Name: Étude Wnt Signaling Pendant Patterning de Conduite Airways (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Découvrez les techniques de coloration pour étudier la signalisation Wnt dans le développement trachéal chez la souris. Ces méthodes permettent d'analyser la prolifération cellulaire et la condensation mésenchymateuse lors de la formation du cartilage trachéal.

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Nous reconnaissons l&#39;aide de Mike Muntifering et Matt Kofron avec l&#39;imagerie confocale et Gail Macke avec les procédures histologiques. Ce travail a été partiellement financé par les Instituts nationaux de la santé-NHLBI (K01HL115447 DS).

Les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes. Les souris ont été traitées selon des protocoles approuvés par CCHMC Institutional Animal Care et utilisation Comité (Cincinnati, OH USA). Les souris utilisées au cours de ces études ont été maintenues dans un fond mixte. 1. Whole Mont X-galactosidase Coloration <ol><li> Euthanasier femme enceinte à E11.5 à E14.5, par inhalation de CO 2. Placez les animaux en CO 2 chambre, charger la chambre avec du CO 2. Maintenir les animaux dans la chambre pour un minimum de 5 min. Effectuer méthode secondaire de l&#39;euthanasie par dislocation cervicale. </li><li> région abdominale Clean avec de l&#39;éthanol (EtOH) 70% et d&#39;effectuer une laparotomie avec une seule incision médiane abdominale. Utiliser des ciseaux chirurgicaux et modèle standard (dentelées droite) de forceps. </li><li> Isoler cornes utérines à l&#39;aide de pinces et de ciseaux fins et immédiatement placer le tissu dans un plat de Pétri contenant réfrigéré solution PBS. Maintenir le tissu sur la glace jusqu&#39;à procédurel&#39;isolement des embryons. </li><li> Isoler embryons de cornes utérines. Disséquer tissu trachéal pulmonaire embryonnaire en utilisant un microscope binoculaire. Utiliser des pinces et ciseaux à pointe fine pour maintenir et perforer le tissu utérin et concepti libérant les embryons. <ol><li> Retirer les membranes restantes embryonnaires. Avec l&#39;aide de lames d&#39;aiguille couper la tête d&#39;embryons et de la partie inférieure du corps en dessous du diaphragme. Localiser foie comme un point de repère. </li><li> Après l&#39;isolement de la région thoracique de l&#39;embryon, passez à retirer les côtés latéraux de la paroi du corps, la colonne vertébrale et le cœur en utilisant des lames d&#39;aiguille. Faites attention tout en retirant le cœur pour éviter de blesser le tissu trachéal. Enfin, soigneusement, séparer l&#39;œsophage de la trachée en tirant l&#39;oesophage avec l&#39;aide de lames d&#39;aiguille. Maintenir le tissu dans une solution PBS sur la glace. </li></ol></li><li> Placez le tissu dans 4 ml vis flacons de chapeau à l&#39;aide de verre ou de transfert pipettes. Fixer le tissu pulmonaire dans la trachée 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 30 min. Après fixation,rincer le tissu avec du PBS. Lors du rinçage, préparer la solution de coloration X-gal (ajouter 5 mM K 3 Fe (CN) 6, (100 ul de 0,5 M stock) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 ul de 0,5 M stock) MgCl2 2 mM, ( 20 pi 1 M actions) 0,01% NADOC (50 pi 2% stock), 0,02% de NP 4 O (100 pi 2% stock), 1 mg / ml X-gal (500 pi de 20 mg / stock ml) et 9,13 ml de l&#39;eau distillée pour amener à un volume final de 10 ml). </li><li> Retirez tout PBS restant et ajouter 2 ml de solution de coloration X-gal dans le flacon de verre. Placer les flacons dans le bac sur un agitateur. tissus Tache 1 à 2 heures dans une solution de coloration X-gal. Incuber le tissu en solution X-gal pendant 4 heures pour un traitement ultérieur et l&#39;intégration. </li><li> Arrêter la réaction par les tissus de lavage dans 3% de diméthylsulfoxyde-PBS. Rincer dans du PBS, 3 fois pendant 5 minutes chaque lavage et stocker dans 70% d&#39;éthanol. </li><li> Remplir des boîtes de Pétri avec une solution / PBS 1% d&#39;agarose. Laisser agarose à se solidifier. Utilisation de pipettes de transfert de