Name: Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique haute Cellules souches adipeuses (CSA) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez la séparation immunomagnétique pour isoler les cellules souches adipeuses Sca1+ de différents dépôts de graisse chez la souris. Cette méthode optimise la digestion par collagénase et permet d'enrichir les ASC pour la recherche en médecine régénérative.

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Ce travail est soutenu par le NIH DK095137 (THC). Nous remercions les membres du laboratoire actuels et anciens qui ont contribué au développement et à la sophistication des méthodes décrites.

Déclaration éthique: L&#39;Université du Michigan Comité sur l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux (UCUCA) a approuvé toutes les méthodes et protocoles en conformité avec le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (Institute for Laboratory Animal Research, Conseil national de recherches). Les souris sont maintenues dans une Université du Michigan vivarium et bénéficient d&#39;un accès libre à la nourriture et de l&#39;eau et maintenus sur un cycle de 12 heures foncé / lumière. 1. Préparatifs <ol><li> Préparer les milieux de culture primaire avec DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G, et 1x antibiotiques / antifongiques. Il sera utilisé pour garder les tissus à la digestion avant. Placez stock et aliquote dans 37 ºC bain d&#39;eau. </li><li> Préparer cinq millilitres de solution de collagénase de type III à 5 mg / ml dissous dans du HBSS (+ Ca + Mg) pour chaque type de coussinet adipeux étant isolés jusqu&#39;à cinq souris. Par exemple, lors de l&#39;isolation SQ et le VIS à partir d&#39;un seul génotype, faire 10 ml, si de type sauvage et mutant SQ et le VIS, faire 20 ml. Ajuster le pH à 7,4 et sterile filtre. Aliquoter en tubes de 50 ml. Mettez de côté de la lumière. </li><li> En utilisant 70% d&#39;éthanol pour la désinfection champ opératoire. Essuyez et couvrir avec un tampon bleu. Vaporisez un peu d&#39;éthanol sur le pavé bleu. </li><li> Utilisez les 22 G aiguilles à cerner un tampon absorbant à la planche de styromousse et de couper avec des ciseaux. Vaporiser le tampon avec de l&#39;éthanol puis définissez le conseil sur le pavé bleu et couvrir avec un autre tampon bleu jusqu&#39;au début de la dissection. </li><li> Remplir deux tubes de 50 ml avec de l&#39;éthanol et le placer dans une position adjacente au champ opératoire. Placez les ciseaux et des pinces dans l&#39;éthanol. </li><li> Remplir un autre tube de 50 ml avec du PBS 1x, plus anti-anti rinçage à l&#39;éthanol hors des outils chirurgicaux. </li><li> Dans la hotte, l&#39;étiquette des boîtes de 60 mm pour chaque type de tissu et de remplir avec des milieux de culture chauffée à 37 ºC. Placez les plaques adjacentes à la zone chirurgicale. </li></ol> 2. Isolement des sous-cutanée (SQ) Fat Pads <ol><li> Euthanasier souris avec une surdose d&#39;isoflurane et de pneumothorax. </li><li> Doucementvaporisez souris avec 70% d&#39;éthanol et de jeter supination. Epingler les pattes à la planche en mousse avec 22 G aiguilles. </li><li> Faire une petite incision dans la peau de l&#39;abdomen inférieur. En tenant le haut de la coupe avec la pince, prendre les ciseaux et séparer la peau du péritoine. </li><li> Une fois que la peau est séparée du péritoine de l&#39;abdomen au niveau du thorax, reflètent la peau loin du péritoine vers la tête en effectuant des coupes latérales dans la peau le long du côté du corps. </li><li> Refléter la peau restante tenant la graisse inguinale loin du corps et de cerner à la carte avec 22 G aiguilles. </li><li> Passer à des ciseaux fins et des pinces. Prenez le coussinet adipeux inguinal avec la pince à l&#39;origine près du péritoine et snip loin entre la peau et la graisse inguinale progressant vers l&#39;aine en évitant de contaminer la SQ avec la peau. </li><li> Placez le coussin de graisse inguinale insolated dans le mm plat marqué 60. </li></ol> 3. Isolement de Visceral (VIS) Pads Fat <ol><li> De façon similaire à l&#39;étape 2.5, couper le péritoine ouvert pour exposer la viscérale coussinets adipeux et de l&#39;intestin. </li><li> Déplacer l&#39;intestin loin vers le thorax. </li><li> Prenez le coussinet adipeux VIS à l&#39;extrémité distale et tirez doucement vers le haut. Disséquer le coussinet adipeux VIS tout en veillant à exclure l&#39;épididyme (ou de l&#39;utérus, en cas d&#39;utilisation des souris femelles) tissus. </li><li> Placer dans un plat marqué et répétez l&#39;étape 3.3 pour le pad restant VIS. </li></ol> 4. collagénase Digestion de Fat Pads <ol><li> Déplacer 60 mm plats à la culture de tissus capot et aspirer hors médias. </li><li> Émincer les coussinets adipeux avec des ciseaux courbes, puis ajouter à la solution de collagénase. Assurez-vous de rincer les ciseaux et des pinces entre les types de tissus avec de l&#39;éthanol et du PBS. </li><li> Agiter à 300 tours par minute et 37 ° C pendant 10-20 min jusqu&#39;à ce que les tissus sont digérés. Il est acceptable si certains morceaux de SQ sont encore visibles. Cette question sera abordée dans une étape ultérieure. </li><li> Ajouter 25 ml de milieu de culture à la solution de collagénase pour arrêter le collagtraitement enase, et la pipette de haut en bas 10 fois avec 10 ml pipette sérologique pour disperser les tissus digérés. </li><li> cellules souches en utilisant un tamis cellulaire 100 um. