Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches mésenchymateuses positives pour Sca1 à partir de différents bourrelets adipeux de souris. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, grâce au tri cellulaire basé sur des billes immunomagnétiques, les cellules souches dérivées du tissu adipeux provenant de différents dépôts graisseux peuvent être efficacement enrichies pour des expérimentations ultérieures. En général, les chercheurs novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la force et la durée de la digestion tissulaire par collage­nase doivent être optimisées afin d'obtenir un nombre adéquat de cellules destinées au tri.

Pour isoler les bourrelets adipeux sous-cutanés, commencez par placer la souris sur une planche à dissection en mousse en position dorsale et vaporisez l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Après avoir fixé les pattes sur la planche, faites une petite incision dans la peau du bas-ventre. Ensuite, en pinçant le bord supérieur de l'incision avec une pince, utilisez des ciseaux pour séparer la peau et le péritoine, en allant de l'abdomen vers le thorax.

Effectuez des incisions latérales dans la peau, le long du flanc du corps, puis rabattez la peau vers la tête, en la détachant du péritoine. Ensuite, tirez en arrière la peau restante en maintenant la graisse inguinale éloignée du corps, et fixez la peau sur la planche à l’aide d’aiguilles de calibre 22. Puis, saisissez à l’aide de la pince une des poches de graisse inguinale à son origine, près du péritoine, et utilisez des ciseaux fins pour sectionner le tissu entre la peau et la graisse inguinale, en progressant vers l’aine, tout en évitant de contaminer la couche de tissu adipeux sous-cutané avec la peau.

Ensuite, placer le bourrelet adipeux inguinal isolé dans une boîte de Pétri de 60 millimètres étiquetée SQ contenant du milieu de culture à 37 degrés Celsius, et prélever le bourrelet adipeux inguinal de l'autre côté de l'animal de la même manière. Pour isoler les bourrelets adipeux viscéraux, inciser le péritoine afin d'exposer les bourrelets adipeux viscéraux et l'intestin. Puis déplacer l'intestin sur le côté, vers le thorax.

En saisissant le bourrelet de graisse viscérale à son extrémité distale, tirez délicatement sur le tissu adipeux et disséquez-le, en prenant soin d'exclure le tissu épididymaire. Placez ensuite le bourrelet graisseux dans une boîte de 60 millimètres étiquetée VIS contenant un milieu de culture à 37 degrés Celsius. Une fois tous les bourrelets graisseux collectés, transférez les boîtes dans une hotte de culture tissulaire et aspirez le milieu.

Utilisez des ciseaux courbes pour hacher finement les bourrelets. Ensuite, ajoutez les morceaux de tissu adipeux dans des tubes individuels de 50 millilitres contenant du collagénase fraîchement préparé. Puis, agitez les tubes à 300 tr/min et à 37 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes, jusqu'à ce que les tissus soient digérés.

Des fragments de tissu adipeux sous-cutané peuvent encore être visibles. Ajouter 20 millilitres de milieu de culture à la solution de collagénase pour arrêter la digestion, puis utiliser une pipette serologique de 10 millilitres pour aspirer et redistribuer la suspension tissulaire 10 fois afin de dissocier complètement les tissus digérés. Filtrer les cellules à l’aide de tamis cellulaires de 100 microns, puis centrifuger les tissus.

Ensuite, versez soigneusement le milieu, en prenant soin de ne pas perturber les culots, et remettez délicatement les deux groupes de cellules en suspension dans cinq millilitres d'eau stérile. Attendez deux minutes pour que les érythrocytes soient lysés. Puis arrêtez la réaction dans chaque tube par l'ajout de 25 millilitres de milieu supplémenté en FBS.

Filtrez les deux populations d'adipocytes à l'aide de nouveaux filtres cellulaires de 100 microns, centrifugez-les à nouveau, puis remettez en suspension les culots dans un à trois millilitres de milieu. Après numération par exclusion au bleu de trypan, ensemencez séparément un million de cellules provenant du tissu adipeux sous-cutané et un million de cellules viscérales dans des puits individuels d'une plaque de culture cellulaire à six puits. Après trypsination des cellules, diluez la trypsine avec un millilitre de tampon de séparation, puis centrifugez les plaques de culture.