verre, placer le tissu sur la coopération agaroseplaques ATED remplis de solution PBS. Photographie montures entières en utilisant un microscope à dissection. Sélectionnez le filtre approprié pour fond clair. </li><li> Pour mieux distinguer les sites d&#39;échantillons de procédés de coloration X-gal pour inclusion dans la paraffine et la coupe. Placer les échantillons dans de fines cassettes d&#39;écran. <ol><li> Pour traiter des échantillons pour l&#39;inclusion en paraffine utilisent un processeur automatisé et mis en place un cycle court comme suit: six changements d&#39;alcool: 5 min premier changement et 3 min par chaque changement restant. Trois changements de Xylène: 5 min premier changement et 3 min deux prochaines modifications. Les étapes précédentes sont effectuées à 30 ° C. Enfin, effectuer trois changements de paraffine à 62 ° C: 25 min, 8 min et 5 min. </li></ol></li><li> échantillons Orient pour l&#39;intégration avec le tissu à plat sur le fond du bateau. intégration Ajouter délicatement la paraffine pour remplir le bateau enrobage. Refroidir immédiatement sur la plaque froide d&#39;incorporer la station jusqu&#39;à ce solidifie paraffine. Retirer le bloc de bateau intégration. L&#39;utilisation d&#39;un microtome, générer 6 um sexions. sections de montage sur-diapositives prétraités et diapositives sèches sur diapositive chaud réglé à 42 ° C pendant 1 heure. </li><li> Cuire glisse pendant la nuit dans un four à 56 ºC. Placez les diapositives dans les racks. Déparaffiner glisse avec trois changements de 100% Xylène, 10 min chacun. Utiliser la coloration des plats remplis avec 200 ml de xylene. </li><li> Réhydrater lames à l&#39;aide d&#39;EtOH série graduée (100%, 70%, 50% et 30%, 1 min par étape) pour PBS avant avec contre-coloration nucléaire rouge rapide pendant 10 à 30 secondes. Rincer les lames avec de l&#39;eau du robinet à trois reprises pendant 5 minutes à chaque fois pour éliminer l&#39;excès de Nuclear Fast Red. </li><li> Déshydrater les lames dans une série EtOH gradué (50%, 70% et 100% EtOH) avant le lavage en trois changements de Xylène (20 trempettes chaque changement) et la couverture de glissement avec les médias de montage à base de xylène. </li></ol> 2. lectine Coloration <ol><li> Disséquer le tissu pulmonaire E13.5 et E14.5 trachéale, comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.4. Utilisation de pipettes de transfert de verre lieu tissu dans des flacons à bouchon à vis. Fixer le tissu pulmonaire trachéale avec 2 ml d&#39;solution PFA 2% durant la nuit à 4 ° C. Après fixation, rincer les échantillons dans du PBS trois fois pendant 10 min à chaque lavage. </li><li> Préparer un tampon de blocage, habituellement un volume final de 10 ml de solution. Ajouter 0,1 g de BSA (1%) à 8 ml de PBS. Laisser BSA se dissoudre. Ajouter 0,2 ml de sérum de chèvre (2%), de 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Amener le volume final à 10 ml avec du PBS. échantillons de bloc pendant 1 heure dans 0,5 ml de tampon de blocage à la température ambiante. </li><li> Éliminer le tampon de blocage à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert et de le remplacer par une solution de lectine constituée de 50 pg / pl de la lectine, du sérum de chèvre à 10% et du PBS. En utilisant 250 pi de solution de lectine par échantillon. Incuber une nuit à 4 ° C. Assurez-vous de couvrir le flacon en verre contenant du tissu avec une feuille d&#39;aluminium. Après incubation avec une solution de lectine, rincer les échantillons dans du PBS trois fois pendant 10 minutes. </li><li> La place explants dans des boîtes de Pétri d&#39;agarose enduit contenant assez PBS pour couvrir les échantillons. Photographie monte entier en utilisant un microscope à fluorescence-dissection. Sélectionnez le appropFiltre riée pour détecter la fluorescence. Lectine PNA est généralement couplée à la GFP. </li></ol> 3. Le total du Mont immunofluorescence et microscopie confocale <ol><li> Isoler tissu pulmonaire trachéale, transfert à 4 ml flacons de bouchon à vis en verre et