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g. </li><li> Décanter avec soin hors médias de ne pas perturber le culot et ajouter 5 ml d&#39;eau stérile au culot et doucement la pipette de suspendre les cellules. Attendre 2 min pour lyser les érythrocytes. </li><li> Ajouter 25 ml de milieu avec des cellules de FBS et de déformation de 10% grâce à une nouvelle cellule crépine 100 um. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 300 x g. Décanter les médias et remettre le culot dans 1 ml de milieu de culture. </li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre en utilisant 1: 1 bleu trypan. </li><li> Plate 1 x 10 6 cellules dans un puits sur une plaque à 6 puits. </li></ol> 5. magnétique de séparation cellulaire <ol><li> Au bout d&#39;environ 4 à 6, h d&#39;adhérence cellulaire, rincer deux fois les cellules avec du HBSS (-Ca, Mg). Dissocier les cellules adhérentes en utilisant 0,05% de trypsine. Diluer la trypsine suspension cellulaire dans 1 ml de tampon de séparation et de spin pour5 min à 300 x g. </li><li> surnageant Aspirer. Resuspendre les cellules dans 500 pi de tampon. Retirer une partie aliquote de 10 pl et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> les cellules d&#39;essorage pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Aspirer le surnageant complètement. Resuspendre les cellules dans 90 ul de tampon. Ajouter 10 anticorps primaire anti-Sca1-FITC ul. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de tampon et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g. Retirer le surnageant complètement. </li><li> Resuspendre les cellules dans 80 ul de tampon. Ajouter 20 microbilles anti-FITC ul. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de tampon et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot dans 500 ul de tampon. </li><li> Placer la colonne dans le support magnétique et rincer la colonne avec 500 pi de tampon. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire à la colonne. Éviter les bulles tout pipetage. </li><li> Recueillir le Sca1 non marqué - &lt;/ Sup&gt; cellules et laver la colonne 3 fois avec un tampon de 500 pi. Seulement ajouter un nouveau tampon lorsque le réservoir est vide. Éviter les bulles tout pipetage. </li><li> Retirer la colonne du support magnétique et le placer dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon à la colonne et éluer Sca1 + en poussant le piston fourni par le réservoir de la colonne. </li><li> Isoler les fractions de cellules pendant 5 min à 300 x g. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture. </li><li> Retirer une partie aliquote de 10 ul des fractions marquées et non marquées et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Plaquer chaque fraction cellulaire dans une cupule d&#39;une plaque à 6 puits. </li></ol> 6. Vérification de la séparation immunomagnétique de Sca1 haute ACS avec cytométrie de flux <ol><li> Rincer les cellules deux fois avec HBSS (-Ca, -Mg) et dissocier les cellules en utilisant 0,05% de trypsine. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture et comptent au moyen d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Obtenir&gt; 10 6 </sup&gt; cellules dans 1 ml de milieu de culture et centrifuger à 300 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et répétez l&#39;étape 6.3 plus de deux fois. </li><li> Resuspendre les cellules avec 1 ml de sérum de chèvre à 2% + 2% de BSA et de bloquer pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. </li><li> Retirer la solution de blocage. </li><li> Ajouter le rat IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 pg, 1: 400) ou anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 pg, 1: 400), dans 100 ul de PBS avec 2% de sérum de chèvre et 2% de BSA + PBS à 4 ° C pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 1 ml de PBS froid aux cellules. Centrifugeuse 300 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et répétez l&#39;étape 6.9 plus de deux fois. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de PBS. Passer des suspensions de cellules à travers un tamis cellulaire de 100 um pour préparer une analyse cytométrique de flux. </li></ol>

