Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique ^haute Cellules souches adipeuses (CSA)

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des cellules souches mésenchymateuses Sca1 positives à partir de divers coussinets adipeux de souris. Le principal avantage de cette technique est qu’en utilisant le tri cellulaire basé sur le tri cellulaire basé sur les billes immunomagnétiques, les cellules souches dérivées du tissu adipeux provenant de différents dépôts de graisse peuvent être efficacement enrichies pour des expériences ultérieures. En général, les chercheurs qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la force et la durée de la digestion tissulaire médiée par la collagénase doivent être optimisées pour obtenir un nombre adéquat de cellules pour le tri.

Pour isoler les coussinets adipeux sous-cutanés, commencez par placer la souris sur une planche de dissection en mousse en position couchée et vaporisez l’animal avec de l’éthanol à 70 %. Après avoir fixé les pattes à la planche, faites une petite incision dans la peau du bas-ventre. Ensuite, en saisissant le haut de la coupe avec une pince, utilisez des ciseaux pour séparer la peau et le péritoine de l’abdomen au thorax.

En faisant des coupures latérales dans la peau, le long du côté du corps, réfléchissez la peau loin du péritoine vers la tête. Ensuite, tirez sur la peau restante, en tenant la graisse inguinale loin du corps, et utilisez des aiguilles de calibre 22 pour épingler la peau à la planche. Ensuite, utilisez la pince pour saisir un coussinet adipeux inguinal à son origine près du péritoine, et utilisez des ciseaux fins pour couper entre la peau et la graisse inguinale, en progressant vers l’aine et en évitant de contaminer le coussinet adipeux sous-cutané avec de la peau.

Ensuite, placez le coussinet adipeux inguinal isolé dans une boîte de 60 millimètres étiquetée SQ contenant un milieu de culture à 37 degrés Celsius, et récoltez le coussinet adipeux inguinal de l’autre côté de l’animal de la même manière. Pour isoler les coussinets adipeux viscéraux, coupez le péritoine pour exposer les coussinets adipeux viscéraux et l’intestin. Ensuite, déplacez l’intestin de côté, vers le thorax.

En saisissant le coussinet adipeux viscéral à l’extrémité distale, tirez doucement sur le tissu adipeux et disséquez-le en prenant soin d’exclure le tissu épididymaire. Placez ensuite le tampon adipeux dans une boîte de 60 millimètres étiquetée VIS contenant un milieu de culture à 37 degrés Celsius. Lorsque tous les coussinets adipeux ont été collectés, transférez les plats dans une hotte de culture tissulaire et aspirez le milieu.

Utilisez des ciseaux incurvés pour émincer les coussinets. Ensuite, ajoutez les morceaux de graisse dans des tubes individuels de 50 millilitres contenant de la collagénase fraîchement préparée. Ensuite, secouez les tubes à 300 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes, jusqu’à ce que les tissus soient digérés.

Certains morceaux de tissu adipeux sous-cutané peuvent encore être visibles. Ajoutez 20 millilitres de milieu de culture à la solution de collagénase pour arrêter la digestion, et utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour aspirer et distribuer la boue tissulaire 10 fois afin de dissocier complètement les tissus digérés. Filtrez les cellules à travers des filtres cellulaires de 100 microns et centrifugez les tissus.

Ensuite, décantez soigneusement le milieu en prenant soin de ne pas déranger les granules, et remettez doucement en suspension les deux groupes de cellules dans cinq millilitres d’eau stérile. Attendez deux minutes que les érythrocytes soient lysés. Arrêtez ensuite la réaction dans chaque tube avec 25 millilitres de milieu complété par FBS.

Filtrez les deux populations adipocytaires à travers de nouvelles passoires cellulaires de 100 microns, faites-les tourner à nouveau, puis remettez les granulés en suspension dans un à trois millilitres de milieu. Après avoir compté par exclusion du bleu de trypan, déposer séparément une fois dix à la sixième cellules de coussinet adipeux sous-cutané et les cellules viscérales dans des puits individuels d’une plaque de culture cellulaire à six puits. Après avoir trypsinisé les cellules, diluez la trypsine avec un millilitre de tampon de séparation, puis centrifugez les plaques de culture.