Nous suspendons les cellules dans 500 microlitres par tube de tampon de séparation, puis centrifugeons à nouveau les cellules. Ensuite, nous resuspendons les cellules dans 90 microlitres par tube de tampon de séparation, et ajoutons 10 microlitres d'anticorps primaire anti-Sca1 marqué par la FITC à la suspension cellulaire. Après 10 minutes d'incubation à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière, lavons les cellules avec un millilitre de tampon de séparation par tube.

Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans 80 microlitres de tampon de séparation par suspension cellulaire. Ensuite, mélanger 20 microlitres de microbilles anti-FITC dans chaque puits, puis placer les plaques à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans un millilitre de tampon de séparation et remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon frais par tube.

Maintenant, placez une colonne dans le support magnétique et rincez-la avec 500 microlitres de tampon de séparation. Transférez les cellules du tissu adipeux sous-cutané du culot de culture sur la colonne, en prenant soin d'éviter les bulles, et récupérez les cellules négatives pour Sca1 non marquées dans un tube conique de 15 millilitres. Une fois que toutes les cellules ont traversé, lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de séparation.

Ensuite, transférez la colonne depuis l'aimant vers un nouveau tube conique de 15 millilitres, puis faites passer un millilitre de tampon de séparation frais à travers la colonne afin d'éluer les cellules positives pour Sca1. Enfin, centrifugez les deux fractions cellulaires positives et négatives pour Sca1, puis resuspendez les culots dans un millilitre de milieu de culture. Comptez ensuite le nombre de cellules dans chaque fraction et mettez en culture les fractions dans des puits individuels d'une nouvelle plaque de culture cellulaire à six puits.

Les cellules stromales vasculaires isolées à partir de tissu adipeux sous-cutané présentent une forme allongée de type fibroblaste, indépendamment de leur niveau d'expression de Sca1. Comme les cellules riches en Sca1 provenant du tissu adipeux inguinal sous-cutané, les cellules riches en Sca1 provenant du tissu adipeux viscéral épididymaire présentent une forme allongée de type fibroblaste. Alors que les cellules VIS faibles en Sca1 exhibent une forme épithélioïde.

Les cellules à haut niveau de Sca1 isolées de souris Sca1-GFP sont facilement identifiées comme des cellules GFP positives en culture tissulaire. En effet, lorsqu'elles sont analysées par cytométrie en flux, la majorité des cellules GFP positives expriment confirmées l'expression de la protéine Sca1 à leur surface cellulaire, comme détecté par un anticorps anti-Sca1. Associé à des analyses par PCR en temps réel, l'expression différentielle des métalloprotéinases matricielles collagénolytiques entre les cellules souches adipeuses à haut niveau de Sca1 provenant de tissu adipeux inguinal et épididymaire peut être démontrée.

En outre, lorsqu'on utilise des gels de collagène de type I marqués à la fluorescéine pour évaluer l'activité de dégradation péricellulaire, on observe une activité de remodelage du collagène nettement accrue, médiée par les cellules souches adipeuses viscérales Sca1 à expression élevée. Une fois maîtrisée, l'isolement des cellules du bourrelet adipeux peut être réalisé en deux heures si la procédure est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette technique, il est important de maintenir un champ chirurgical propre et bien organisé afin d'assurer un isolement efficace du bourrelet adipeux.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme un test de dégradation du collagène, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le remodelage tissulaire médié par les cellules souches dérivées du tissu adipeux. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'obésité et de la biologie de la matrice extracellulaire pour explorer le rôle des cellules souches dérivées du tissu adipeux dans le remodelage et la fonction du tissu adipeux chez la souris et l'humain. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir et d'enrichir des cellules primaires positives pour Sca1 à partir de dépôts de tissu adipeux.