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<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ici , nous démontrons l&#39;isolement et la séparation cellulaire immunomagnétique de ASCs souris provenant de différents tampons de graisse et leur utilisation pour des expériences in vitro. La méthode présentée est efficace pour l&#39;isolement rapide d&#39; un grand nombre de ASCs de SCA1 positif, ce qui est avantageux par rapport à l&#39;isolement techniquement complexe et coûteux FACS médiée par des ASCs 9,14. A la différence FACS, la séparation cellulaire immunomagnétique ne permet pas l&#39;ut...

La tige antigène de cellule 1 (SCA1 ou Ly6A / E) a d&#39; abord été identifié comme un marqueur de surface cellulaire exprimée par hématopoïétiques et les cellules souches mésenchymateuses 5,6. La fraction stroma vasculaire (FSV) du tissu adipeux obtenu à partir de dépôts de graisse de la souris est une population hétérogène de cellules comprenant des macrophages, des fibroblastes, des cellules endothéliales vasculaires, les cellules neuronales et les cellules progénitrices adipocytaires 7. Les cellules progénitrices d&#39;adipocytes ou cellules souches dérivées de tissu adipeux (ASC) sont des cellules non-lipidiques chargées qui résident dans la matrice extracellulaire périvasculaire riche en collagène (ECM) 8. Environ 50% de la SVF se composent de ASCs, qui sont caractérisés comme lignée négative (Lin -) et CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. La plupart de ces cellules sont Sca1 +: CD24 - progéniteurs adipocytaires, qui sont capables de différenciation des adipocytes in vitro; cependant, seule une fraction des cellules (0,08% de SVF) constitue Sca1 <sup&gt; +: CD24 + cellules qui sont parfaitement capables de proliférer et de se différencier en adipocytes dans les conditions in vivo 9. Malgré la mise en garde potentiel d&#39;utilisation Sca1 + SVF sans discrimination des cellules CD24 + de CD24 - cellules, isolement Sca1 + ASCs de dépôts de graisse à l&#39; aide de la séparation cellulaire immunomagnétique est une approche efficace et pratique pour déterminer le phénotype cellulaire autonome des cellules progénitrices d&#39;adipocytes primaires. Dans le domaine de l&#39; obésité et le diabète, la fibrose des tissus et de l&#39; inflammation joue un rôle essentiel dans le développement et l&#39; entretien du diabète de type 2 3. Récemment, Tokunaga et al. ont montré que SCA1 élevé des cellules isolées de inguinale (ou sous - cutanée, SQ) et perigonadal (ou viscérale, VIS) C57BL6 / J dépôts de graisse présentent différentes signatures génétiques et ECM remodelage in vitro 10. MMP14 (MT1-MMP), un élément prototypique de la membrane tmatrice ype métalloprotéinase (MMP) famille médiatise le développement du tissu adipeux blanc (WAT) à travers son activité collagénolytique 1. Des exemples d&#39;expériences qui peuvent être effectués avec les cellules isolées et enrichies par le protocole suivant comprennent la culture en trois dimensions, des études de différenciation, des essais de dégradation du collagène, et le séquençage de l&#39; ARN 10,11. Des essais de dégradation doivent être menées avec le collagène acide extrait pour assurer la préservation de télopeptide 11,12. Le protocole suivant démontrera les méthodes pour isoler les cellules stromales vasculaires primaires de différents dépôts de graisse et d&#39;enrichir les cellules progénitrices d&#39;adipocytes en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique. La validité du tri cellulaire sera évaluée avec cytométrie en flux et par l&#39; utilisation de Sca1-GFP souris qui expriment la GFP dans Sca1 + cellules, entraînée par un promoteur Sca1 13.