fixer une nuit dans 4% PFA. E11.5 tissu peut être fixé dans 2% de PFA. Magasin dans le méthanol à 100%. Les échantillons peuvent être stockés jusqu&#39;à plusieurs mois à -20 ° C. </li><li> Retirer le méthanol en utilisant le transfert pipette et perméabiliser échantillons en utilisant l&#39;eau de Javel de Dent (4 parties de méthanol, 1 partie DMSO et 1 partie 30% de H 2 O 2) pendant 2 heures. tissu hydraté dans une série graduée de méthanol dilué dans du PBS comme suit: 100% de methanol, 75% de methanol, 50% de methanol, 25% de methanol à 100% PBS. Incuber 10 minutes à la température ambiante pendant chaque étape d&#39;hydratation. </li><li> Bloc tissu dans 0,5% de réactif de blocage dilué dans du PBS (voir Matériaux pour les détails) pendant deux heures à la température ambiante sous agitation. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire à bloquersolution (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) et incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C. échantillons Laver avec du PBS cinq fois à la température ambiante. Effectuez chaque lavage pendant 1 h. </li><li> Appliquer un anticorps secondaire à une dilution de 1: 500 dans une solution de blocage à 0,5%. Sélectionnez soigneusement les anticorps secondaires pour empêcher la liaison entre les anticorps secondaires. Incuber une nuit à 4 ° C en chambre noire. échantillons Laver trois fois pendant 20 min à température ambiante. Déshydrater les échantillons dans une série graduée de méthanol dilué dans du PBS comme suit: 25% de methanol, 50% de methanol 75% de methanol, 100% de methanol, 10 minutes à chaque étape. REMARQUE: Veiller à ce que les échantillons restent recouverts de papier d&#39;aluminium et de minimiser l&#39;exposition à la lumière. Le tissu peut alors être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines jusqu&#39;à ce que photographier. </li><li> Échantillons de transfert à fait personnalisé plaques d&#39;étape, enlever le méthanol et clair avec environ 200 pi de solution claire de Murray 19,20 (2 parties benzoate de benzyle, 1 partie alcool benzylique) immédiatement befimagerie du minerai. Photographie à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Traiter et analyser l&#39;image en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. </li></ol> Prolifération 4. Cell <ol><li> Injecter des souris gravides de E11.5 par voie intrapéritonéale avec une solution de BrdU à une concentration de 100 ug BrdU / g de poids corporel. Sacrifiez femelle comme décrit dans l&#39;article 1 du protocole et d&#39;isoler les embryons à E12.5 ou E13.5. En utilisant des lames de couteau, des têtes d&#39;accise et la partie inférieure du corps en dessous de la cavité thoracique. </li><li> Placez le tissu thoracique dans 4 ml vis flacons de chapeau et fixer dans 1 ml de 4% PFA pendant la nuit. Laver avec du PBS des échantillons deux fois pendant 5 min et déshydrater les échantillons à travers une série d&#39;éthanol dilué dans de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à 70% d&#39;éthanol comme suit: 30%, 50% et 70% d&#39;éthanol, pendant 5 minutes à chaque étape. <ol><li> Placer les échantillons à écran cassettes de taille moyenne. tissu de processus pour l&#39;incorporation de la paraffine en utilisant et un processeur automatisé. Mettre en place un cycle comme suit: six changements d&#39;alcool pendant 8 min chacun, trois changements de Xylène pour 6 min chacun, trois changements de paraffine, pour 25 min, 9 min et 8 min. </li></ol></li><li> Incluez dans de la paraffine orienter le tissu dans la position désirée pour générer 6 um transversales ou des sections longitudinales tel que décrit dans la section 1. sections de place sur des lames et permettre au tissu d&#39;adhérer à glisser sur la lame chaude ensemble à 42 ° C pendant 1 heure. </li><li> diapositives Cuire, sur leurs côtés, une nuit dans un four à 56 ° C. Placez les diapositives dans les racks en plastique. diapositives De-paraffinize par immersion dans trois changements de 100% Xylène, 10 min par changement. Utiliser 