellulose donnent des résultats plus précis, tandis que les tests multicellulaires effectués en milieu liquide peuvent être fortement influencés par la densité cellulaire.

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Le protocole suivant est axé sur la mise en place d’une culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de patient (STS). Ce modèle pourrait nous aider à mieux comprendre la base moléculaire et le profil pharmacologique de ces tumeurs malignes rares et pourrait constituer un point de départ pour poursuivre les recherches visant à améliorer la gestion de STS.

Mise en place d’une Culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de Patient

Nous décrivons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules tumeur-initiatrices des xénogreffes patient-dérivées humaines par le tri de cellules fluorescence-activé, utilisant l'antigène humain de leucocyte-1 (HLA-1) comme marqueur négatif, et pour la validation plus loin et caractérisation de ces cellules HLA-1-négatives de tumeur-initiateur.

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

Phénotypes de cellules dormantes et active du cancer ont été caractérisées à l’aide de l’imagerie quantitative phase. Essais sur la prolifération, la migration et la morphologie des cellules ont été intégrées et analysées dans une méthode simple.

Une Time-lapse, sans étiquette et Quantitative Phase imagerie de cellules cancéreuses humaines dormantes et Active

Ici, nous présentons un protocole pour la génération de pluripotentes induites des cellules souches (CISP) de Syndrome de Li-Fraumeni (LFS) patient dérivée fibroblastes, différenciation de CISP par l’intermédiaire de cellules souches mésenchymateuses (CSM) d’ostéoblastes et modélisation in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes patient dérivé de LFS.

Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation

L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Le présent protocole décrit la méthode d’établissement d’un modèle murin de xénogreffe dérivée d’un patient (PDX) à partir de tissu d’ostéosarcome humain.

Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe dérivé d’un patient avec des tissus d’ostéosarcome humain

Découvrez l'isolation de cellules souches cancéreuses à partir de biopsies d'ostéosarcome humain. Cette méthode démontre l'essai de formation de sarcosphères pour la recherche en oncologie et le développement de thérapies ciblées.

Création de souches du cancer de cultures de cellules de Human ostéosarcome conventionnel

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