<table><tbody><tr><td>Type 3 Collagénase</td><td>Worthington LS004182 biochimique</td><td></td><td>Digestion tissulaire</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Milieu de culture à haute teneur en glucose</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Antibiotique de milieu</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Antifongique</td></tr><tr><td>de milieu FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,05 %)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu ; Crépine à cellules m</td></tr><tr><td>Plaques de 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Grands</td></tr><tr><td>ciseaux</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Pointe fine et incurvée</td></tr><tr><td>Grande pince</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8" aiguilles</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 22G 1,5"</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>tubes coniques de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubes coniques de 50 ml Colonnes</td> de séparation <td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microbilles anti-Sca1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm ; Microbilles Ab et anti-FITC 2&ordm ; </td></tr><tr><td>Tampon de roulement Ab AutoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tampons chux bleus</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Tampons absorbants</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Panneau de polystyrène</td><td></td><td></td><td>Utilisation à partir de tubes de 50</td></tr><tr><td>ml 70 % d’éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-souris Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a anti-souris F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Tube à fond rond</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash ; Ca, &ndash ; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Pour solution de collagénase</td></tr><tr><td>Collagène de type I (2,7 mg/ml dans 37mm d’acide acétique</td><td>Préparer en interne12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>Préparer sur place</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de protection Corning</td><td></td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 acide carboxylique, ester succinimidylique, mélange d’isomères</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0,89 M NaHCO3&nbsp ; </td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

séparation immunomagnétique de sca1 fat depot spécifique<sup&gt; haute</sup&gt; cellules souches adipeuses (csa)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

L’isolement des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) est une méthode importante dans le domaine de la biologie du tissu adipeux, de l’adipogenèse et du remodelage de la matrice extracellulaire (MEC). In vivo, l’environnement riche en MEC composé de collagènes fibrillaires fournit un soutien structurel aux tissus adipeux pendant la progression et la régression de l’obésité. Le remodelage physiologique de la MEC médié par les métalloprotéinases matricielles (MMP) joue un rôle majeur dans la régulation de la taille et de la fonction du tissu adipeux1,2. La perte de remodelage physiologique de la MEC collagénolytique peut entraîner une accumulation excessive de collagène (fibrose tissulaire), une infiltration de macrophages et, finalement, une perte d’homéostasie métabolique, y compris la résistance à l’insuline3,4. Lorsqu’un changement phénotypique du tissu adipeux est observé dans des modèles murins ciblés par un gène, l’isolement des ASC primaires des dépôts de graisse pour les études in vitro est une approche efficace pour définir le rôle du gène spécifique dans la régulation de la fonction des ASC. Dans ce qui suit, nous définissons une séparation immunomagnétique des ASCélevés de Sca1.