200 ml de Xylène pour submerger complètement les diapositives. Réhydrater lames à l&#39;aide d&#39;EtOH série graduée (100%, 70%, 50% et 30%, 5 minutes par étape avec agitation) à du PBS (5 minutes). </li><li> Effectuer la récupération de l&#39;antigène à l&#39;aide tampon citrate 10 mM, pH 6. Pour préparer 100 ml de mélange de tampon de citrate 18 ml de 0,1 M d&#39;acide citrique monohydraté et 82 ml de 0,1 M de citrate de sodium. <ol><li> Placer les échantillons en plastique bocaux Coplin remplis avec une solution de récupération d&#39;antigène et micro-ondes pendant 6,5 min à puissance élevée. Ajouter dislabouré eau pour bocal de Coplin pour compenser évaporées-tampon citrate et réchauffer à 40% de puissance pendant 6 min. </li><li> Remplissez jarre Coplin vers le haut avec de l&#39;eau, et réchauffer à nouveau à 40% de puissance pendant 6 min. temps de micro-ondes peut varier en fonction des micro-ondes utilisé. </li><li> Laisser les lames refroidir pendant 20 min à température ambiante avant des lames de lavage dans de l&#39;eau distillée pendant 1 min, puis du PBS pendant 5 min. Après la PBS laver, bloc glisse pendant 2 heures dans une solution de blocage contenant TBS (2,425 g de base Tris et 8,765 g de NaCl dilué dans 1 litre d&#39;eau distillée) 10% de sérum d&#39;âne et 1% de BSA. </li></ol></li><li> Ajouter des anticorps primaires dilués dans une solution de blocage (TBS contenant 10% de sérum d&#39;âne et 1% BSA). BrdU (marqueur de la mitose), Nkx2.1 (de l&#39;épithélium des voies respiratoires), Sox9 (cellules qui donneront lieu à du cartilage) et αSMA (cellules musculaires lisses). Incuber les lames pendant une nuit, à 4 ° C. Utiliser la méthode de superposition pour conserver des anticorps. Appliquer 180 pi d&#39;anticorps à un joint, puis fixez slide comme si lamelleping. </li><li> Détachez joint en plongeant les lames dans l&#39;eau distillée. Après le retrait du joint, laver l&#39;anticorps primaire non lié en effectuant six 5 min lavages avec du TBS contenant 0,1% de Tween-20. <ol><li> Incuber les lames avec de l&#39;anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage à une dilution de 1: 200, pendant 1 h à température ambiante. Sélectionnez Anticorps secondaires soigneusement pour empêcher la liaison indésirable parmi eux. Retirer l&#39;anticorps secondaire non lié en effectuant trois lavages de cinq minutes avec du TBS contenant 0,1% de Tween. </li><li> Laver les lames à 0,1 base M Tris deux fois pendant 5 min puis 0,05 base M Tris deux fois pendant 5 min. Les lames peuvent être laissés dans 0,05 base M Tris tout coversliping en utilisant les médias de montage avec ou sans DAPI (1,5 pg / ml). Stocker les lames dans le dossier de diapositives à 4 ° C et protéger de la lumière, en recouvrant le dossier avec une feuille d&#39;aluminium. </li></ol></li><li> Visualisez la coloration et de la photographie en utilisant un microscope à fluorescence automatisé. Nombre de cellules marquées et cellules totales par champ photographié au20X et 40X pour déterminer les rapports des cellules en prolifération aux cellules totales. </li></ol>

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<li>Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+%28hdf%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li>
<li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C%2FPDGFR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li>
<li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li>
</ol>

&quot;Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.&quot;

Evénements sous-tendent la morphogenèse des voies respiratoires ne sont pas complètement compris, en particulier les processus nécessaires à la structuration des voies aériennes. Des études antérieures ont utilisé des techniques ex vivo dans lequel explants en développement sont cultivées à l&#39;interphase air-liquide ou incorporé dans matrigel 21,22. Ces études ont montré que les facteurs de croissance influent sur la formation de motifs de la trachée et le développement de la formation de cartilag...