Nous suspendons les cellules dans 500 microlitres par tube de tampon de séparation, et centrifugerons à nouveau les cellules. Maintenant, remettez les cellules en suspension dans 90 microlitres par tube de tampon de séparation et mélangez 10 microlitres d’anticorps primaire anti-Sca1 FITC dans la suspension cellulaire. Après 10 minutes d’incubation à quatre degrés Celsius dans l’obscurité, lavez les cellules avec un millilitre de tampon de séparation par tube.

Après la filature, les cellules sont remises en suspension dans 80 microlitres de tampon de séparation par suspension cellulaire. Mélangez ensuite 20 microlitres de microbilles Anti-FITC dans chaque puits et placez les plaques à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans un millilitre de tampon de séparation, et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon frais par tube.

Maintenant, placez une colonne dans le support magnétique et rincez la colonne avec 500 microlitres de tampon séparation. Transférez les cellules de la culture de tissu du coussinet adipeux sous-cutané sur la colonne, en prenant soin d’éviter les bulles, et collectez les cellules négatives Sca1 non marquées dans un tube conique de 15 millilitres. Lorsque toutes les cellules ont été traversées, lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de séparation.

Transférez ensuite la colonne de l’aimant dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et plongez un millilitre de tampon de séparation frais à travers la colonne pour éluer les cellules positives Sca1. Enfin, faites tourner les fractions cellulaires positives et négatives de Sca1 et remettez les granulés en suspension dans un millilitre de milieu de culture. Ensuite, comptez le nombre de cellules dans chaque fraction, et plaquez les fractions dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de culture cellulaire à six puits.

Les cellules stromales vasculaires isolées de la graisse sous-cutanée présentent une forme cellulaire étirée semblable à celle d’un fibroblaste, quel que soit leur niveau d’expression de Sca1. À l’instar des cellules hautes Sca1 dérivées de la graisse inguinale sous-cutanée, les cellules hautes Sca1 dérivées de la graisse épididymaire viscérale présentent une forme cellulaire étirée semblable à celle d’un fibroblaste. Alors que les cellules basses de VIS Sca1 présentent une forme épithélioïde.

Les cellules élevées Sca1 isolées de souris Sca1-GFP isolées sont facilement identifiées comme des cellules positives à la GFP en culture tissulaire. En effet, lorsque ces cellules sont évaluées par cytométrie en flux, il est confirmé que la plupart des cellules positives à la GFP expriment les protéines Sca1 à leur surface cellulaire, comme détecté par l’anticorps anti-Sca1. Couplé à des analyses PCR en temps réel, l’expression différentielle des métalloprotéinases de la matrice collagénolytique entre les cellules souches dérivées de la graisse Sca1 dérivée de la graisse inguinale et épididymaire élevée dérivée du tissu adipeux peut être démontrée.

De plus, lorsque des gels de collagène de type I marqués à la fluorescéine sont utilisés pour évaluer l’activité de dégradation péricellulaire, une activité de remodelage du collagène nettement accrue médiée par des cellules souches viscérales dérivées du tissu adipeux Sca1 élevé est observée. Une fois maîtrisée, l’isolation des cellules du coussinet adipeux peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir un champ opératoire propre et organisé pour assurer une isolation efficace des coussinets adipeux.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme un test de dégradation du collagène, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur le remodelage tissulaire médié par les cellules souches dérivées du tissu adipeux. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’obésité et de la biologie matricielle pour explorer le rôle des cellules souches dérivées du tissu adipeux dans le remodelage et la fonction du tissu adipeux chez la souris et l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de vous procurer et d’enrichir des cellules primaires positives Sca1 à partir de dépôts de tissu adipeux.