Enrichissement de ASCs élevés SCA1 de différents Pads Fat. Les cellules stromales vasculaires isolées à partir de l&#39; affichage de la graisse SQ fibroblaste, étirées la forme des cellules , indépendamment du niveau d&#39;expression Sca1 (figure 1A). D&#39;autre part, le VIS (EWAT-dérivée) des cellules à faible SCA1 élevé et SCA1 démontrent nette différence dans la forme de l...

Nous présentons les techniques nécessaires pour isoler la fraction vasculaire stromale (SVF) des dépôts de tissu adipeux inguinal (sous-cutané) et périgonadique (viscéral) de souris afin d’évaluer leur expression génique et leur activité collagénolytique. Cette méthode comprend l’enrichissement de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC)Sca1 à haute teneur en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique.

Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique<sup&gt; haute</sup&gt; Cellules souches adipeuses (CSA)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches mésenchymateuses positives pour Sca1 à partir de différents bourrelets adipeux de souris. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, grâce au tri cellulaire basé sur des billes immunomagnétiques, les cellules souches dérivées du tissu adipeux provenant de différents dépôts graisseux peuvent être efficacement enrichies pour des expérimentations ultérieures. En général, les chercheurs novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la force et la durée de la digestion tissulaire par collage­nase doivent être optimisées afin d'obtenir un nombre adéquat de cellules destinées au tri.Pour isoler les bourrelets adipeux sous-cutanés, commencez par placer la souris sur une planche à dissection en mousse en position dorsale et vaporisez l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Après avoir fixé les pattes sur la planche, faites une petite incision dans la peau du bas-ventre. Ensuite, en pinçant le bord supérieur de l'incision avec une pince, utilisez des ciseaux pour séparer la peau et le péritoine, en allant de l'abdomen vers le thorax.Effectuez des incisions latérales dans la peau, le long du flanc du corps, puis rabattez la peau vers la tête, en la détachant du péritoine. Ensuite, tirez en arrière la peau restante en maintenant la graisse inguinale éloignée du corps, et fixez la peau sur la planche à l’aide d’aiguilles de calibre 22. Puis, saisissez à l’aide de la pince une des poches de graisse inguinale à son origine, près du péritoine, et utilisez des ciseaux fins pour sectionner le tissu entre la peau et la graisse inguinale, en progressant vers l’aine, tout en évitant de contaminer la couche de tissu adipeux sous-cutané avec la peau.Ensuite, placer le bourrelet adipeux inguinal isolé dans une boîte de Pétri de 60 millimètres étiquetée SQ contenant du milieu de culture à 37 degrés Celsius, et prélever le bourrelet adipeux inguinal de l'autre côté de l'animal de la même manière. Pour isoler les bourrelets adipeux viscéraux, inciser le péritoine afin d'exposer les bourrelets adipeux viscéraux et l'intestin. Puis déplacer l'intestin sur le côté, vers le thorax.En saisissant le bourrelet de graisse viscérale à son extrémité distale, tirez délicatement sur le tissu adipeux et disséquez-le, en prenant soin d'exclure le tissu épididymaire. Placez ensuite le bourrelet graisseux dans une boîte de 60 millimètres étiquetée VIS contenant un milieu de culture à 37 degrés Celsius. Une fois tous les bourrelets graisseux collectés, transférez les boîtes dans une hotte de culture tissulaire et aspirez le milieu.Utilisez des ciseaux courbes pour hacher finement les bourrelets. Ensuite, ajoutez les morceaux de tissu adipeux dans des tubes individuels de 50 millilitres contenant du collagénase fraîchement préparé. Puis, agitez les tubes à 300 tr/min et à 37 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes, jusqu'à ce que les tissus soient digérés.Des fragments de tissu adipeux sous-cutané peuvent encore être visibles. Ajouter 20 millilitres de milieu de culture à la solution de collagénase pour arrêter la digestion, puis utiliser une pipette serologique de 10 millilitres pour aspirer et redistribuer la suspension tissulaire 10 fois afin de dissocier complètement les tissus digérés. Filtrer les cellules à l’aide de tamis cellulaires de 100 microns, puis centrifuger les tissus.Ensuite, versez soigneusement le milieu, en prenant soin de ne pas perturber les culots, et remettez délicatement les deux groupes de cellules en suspension dans cinq millilitres d'eau stérile. Attendez deux minutes pour que les érythrocytes soient lysés. Puis arrêtez la réaction dans chaque tube par l'ajout de 25 millilitres de milieu supplémenté en FBS.Filtrez les deux populations d'adipocytes à l'aide de nouveaux filtres cellulaires de 100 microns, centrifugez-les à nouveau, puis remettez en suspension les culots dans un à trois millilitres de milieu. Après numération par exclusion au bleu de trypan, ensemencez