Le développement des voies respiratoires est initiée par jour embryonnaire 9 (E9) avec l&#39;apparition de cellules positives Nkx2.1 dans le endodermique ventral foregut 1,2. Tube de séparation oesophagien-trachéale résoudra par E11.5 lorsque les tubes peuvent être distingués comme des entités distinctes, chacune entourée d&#39; un tissu mésenchymateuses 3. Wnt joue un rôle clé dans la description des voies respiratoires comme la suppression de Wnt2 et WNT2B, exprimé par le mesenchyme splanchnique et la suppression de β-caténine de l&#39;épithélium respiratoire endodermique entraîne agenesis du poumon 4,5. Nos études antérieures ont déterminé que la suppression de Wls, un récepteur de chargement médiation de la sécrétion de tous les ligands Wnt, à partir des résultats des voies respiratoires dans endodermiques hypoplasie pulmonaire, des défauts dans le développement vasculaire pulmonaire et une mauvaise formation de motifs du mésenchyme trachéale 6,7. Ces données confirment l&#39;importance de la cro épithéliale-mésenchymateusess parler dans la différenciation cellulaire et la spécification, comme il a également été démontré dans d&#39; autres études 8,9. L&#39;étude des premiers stades du développement du poumon repose sur génétique, in vitro et ex vivo techniques qui nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d&#39; entraînement identité respiratoire 10-16. Entières cultures d&#39;explants du poumon à l&#39;interphase liquide de l&#39; air ont été largement utilisés pour étudier les effets de facteurs de croissance dans les premiers stades de ramification pulmonaire morphogenèse 10,17,18. Bien que cette méthode est utilisée en tant que lecture des changements morphologiques, tels que la morphogenèse de ramification, et la modulation de l&#39; expression génique, il est limité à l&#39;étude des premières étapes du processus de développement, car la culture elle - même ne supporte pas le développement du système vasculaire 17. Développement du cartilage trachéal nécessite de plus longues durées d&#39;incubation qui peut-être pas compatible avec cette technique de culture. Pour Analyze le rôle de la signalisation Wnt pendant la formation des voies respiratoires, nous avons adapté des techniques standard pour répondre aux besoins de nos études embryonnaires. Nous avons modifié les volumes, les temps de coloration, le vélo de traitement pour l&#39;inclusion en paraffine et le calendrier pour la compensation du tissu trachéal-poumon. L&#39;objectif principal d&#39;optimiser les techniques décrites dans la présente étude était d&#39;analyser les premiers stades du développement trachéale chez les souris qui ont lieu à partir de E11 à E14.5. Utilisation de la souris reporters ligne Axin2LacZ nous sites précisément déterminés de Wnt activité / β-caténine dans le trachéale mésenchyme en développement. Nous avons également adapté lectine procédure de coloration pour les tissus ensemble trachéale monture. Ainsi, nous avons pu visualiser condensations mésenchymateuses et de prédire les sites où chondrogenèse aura lieu. Coloration de la montagne ensemble et sections de tissus embryonnaires obtenues à partir de souris WlsShhCre, couplées avec des techniques de microscopie de pointe, nous a permis de dévoiler le rôle des ligands Wnt produits par le traépithélium trachéale en trachéale patterning.

<table><tbody><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , Lapin</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, lapin</td></tr><tr><td>Anti Muscle Lisse Actine ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, souris</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, cochon d’Inde</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:400, souris</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, mouton</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, souris</td></tr><tr><td>PNA Lectine</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaires</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Alexa fluor Sondes moléculaires</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher brand super-frost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16 %)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Réactif bloquant</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Composant du kit TSA #2&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes Tissue-loc Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes de biopsie</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Disponible en différentes couleurs</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&nbsp ; Kernechtrot 0,1 %</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium tribasique dihydraté</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de Trizma</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Micro couteaux</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 céramique</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td></td><td>Microscope à grand champ</td>NikonA1Rsi <td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopie confocale. Paramètres :Appareil photo NikonA1 plus, scanner : Galvano, détecteur :DU4. Optique Plan Apo lambda 10X. Modalité : Laser à fluorescence grand champ confocal.</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscope de dissection de fluorescence</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscope à fluorescence automatisé</td></tr><tr><td>Leica Suite d’applications</td><td>Leica</td><td>Logiciel d’imagerie Leica</td><td></td></tr><tr><td>NIS</td><td>Logiciel d’imagerie Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Logiciel de traitement d’imagerie</td></tr></tbody></table>

Étude wnt signaling pendant patterning de conduite airways

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt Les voies de signalisation jouent un rôle essentiel dans le développement des voies respiratoires. Il est nécessaire de définir des mécanismes précis de différenciation et de morphogenèse contrôlés par la signalisation Wnt pour comprendre comment les tissus sont structurés au cours du développement normal. Ces connaissances sont également essentielles pour déterminer l’étiologie des anomalies congénitales telles que l’hypoplasie pulmonaire et la trachéobronchomalacie. L’analyse des premiers stades de développement des voies respiratoires pose des défis, car la quantité limitée de tissu empêche la réalisation de protocoles standard mieux adaptés aux études postnatales. Dans cet article, nous discutons des méthodologies pour étudier la différenciation cellulaire et la prolifération dans les voies respiratoires. Nous décrivons des techniques telles que la coloration à montage entier, le traitement du tissu pour la microscopie confocale et l’immunofluorescence en coupes de paraffine appliquées au développement du poumon trachéal. Nous discutons également des méthodologies pour l’étude de la différenciation du mésenchyme trachéal, en particulier la formation du cartilage. Les approches et les techniques discutées dans le présent article contournent la limitation du matériel tout en travaillant avec du tissu embryonnaire, permettant une meilleure compréhension du processus de structuration du développement des voies respiratoires conductrices.

