In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

L'objectif général de cette centrifugation en gradient de vitesse est d'analyser les capsides du virus de la grippe A dans des conditions imitant le milieu endocytique que les virus en cours d'entrée rencontrent lors de la pénétration cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles sur la façon dont les capsides du virus de la grippe A se désassemblent lors de l'entrée cellulaire, notamment l'effet spécifique d'un pH légèrement acide sur la stabilité du capsid. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une analyse quantitative du processus de désencapsidation du virus de la grippe A dans des conditions expérimentales définies.

Outre le fait de fournir des informations sur la manière dont le décapside du virus de la grippe A est initié, cette méthode peut également être appliquée à l'étude d'autres virus enveloppés possédant des mécanismes de décapside apparentés. La procédure sera démontrée par Firat Nebloglu, un ancien étudiant de mon laboratoire. Après avoir préparé les tampons et réactifs de stock conformément au protocole écrit, préparez pour chaque condition de pH à tester un mélange maître de tampon détergent en mélangeant neuf millilitres de chlorure de sodium à une molaire, six millilitres de NP40 à 10 %, 2,4 millilitres du stock d'inhibiteur de protéase 25X et neuf millilitres d'eau doublement distillée.

Ensuite, pour chaque condition de pH, pipeter 4,4 millilitres du mélange maître dans un tube conique de 50 millilitres. Pour les valeurs de pH supérieures à 5,8, ajouter 0,6 millilitre de la solution mère de Tris 500 millimolaire ajustée au pH correspondant dans le tube. Pour les valeurs de pH de 5,8 et inférieures, ajouter 0,6 millilitre de la solution mère de MES 500 millimolaire ajustée au pH correspondant.

Préparez cinq millilitres de solution tampon, contenant 300 millimolaires de chlorure de sodium, 2X d'inhibiteur de protéase, 60 millimolaires de Tris, ajusté à un pH de 7,4, et de l'eau doublement distillée. Cette solution servira de tampon témoin sans détergent. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de la solution mère de glycérol à 50 % à cinq millilitres des mélanges de tampon contenant du détergent et du tampon sans détergent, afin d'obtenir six solutions différentes de glycérol à 25 %.

Utilisez des bandes de pH pour vérifier les valeurs de pH. Préparez une solution de glycérol à 15 % en mélangeant un volume de trois parties de solution mère de glycérol à 50 % avec sept parties d'eau distillée. À l'aide d'une seringue de cinq millilitres et d'une aiguille, ajoutez trois millilitres de solution de glycérol à 15 % dans six tubes d'ultracentrifugation transparents.

Lavez l'aiguille à l'eau doublement distillée après chaque étape. Utilisez une seringue de cinq millilitres et une aiguille longue pour injecter soigneusement 3,4 millilitres de solution de glycérol à 25 % sous la couche de glycérol à 15 %, en prenant soin de ne pas mélanger les deux couches. Une interface entre les deux couches est clairement visible.

Répétez cette procédure pour les six conditions à tester avec les solutions de glycérine ajustées au pH respectif. Ensuite, dans une cabine de sécurité biologique de classe II, utilisez un millilitre de liquide allantoïque clarifié et dilué, contenant le virus de la grippe A, pour recouvrir délicatement les gradients de glycérine. Transférez les tubes dans les godets du rotor, équilibrez les tubes opposés, puis placez-les soigneusement dans un rotor de centrifugation ultracentrifugeuse SW-41 prérefroidi.

Centrifuger à 2100 tr/min et à 12 degrés Celsius pendant 150 minutes. Après la centrifugation, utiliser une pipette Pasteur propre et un aspirateur pour retirer soigneusement les deux couches de glycérol. Ensuite, à l’aide de 40 millilitres de tampon d’échantillonnage LDS 1X non réducteur, resuspendre complètement le culot en aspirant et en rejetant plusieurs fois à l’aide d’une pipette, avant de transférer l’échantillon dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Pour réaliser l'électrophorèse SDS-PAGE, chauffer tous les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Charger 20 microlitres des culots dissous sur un gel mini Bis-Tris en gradient prêt à l'emploi et faire migrer à 200 Volts pendant une heure dans un tampon de migration MOPS SDS 1X. Incuber le gel dans la solution de fixation pendant une heure.

Rincer une à deux fois à l'eau, puis colorer toute la nuit dans une boîte de culture cellulaire de 15 centimètres avec un volume suffisant de solution de Coomassie colloïdale, en agitant doucement à température ambiante. Décolorer le gel dans de l'eau doublement distillée, en renouvelant le liquide toutes les 15 à 20 minutes jusqu'à ce que le fond du gel devienne transparent. Conserver le gel dans de l'eau doublement distillée à quatre degrés Celsius jusqu'à son analyse par numérisation pour la quantification des bandes.

Enfin, numérisez le gel à haute résolution et utilisez un logiciel sur mesure disponible dans le commerce pour la quantification des intensités des bandes protéiques. Soustrayez le signal de fond provenant d'une région proche des bandes respectives et normalisez les valeurs par rapport aux valeurs du témoin sans détergent. Dans cette expérience, le X31 provenant de liquide allantoïque clarifié a été soumis à une centrifugation en gradient de vitesse à des pH compris entre 7,4 et 5,0, puis analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

En l'absence de détergent dans le gradient, les virions intacts sont mis en pellet, comme en témoigne le profil caractéristique des bandes correspondant à HA, NP et M1 sur le gel coloré au Coomassie. Lorsque du NP40 est ajouté à la couche inférieure de glycérol, l'enveloppe virale, comprenant HA, NA et M2, est solubilisée, et seul le noyau viral sédimente dans le pellet lors de l'ultracentrifugation. À partir d'un pH inférieur à 6,5, la protéine M1 est progressivement perdue de la fraction pellet, atteignant un minimum entre pH 5,8 et pH 5,4.

En dessous de pH 5,8, les vRNP ont été dissociés et ont donc été perdus dans le surnageant. Parmi les bandes protéiques analysées, deux seuils de pH distincts pour le désassemblage de la couche M1 et la dissociation des agrégats de vRNP ont été mis en évidence, respectivement à pH 6,5 et pH 5,8. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que, selon la souche ou le mutant particulier du virus de la grippe A, des propriétés de désassemblage différentes peuvent être observées.

Après cette procédure, d'autres méthodes comme la microscopie électronique peuvent être réalisées afin d'obtenir des informations supplémentaires, telles que la structure des capsides du virus de la grippe isolées.