séparément un million de cellules provenant du tissu adipeux sous-cutané et un million de cellules viscérales dans des puits individuels d'une plaque de culture cellulaire à six puits. Après trypsination des cellules, diluez la trypsine avec un millilitre de tampon de séparation, puis centrifugez les plaques de culture.Nous suspendons les cellules dans 500 microlitres par tube de tampon de séparation, puis centrifugeons à nouveau les cellules. Ensuite, nous resuspendons les cellules dans 90 microlitres par tube de tampon de séparation, et ajoutons 10 microlitres d'anticorps primaire anti-Sca1 marqué par la FITC à la suspension cellulaire. Après 10 minutes d'incubation à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière, lavons les cellules avec un millilitre de tampon de séparation par tube.Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans 80 microlitres de tampon de séparation par suspension cellulaire. Ensuite, mélanger 20 microlitres de microbilles anti-FITC dans chaque puits, puis placer les plaques à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans un millilitre de tampon de séparation et remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon frais par tube.Maintenant, placez une colonne dans le support magnétique et rincez-la avec 500 microlitres de tampon de séparation. Transférez les cellules du tissu adipeux sous-cutané du culot de culture sur la colonne, en prenant soin d'éviter les bulles, et récupérez les cellules négatives pour Sca1 non marquées dans un tube conique de 15 millilitres. Une fois que toutes les cellules ont traversé, lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de séparation.Ensuite, transférez la colonne depuis l'aimant vers un nouveau tube conique de 15 millilitres, puis faites passer un millilitre de tampon de séparation frais à travers la colonne afin d'éluer les cellules positives pour Sca1. Enfin, centrifugez les deux fractions cellulaires positives et négatives pour Sca1, puis resuspendez les culots dans un millilitre de milieu de culture. Comptez ensuite le nombre de cellules dans chaque fraction et mettez en culture les fractions dans des puits individuels d'une nouvelle plaque de culture cellulaire à six puits.Les cellules stromales vasculaires isolées à partir de tissu adipeux sous-cutané présentent une forme allongée de type fibroblaste, indépendamment de leur niveau d'expression de Sca1. Comme les cellules riches en Sca1 provenant du tissu adipeux inguinal sous-cutané, les cellules riches en Sca1 provenant du tissu adipeux viscéral épididymaire présentent une forme allongée de type fibroblaste. Alors que les cellules VIS faibles en Sca1 exhibent une forme épithélioïde.Les cellules à haut niveau de Sca1 isolées de souris Sca1-GFP sont facilement identifiées comme des cellules GFP positives en culture tissulaire. En effet, lorsqu'elles sont analysées par cytométrie en flux, la majorité des cellules GFP positives expriment confirmées l'expression de la protéine Sca1 à leur surface cellulaire, comme détecté par un anticorps anti-Sca1. Associé à des analyses par PCR en temps réel, l'expression différentielle des métalloprotéinases matricielles collagénolytiques entre les cellules souches adipeuses à haut niveau de Sca1 provenant de tissu adipeux inguinal et épididymaire peut être démontrée.En outre, lorsqu'on utilise des gels de collagène de type I marqués à la fluorescéine pour évaluer l'activité de dégradation péricellulaire, on observe une activité de remodelage du collagène nettement accrue, médiée par les cellules souches adipeuses viscérales Sca1 à expression élevée. Une fois maîtrisée, l'isolement des cellules du bourrelet adipeux peut être réalisé en deux heures si la procédure est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette technique, il est important de maintenir un champ chirurgical propre et bien organisé afin d'assurer un isolement efficace du bourrelet adipeux.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme un test de dégradation du collagène, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le remodelage tissulaire médié par les cellules souches dérivées du tissu adipeux. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'obésité et de la biologie de la matrice extracellulaire pour explorer le rôle des cellules souches dérivées du tissu adipeux dans le remodelage et la fonction du tissu adipeux chez la souris et l'humain. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir et d'enrichir des cellules primaires positives pour Sca1 à partir de dépôts de tissu adipeux.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules souches dérivées du tissu adipeux de l’arc périaortique murin marquées par fluorescence à partir de tissus adipeux murins de l’arc périaortique. Après l’isolement, les NCADCs sont détectés, triés à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence, puis cultivés sur une plaque, favorisant ainsi la prolifération cellulaire.

Isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux périortique murin

En 2001, des chercheurs de l'UCLA ont décrit l'isolement d'une population de cellules souches adultes, les cellules appelé ou CSA souches du tissu adipeux, du tissu adipeux. Cet article décrit l'isolement des CSA de lipoaspirates utilisant un protocole de digestion enzymatique manuel à l'aide de la collagénase.

Isolation Manuel des cellules souches du tissu adipeux de Lipoaspirates humaines

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques.  Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Ce protocole fournit une méthode sans enzyme s'est dissipée des cellules souches mésenchymales à partir d'échantillons d'abdominoplastie et de lipoaspirate à l'aide d'une méthode d'explantation. L'absence d'enzymes dures ou d'étapes de centrifugation prévoit des cellules souches cliniquement pertinentes qui peuvent être utilisées pour des études in vitro ou transférées à la clinique.

Une méthode sans enzyme s'est d'isolement et d'expansion des cellules souches mésenchymales dérivées de l'adipose humaine

Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

Nous présentons une méthode simple pour isoler les cellules progénitrices adipeuses hautement viables des tampons graisseux épididymaux de souris utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Le présent protocole décrit une méthodologie améliorée pour l’isolement ADSC résultant en un rendement cellulaire énorme avec gain de temps par rapport à la littérature. Cette étude fournit également une méthode simple pour obtenir un nombre relativement important de cellules viables après cryoconservation à long terme.

Technique d’obtention de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux et caractérisation de la fraction vasculaire stromale dans la cryoconservation à long terme

Les produits xénogéniques (chimiques ou d’origine animale) introduits dans les étapes de préparation/manipulation de la thérapie cellulaire sont associés à un risque accru de réactivité immunitaire et de transmission pathogène chez les patients hôtes. Ici, une méthode complète sans xénogénétique pour l’isolement et l’expansion in vitro de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux est décrite.

Isolement et culture de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux à l’aide d’une méthode innovante sans xénogène pour la thérapie humaine

Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.

Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley

Ce protocole décrit toutes les procédures, de la culture de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ADSC) et de la collecte du surnageant à l’extraction de vésicules extracellulaires (VE) par ultracentrifugation.

Purification et caractérisation de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain

Ici, nous présentons une méthode standard pour isoler efficacement les cellules souches et les adipocytes dérivés de l’adipos, caractérisée par une réduction de &gt; 90 % du temps de traitement, une forte viabilité cellulaire et une large compatibilité.

Isolation efficace des cellules souches et adipocytes dérivés de l’adipeux à partir du tissu adipeux porcine

Découvrez la séparation immunomagnétique pour isoler les cellules souches adipeuses Sca1+ de différents dépôts de graisse chez la souris. Cette méthode optimise la digestion par collagénase et permet d'enrichir les ASC pour la recherche en médecine régénérative.

Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique

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