Wnt activité / β-caténine Toute coloration mount Lac-Z a été détectée dans le tissu trachéal-poumon d&#39;embryons isolés de journaliste Axin2 Lac -Z souris 11. Sites de coloration indiquent Wnt activité / β-caténine. L&#39;analyse des coupes de toute coloration de montage a déterminé que l&#39;activité Wnt / β-caténine est présent dans le mesenchyme de la trachée et dans mésenchyme de...

L&#39;utilisation de souris rapporteurs couplés à la montagne entière et section coloration, la microscopie et des essais in vivo facilite l&#39;analyse des mécanismes sous - jacents la structuration normale des voies respiratoires. Ici, nous décrivons comment ces techniques ont contribué à l&#39;analyse de la signalisation Wnt au cours du développement de la trachée.

Étude Wnt Signaling Pendant Patterning de Conduite Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

L'objectif général des procédures de coloration est de démontrer le rôle de la voie de signalisation Wnt dans les premiers stades du développement des voies aériennes supérieures, en utilisant des tissus embryonnaires provenant de modèles murins génétiquement modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie pulmonaire, telles que, par exemple, la manière dont les structures de soutien des voies aériennes conductrices s'organisent. Les techniques que nous allons présenter ici nous permettront d'étudier la prolifération cellulaire ou le processus de condensations mésenchymateuses, qui sont des événements clés dans la formation du cartilage trachéal. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être utilisée sur de faibles quantités de tissu. Cela inclut les explants pulmonaires et les trachées isolées d'embryons E11.En général, les personnes novices dans cette procédure éprouveront des difficultés en raison de la taille de l'échantillon ainsi que de la quantité limitée de tissu disponible. Il est essentiel de se sentir à l'aise lors de la manipulation de tissus embryonnaires, ce qui s'acquiert en restant attentif tout au long des étapes et en s'assurant qu'une quantité constante de tissu est disponible d'une étape à l'autre. Après avoir euthanasié une souris femelle gestante à E11,5 à E14,5 et avoir réalisé une laparotomie conformément au protocole décrit, utilisez une pince et des ciseaux fins pour isoler les cornes utérines, puis placez immédiatement le tissu dans une boîte de Pétri contenant une solution de PBS refroidie.Ensuite, placez la boîte sur de la glace. Pour isoler les embryons des cornes utérines, utilisez une pince fine pour maintenir le tissu utérin. Puis, avec des ciseaux, percez le tissu utérin et le conceptus afin de libérer les embryons.Ensuite, retirez toutes les membranes embryonnaires résiduelles. Puis, au microscope stéréoscopique et à l’aide de lames d’aiguille, sectionnez la tête et la partie inférieure du corps, en dessous du diaphragme, et repérez le foie comme point de repère. Utilisez les lames d’aiguille pour enlever les côtés latéraux de la paroi corporelle, la colonne vertébrale et le cœur.En prenant soin de ne pas endommager le tissu trachéal. Pour disséquer le tissu pulmonaire trachéal embryonnaire, séparez délicatement l'œsophage de la trachée à l’aide de lames d’aiguille en tirant sur l’œsophage. Placez le tissu dans du PBS sur de la glace avant d’utiliser des pipettes en verre ou des pipettes de transfert pour transférer le tissu dans des vials en verre de quatre millimètres à bouchon vissé.Ajouter du paraformaldéhyde à 4 %, ou PFA, dans du PBS et incuber pendant 30 minutes. Rincer ensuite le tissu avec du PBS. Après avoir éliminé le PBS des échantillons, ajouter deux millimètres de solution de coloration X-gal et incuber de une à deux heures, ou quatre heures pour un traitement ultérieur et une inclusion.Arrêter la réaction en utilisant du DMSO à 3 % dans du PBS pour laver le tissu trois fois pendant cinq minutes chacune. Ensuite, conserver le tissu dans de l'éthanol à 70 %. Après avoir utilisé un appareil automatique pour traiter les échantillons en vue de l'inclusion en paraffine selon le protocole indiqué, orienter les échantillons de manière à ce que le tissu soit à plat au fond d'un bateau d'inclusion.Ajouter