In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

L’objectif global de cette centrifugation à gradient de vitesse est d’analyser les capsides du virus de la grippe A dans des conditions imitant le milieu endocytaire que les virus entrants rencontrent lors de l’entrée dans les cellules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les capsides du virus de la grippe A se désassemblent lors de l’entrée dans les cellules, telles que l’effet spécifique d’un pH légèrement acide sur la stabilité de la capside. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse quantitative du processus de désenrobage du virus de la grippe A dans des conditions expérimentales définies.

En plus de fournir des informations sur la façon dont le désenrobage du virus de la grippe A est initié, cette méthode peut également être appliquée à l’étude d’autres virus d’enveloppe avec des mécanismes de désenrobage connexes. La démonstration de la procédure sera assurée par Firat Nebloglu, un ancien étudiant de mon laboratoire. Après avoir préparé les tampons et les réactifs selon le protocole textuel, pour chaque condition de pH à tester, préparez le mélange maître de tampon détergent en mélangeant neuf millilitres d’un chlorure de sodium molaire, six millilitres de NP40 à 10 %, 2,4 millilitres d’inhibiteur de protéase 25X et neuf millilitres d’eau distillée deux fois.

Ensuite, pour chaque condition de pH, pipetez 4,4 millilitres du mélange principal dans un tube conique de 50 millilitres. Pour des valeurs de pH supérieures à 5,8, ajoutez 0,6 millilitre de la solution mère Tris de 500 milliMolaires ajustée au pH dans le tube. Pour des valeurs de pH de 5,8 et inférieures, ajoutez 0,6 millilitre de la solution mère de MES de 500 millimolaires ajustée au pH correspondant.

Préparez cinq millilitres de solution tampon, contenant 300 milliMolaires de chlorure de sodium, un inhibiteur de protéase 2X, 60 milliMolaires Tris, ajusté à pH 7,4, et de l’eau doublement distillée. Cela servira de tampon de gradient de contrôle sans détergent. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de stock de glycérol à 50 % à cinq millilitres de mélanges de tampons contenant et sans détergent, ce qui donne six solutions différentes de glycérol à 25 %.

Utilisez des bandelettes de pH pour vérifier les valeurs de pH. Préparez une solution de glycérol à 15 % en mélangeant un rapport de trois à sept de stock de glycérol à 50 % avec de l’eau distillée. À l’aide d’une seringue de cinq millilitres et d’une aiguille, ajoutez trois millilitres de solution de glycérol à 15 % dans six tubes de centrifugation ultra-clairs.

Lavez l’aiguille dans de l’eau bi-distillée après chaque étape. À l’aide d’une seringue de cinq millilitres et d’une longue aiguille, injectez soigneusement 3,4 millilitres de solution de glycérol à 25 % sous la couche de glycérol à 15 %, en prenant soin de ne pas mélanger les deux couches. Une interface entre les deux couches est clairement visible.

Répétez cette opération pour les six conditions à tester avec les solutions de glycérol respectives au pH ajusté. Ensuite, dans une enceinte de biosécurité de classe II, utilisez un millilitre de liquide allantoïdien clarifié et dilué, contenant le virus de la grippe A, pour recouvrir doucement les gradients de glycérol. Transférez les tubes dans les godets du rotor, équilibrez les tubes opposés et placez-les soigneusement dans un rotor d’ultracentrifugation SW-41 pré-refroidi.

Centrifugeuse à 2100 tr/min et 12 degrés Celsius pendant 150 minutes. Après la centrifugation, utilisez une pipette Pasteur propre et un aspirateur pour retirer soigneusement les deux couches de glycérol. Ensuite, avec 40 millilitres de tampon d’échantillon LDS non réducteur 1X, remettez complètement la pastille en suspension en pipetant de haut en bas avant de transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Pour effectuer SDS-PAGE, chauffez tous les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Chargez 20 microlitres de granulés dissous sur un mini-gel Bis-Tris à gradient préfabriqué et faites-le fonctionner à 200 volts pendant une heure dans 1X MOPS SDS tampon de fonctionnement. Incuber le gel dans une solution de fixation pendant une heure.

Rincez une à deux fois à l’eau et faites une tache pendant la nuit dans une boîte de culture cellulaire de 15 centimètres avec un volume suffisant de solution colloïdale de Coomassie tout en secouant doucement à température ambiante. Colorez le gel dans de l’eau doublement distillée, en remplaçant le liquide toutes les 15 à 20 minutes jusqu’à ce que le fond de gel devienne clair. Conservez le gel dans de l’eau doublement distillée à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit scanné pour la quantification de la bande.

Enfin, scannez le gel à haute résolution et utilisez un logiciel personnalisé disponible dans le commerce pour quantifier l’intensité des bandes protéiques. Soustrayez le signal de fond d’une région proche des bandes respectives et normalisez les valeurs par rapport aux valeurs de commande sans détergent. Dans cette expérience, X31 dérivé d’un fluide allantoïde clarifié a été soumis à une centrifugation par gradient de vitesse à des niveaux de pH compris entre 7,4 et 5,0 et analysé par SDS-PAGE.

En l’absence de détergent présent dans le gradient, les virions intacts sont granulés comme en témoigne le motif caractéristique des bandes, représentant HA, NP et M1 dans le gel coloré à Coomassie. Lors de l’ajout de NP40 à la couche inférieure de glycérol, l’enveloppe virale, y compris HA, NA et M2, a été solubilisée et le noyau viral seul s’est sédimenté dans la pastille pendant l’ultracentrifugation. À partir d’un pH inférieur à 6,5, M1 est progressivement perdu de la fraction granulée, atteignant un minimum entre pH 5,8 et pH 5,4.

En dessous d’un pH de 5,8, les ARNv ont été dissociés et donc perdus de la pastille. À partir des bandes protéiques analysées, deux seuils de pH distincts pour le désassemblage de la couche M1 et la dissociation des faisceaux vRNP ont été révélés, notamment un pH de 6,5 et un pH de 5,8, respectivement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que selon la souche ou le mutant du virus de la grippe A, différentes propriétés de désassemblage peuvent être observées.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie électronique peuvent être effectuées afin d’obtenir des informations supplémentaires telles que la structure des capsides isolées du virus de la grippe.