Détection simultanée de c-Fos Activation de Sites de récompense dopaminergique mésolimbique et mésocortical Après Naive sucre et de graisse Ingestion chez le rat

L’objectif global de ce protocole expérimental est de déterminer si le VTA et ses principales zones de projection DA mésotélencéphatiques présenteraient une activation coordonnée et simultanée du c-Fos après l’ingestion de nouvelles solutions d’huile de maïs, de glucose, de fructose ou de saccharine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la motivation, et à déterminer si plusieurs sites cérébraux sont activés de manière coordonnée en réponse à des stimuli appétissants. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine les tests comportementaux établis, les techniques d’activation cellulaire et les analyses statistiques.

Pour installer l’appareil, utilisez un tube à centrifuger calibré avec un bouchon antivol et un tube siphonique métallique à 45 degrés pour fournir une mesure précise de la solution présentée au rat. Fixez-le à la cage d’habitation à l’aide d’un ressort métallique tendu, et pour permettre la visibilité de l’étalonnage. Trois à cinq jours avant l’entraînement, limitez les rations alimentaires au rat pour réduire son poids corporel à 85 % de son poids initial, afin d’augmenter la motivation à consommer la solution.

Entre-temps, fournissez 10 millilitres de solution de pré-entraînement, avec une saccharine à 0,2 %, à l’animal pendant quatre jours, sur une séance d’une heure, afin de maximiser la probabilité que le rat échantillonne la solution de test suivante avec une courte latence. Pesez le tube avant et après chaque séance pour obtenir la mesure d’admission. Ensuite, effectuez un test d’admission le cinquième jour sur des sous-groupes recevant l’une des six solutions.

Assurez-vous que les rats échantillonnent la solution avec une courte latence et excluez les sujets de l’étude si cette exigence n’est pas respectée. Pour préparer le tissu, après avoir sacrifié l’animal, retirez rapidement le cerveau du crâne. Utilisez les rongeurs pour fissurer et retirer soigneusement l’os du cerveau, en commençant par l’arrière vers l’avant.

Travaillez dans la zone située sous le cervelet et assurez-vous que les rongeurs se trouvent entre l’os et la pie-mère méningée. Une fois le haut et les côtés du crâne retirés, utilisez une petite spatule pour soulever le cerveau de sa base et coupez les nerfs crâniens avec de petits ciseaux. Ensuite, fixez le cerveau dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, placez le cerveau dans la solution de saccharose à température ambiante, jusqu’à ce qu’il se dépose au fond du récipient. Après cela, retirez le bulbe olfactif. Par la suite, retirez le cervelet et le pont.

Ensuite, montez le cerveau coronalement, avec la partie caudale fixée à l’étage du microtome, et coupez des sections coronales de 40 miromètres. Dans cette procédure, traitez les sections avec cinq millilitres de sérum de chèvre normal à 5 % et de Triton x-100 à 0,2 % de PBS, pendant une heure. Ensuite, incubez les sections traitées avec un anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant 36 heures, dans les puits contenant un millilitre de PBS.

Après 36 heures, rincez les sections trois fois avec cinq millilitres de PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Ensuite, incubez les sections avec l’anticorps secondaire à température ambiante pendant deux heures, dans les puits contenant un millilitre de PBS. Ensuite, rincez les sections trois fois dans cinq millilitres de PBS pendant 10 minutes à chaque fois.

Ensuite, incubez les sections rincées pendant deux heures dans un mélange de peroxydase de raifort Avidin disponible dans le commerce. Après deux heures, rincez les sections trois fois dans cinq millilitres de PBS, pendant dix minutes à chaque fois. Par la suite, faites réagir les sections avec du DAB en présence de peroxyde d’hydrogène, pendant cinq à dix minutes.

Après cela, marquez deux fois les sections VTA en les incubant avec un anticorps tyrosine hydroxylase, dans cinq millilitres de PBS, pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez les sections trois fois dans cinq millilitres de PBS, pendant dix minutes à chaque fois. Ensuite, incubez les sections avec l’anticorps secondaire dans cinq millilitres de PBS, à température ambiante, pendant deux heures.

Après deux heures, rincez les sections trois fois dans cinq millilitres de PBS, pendant dix minutes à chaque fois. Pour visualiser l’anticorps à l’aide d’un complexe d’anticorps secondaires peroxydase, faites-le réagir avec une combinaison de DAB et d’une solution de sulfate de nickel à 0,3 % pendant cinq à dix minutes. Comptez les cellules en double-cliquant sur l’icône du logiciel.

Allez dans la barre de menus, cliquez sur Acquisition, puis sur Image en direct. Ensuite, mettez l’accent sur la région d’intérêt et cliquez sur l’écran pour établir un point de référence. Ensuite, accédez à la barre d’outils de la grille, puis cliquez sur Afficher la grille et Utiliser les étiquettes de la grille.

Délimitez la région d’intérêt avec une trace prédéterminée. Ensuite, comptez toutes les cellules de chaque région d’intérêt et sélectionnez Plus dans la barre latérale gauche pour enregistrer le nombre de cellules c-Fos. Considérons une cellule positive pour c-Fos lorsqu’un cercle rouge foncé défini est observé.

Répétez ce processus pour chaque site, et assurez-vous que la fiabilité inter-juges des deux évaluateurs non informés pour chaque section dans chaque région d’intérêt, dépasse toujours 0,8. Ensuite, comptez les neurones positifs c-Fos dans les régions d’intérêt. Délimiter si l’immunoréactivité c-Fos est présente dans les cellules TH-positives et TH-négatives de l’ATV.

Cette image montre que l’apport en graisse ou en sucre augmente différentiellement l’activation de c-Fos dans l’ensemble de l’amygdale, ainsi que dans les sous-zones basolatérales et centrales-cortico-médiales de l’amygdale. Sur cette image, l’activation réelle de l’amygdale c-Fos a été observée chez des animaux exposés à des consommations d’huile de maïs, de glucose et de fructose. L’activation de C-Fos dans l’ATV a également été observée chez des animaux exposés à l’huile de maïs et à l’eau.

Les flèches noires indiquent les cellules représentatives positives au TH c-Fos, doublement marquées, tandis que les flèches grises indiquent les cellules représentatives de c-Fos uniquement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre semaines, si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre une méthodologie précise, de stocker et de compter.

Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.