soigneusement du paraffin pour remplir le bateau d'inclusion, puis placer immédiatement sur la plaque froide de la station d'inclusion jusqu'à ce que le paraffin durcisse. Ensuite, retirer le bloc du bateau d'inclusion et, à l'aide d'un microtome, couper des sections de six micromètres. Puis monter les sections sur des lames.Et placer les sections sur un chauffe-lame à 42 degrés Celsius pendant une heure. Faire cuire les lames dans un four à 56 degrés Celsius toute la nuit. Ensuite, pour déparaffiner les échantillons, placer les lames cuites dans des porte-lames et les transférer dans des bacs de coloration contenant 200 millilitres de xylène à 100 %, trois fois pendant 10 minutes chacun.Utilisez une série d'éthanol à concentration décroissante pendant une minute chacune pour réhydrater les lames. Ensuite, contrecolorez les échantillons avec le rouge nucléaire rapide pendant 10 à 30 secondes. Rincez les lames trois fois à l'eau du robinet, cinq minutes à chaque fois.Pour déshydrater les lames, utilisez une série d'éthanol à concentration croissante avant de laver les échantillons dans trois bains de xylène. Ensuite, montez les échantillons à l'aide d'un milieu de montage à base de xylène et de lamelles. Pour réaliser la coloration par lectine, après avoir fixé le tissu pulmonaire trachéal et préparé le tampon de blocage selon le protocole décrit, transférez les échantillons dans 0,5 millilitre de tampon de blocage et incubez-les à température ambiante pendant une heure.Utilisez une pipette de transfert pour éliminer le tampon de blocage et le remplacer par 250 microlitres de solution de lectine par échantillon. Ensuite, recouvrez les vials en verre avec du papier d'aluminium et incubez à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le jour suivant, après avoir rincé les échantillons avec du PBS, placez les explants dans des boîtes de Pétri recouvertes d'agarose contenant suffisamment de PBS pour recouvrir les échantillons.Ensuite, utiliser un microscope stéréo à fluorescence pour photographier les montages entiers. Pour réaliser une coloration immunofluorescente sur des montages entiers, après avoir fixé les échantillons selon le protocole décrit dans le texte, utiliser une pipette de transfert pour éliminer le méthanol, puis ajouter de l'eau de Javel concentrée et incuber le tissu pendant deux heures afin de rendre les échantillons perméables. À l'aide d'une série progressive de méthanol dilué dans du PBS, hydrater le tissu en l'incubant à température ambiante pendant 10 minutes à chaque étape.Après avoir bloqué le tissu selon le protocole indiqué, ajouter les anticorps primaires et la solution de blocage, puis incuber les échantillons à quatre degrés Celsius toute la nuit. Une fois les échantillons lavés dans du PBS, ajouter une dilution d'anticorps secondaires au 1/500 dans du PBS, et incuber à l'obscurité à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le jour suivant, après avoir lavé les échantillons trois fois pendant 20 minutes chacun dans du PBS, utiliser une série progressive de méthanol dans du PBS pour déshydrater les échantillons pendant 10 minutes à chaque étape.Transférez les échantillons sur des plaques de support faites sur mesure. Éliminez le méthanol. Utilisez ensuite 200 microlitres de la solution clarifiante de Murray pour clarifier les échantillons.Imager immédiatement à l’aide d’un microscope confocal. Après avoir injecté des souris gestantes à E11,5 et avoir isolé les embryons à E12,5 ou E13,5 selon le protocole décrit dans le texte, utiliser des lames de couteau pour exciser les têtes embryonnaires et les parties inférieures des corps, situées sous les cavités thoraciques. Placer le tissu thoracique dans des flacons vissables de quatre millilitres et ajouter un millilitre de PFA 4 %.Après l'encapsulation, la sectionnement et la réhydratation des échantillons conformément au protocole écrit, placer les lames dans des bocaux de Coplin et les remplir avec une solution tampon de citrate à 10 millimolaire, pH six. Chauffer les échantillons au micro-ondes à puissance maximale pendant six minutes et demie, puis remplacer le tampon de citrate évaporé par de l'eau distillée et chauffer à nouveau. Après refroidissement, lavage et blocage des lames selon le protocole écrit, appliquer 180 microlitres d'anticorps primaires, dilués dans la solution de blocage, sur un joint et fixer la lame comme si l'on posait un couvre-objet.Le lendemain, plonger les lames dans de l'eau distillée pour détacher le joint. Ensuite, utiliser du TBS contenant 0,1 % de Tween 20 pour laver les lames six fois, cinq minutes chacune. Après l'incubation des lames avec les anticorps secondaires, laver les lames deux fois avec de la Tris Base 0,1 M, cinq minutes chacune, puis les laver deux fois avec de la Tris Base 0,05 M.Gardez les lames dans une solution de base de Tris 0,05 M tout en ajoutant le milieu de montage, avec ou sans DAPI, puis posez une lamelle. Enfin, utilisez un microscope à fluorescence automatisé pour acquérir les images des échantillons et procédez à l'analyse conformément au protocole décrit. Dans cette figure de tissu pulmonaire trachéal en montage entier, isolé de souris Reporteuses et de deux souris lacZ, la coloration lacZ a été détectée dans le mésenchyme de la trachée ainsi que dans les régions périphériques des poumons en développement, indiquant une activité de la voie Wnt/bêta-caténine.Dans cette expérience, des tissus pulmonaires trachéaux de stade E12,5 à E14,5 ont été colorés avec la lectine PNA. Chez les animaux témoins, une fluorescence était détectée sous forme de bandes périodiques dans le mésenchyme, là où se forme le cartilage. Toutefois, l'absence de coloration chez les embryons Wntless sonic hedgehog Cree indique que la signalisation Wnt est nécessaire à la condensation mésenchymateuse.Dans un tissu trachéal entier d'embryons E11,5, l'expression de SOX9 est limitée au mésenchyme sous forme d'une bande continue, tandis que dans le poumon en développement, SOX9 est observé à la périphérie de l'épithélium respiratoire. Comme illustré ici, NKX2.1 est restreint à l'épithélium de la trachée. La prévention de la sécrétion de ligands Wnt par l'épithélium diminue l'expression de SOX9 dans le mésenchyme, mais n'affecte pas l'expression de SOX9 dans l'épithélium pulmonaire périphérique.La coloration de l'actine alpha des muscles lisses est détectée à des niveaux faibles dans le tissu trachéal, mais elle est clairement observée dans le larynx et l'estomac. Enfin, comme indiqué sur cette figure, le marquage in vivo du tissu trachéal avec BrdU, SOX9 et l'actine alpha des muscles lisses montre que les cellules marquées par SOX9 se divisent à un niveau plus élevé que les cellules marquées par l'actine alpha des muscles lisses. Le profil de prolifération est inversé dans le tissu trachéal Wntless sonic hedgehog Cree.Une fois maîtrisées, la plupart de ces techniques peuvent être réalisées en deux jours si elles sont effectuées correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de l'origine de l'anticorps primaire lors du choix de l'anticorps secondaire. Cela est important pour toutes les immunomarquages, mais particulièrement crucial lorsque vous utilisez plus d'un anticorps primaire.Après la coloration au X-galactosidase, des techniques supplémentaires telles que l'hybridation in situ peuvent être réalisées afin d'obtenir des informations complémentaires et de répondre à d'autres questions, par exemple si un gène particulier d'intérêt sera exprimé durant la signalisation Wnt. Les techniques présentées ici seront utiles aux chercheurs intéressés par les mécanismes de mise en place silencieux médiés par la signalisation Wnt, ou par d'autres voies de signalisation clés du développement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier le processus de différenciation durant le développement du tractus respiratoire.Et également mieux comprendre le rôle de la signalisation Wnt dans le modelage des voies aériennes conductrices. N’oubliez pas, lors de votre manipulation du paraformaldéhyde et du benzoate de benzyle, de prendre les précautions appropriées, telles que porter des gants, préparer les solutions sous hotte, et éliminer les solutions usées conformément aux lois et réglementations locales.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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