Applications de la mono-sonde: Mass Spectrometry Imaging et simple Cellule d'analyse dans les conditions ambiantes

L’objectif global de cette méthode est de créer un dispositif d’échantillonnage à l’échelle microscopique, le Single-probe, pour analyser des cellules uniques vivantes à l’aide de la spectrométrie de masse dans des conditions ambiantes. Et pour effectuer l’imagerie par spectrométrie de masse ambiante des tissus biologiques avec une haute résolution spatiale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les études biologiques et pharmaceutiques.

Par exemple, quelles sont les molécules présentes dans les cellules uniques vivantes et comment sont-elles distribuées dans les tissus. Le principal avantage de cette technique est que la sonde unique est un dispositif multifonctionnel qui peut être utilisé à la fois pour l’analyse de cellules uniques vivantes et les expériences d’imagerie par spectrométrie de masse ambiante à haute résolution. Bien que cette méthode puisse analyser des cellules et des tissus uniques, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes où l’échantillonnage à l’échelle microscopique est souhaitable, tels que l’analyse des spath de produits chimiques et de microcolonies et de biofilms vivants.

Wei Rao, un postdoctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec moi. Placez tout un organe de souris d’intérêt au centre d’un petit puits en plastique. Immergez l’organe dans un composé d’enrobage tissulaire jusqu’à une hauteur d’environ 10 mm.

Placez immédiatement les mouchoirs dans de l’azote liquide pour la congélation instantanée. Pour préparer la section de tissu de souris, prenez l’organe de souris congelé et décongelez-le à 15 degrés Celsius dans un cryo-microtome à température contrôlée. Fixez le tissu sur une base en acier avec environ 500 microlitres de composé d’enrobage de tissu, et placez-le sur un support de sectionnement cryo-microtome de sorte que l’orientation de section souhaitée soit présentée au couteau.

Sectionnez le tissu à une épaisseur de 12 microns. Ensuite, placez les tranches de tissu sectionnées sur des lames de microscope en polycarbonate et laissez-les sécher pendant 30 minutes à température ambiante. Obtenez un échantillon cellulaire, tel que 1 millilitre de suspension cellulaire HeLa, et ajoutez-le dans 9 ml de milieu de culture cellulaire complet dans une plaque de culture cellulaire standard de 10 cm.

Maintenez les cellules en culture à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2 pendant deux à trois jours, jusqu’à ce que la surface de culture soit couverte à 70-80 % sur la plaque de culture cellulaire. Effectuer le passage cellulaire dans la plaque de culture cellulaire. Pour ce faire, aspirez le milieu de croissance et rincez les cellules avec 5 ml de solution saline tamponnée 1x phosphate

Retirez le PBS à l’aide d’un embout d’aspiration stérile et incubez les cellules avec 2,5 ml de trypsine pendant environ 5 minutes à 37 degrés Celsius pour détacher les cellules de la plaque de culture. Arrêtez l’activité de la trypsine en ajoutant 7,5 ml de milieu de culture cellulaire complet, puis remettez uniformément les cellules en suspension. Pour préparer les échantillons de cellules pour une expérience de spectrométrie de masse à cellule unique, ou SCMS, placez d’abord des lames individuelles de micro-couverture dans les puits d’une plaque à 12 puits.

Ensuite, ajoutez 1,8 ml de milieu de culture cellulaire et 0,2 ml de suspension cellulaire dans le puits. Mélangez doucement les cellules en agitant doucement la plaque avant de les incuber dans un environnement à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius, pendant environ 24 heures. Pour effectuer un traitement médicamenteux des cellules cultivées, ajoutez une solution de composé médicamenteux dans la plaque de culture cellulaire à 12 puits.

Placez le tube de quartz à double alésage dans un extracteur de micro-pipette laser et tirez une aiguille à quartz à double alésage. Comme points de départ, réglez la chaleur à 400, le filament à trois, la vitesse à 80, le retard à 150 et la traction à 250. Coupez l’embout de traction de manière à ce qu’il reste environ 5 mm de capillaire en quartz à double alésage non tiré à l’autre extrémité.

Découpez une section de 80 mm de capillaire en silice fondue comme capillaire fournissant du solvant. Insérez ensuite le capillaire dans un alésage à l’extrémité plate de l’aiguille à quartz à double alésage. En utilisant la flamme pour tirer un capillaire de silice fondue comme émetteur nanoESI, coupez à 7-10 mm de long et insérez-le dans l’autre alésage à l’extrémité plate de l’aiguille de quartz à double alésage.

Appliquez une quantité minimale de résine de durcissement UV sur l’extrémité plate de l’aiguille de quartz à double alésage. Solidifiez la résine à l’aide d’une lampe UV LED pendant environ 20 secondes, pour fixer le capillaire fournissant du solvant et l’émetteur nanoESI. Ensuite, coupez une lame de verre de microscope standard en deux dans le sens de la longueur.

Ensuite, placez la sonde unique sur une extrémité de la lame de verre, de sorte que l’émetteur nanoESI soit pointé vers l’extérieur. Appliquez l’époxy ordinaire sur le corps de la sonde unique afin qu’elle soit fixée sur la lame de verre avant de la laisser durcir toute la nuit. Ce système comprend une bride d’interface de source d’ions personnalisée du spectromètre de masse et une carte optique en aluminium fixée avec un microscope numérique USB, une platine de translation manuelle XYZ miniature et le système de platine de translation XYZ motorisée.

Modifier la bride de l’interface de la source d’ions du spectromètre de masse et fabriquer le support du stéréomicroscope numérique comme décrit dans le protocole texte. Fixez le stéréomicroscope numérique modifié, un microscope numérique USB, une platine de traduction XYZ manuelle miniature avec un support de pince flexible et le système de platine de translation XYZ motorisé à la carte optique en aluminium. Utilisez le support de pince flexible pour fixer la lame de verre fixée à l’aide d’une sonde unique.

Ensuite, fixez la configuration à sonde unique au spectromètre de masse. Ajustez le support de pince flexible, et la platine miniature XYZ, pour placer l’émetteur de la sonde unique devant l’entrée du spectromètre de masse. Décongelez la section d’échantillon à température ambiante et placez-la sur le système de platine de translation XYZ motorisé sous la sonde unique.

Ajustez la position de l’échantillon en modifiant les coordonnées dans le logiciel de contrôle. À l’aide d’une seringue, pomper le solvant d’échantillonnage à un débit approprié. Et ensuite, appliquez la tension d’ionisation.

Ajustez la hauteur de la sonde unique de sorte qu’elle repose juste au-dessus de la surface de l’échantillon et qu’elle puisse effectuer l’extraction de surface des métabolites. Soulevez délicatement la platine Z, puis utilisez le microscope numérique USB pour surveiller le changement de distance entre la pointe de la sonde unique et la surface du tissu. Définissez les paramètres de pixellisation dans la section d’intérêt de l’échantillon.

Pour les coupes de reins de souris présentées ici, utilisez une vitesse matricielle de 10 micromètres par seconde et une distance de 20 micromètres entre les lignes. Définissez les paramètres de pixellisation dans la section d’intérêt de l’échantillon. Pour les coupes de rein de souris présentées ici, utilisez une vitesse de trame de 10,0 micromètres par seconde et une distance de 20 micromètres entre les lignes.

Mettre en place une méthode d’acquisition automatisée des spectres MS à partir du spectromètre de masse. Pour une MSI à haute résolution de masse sur un échantillon de rein de souris, utilisez une résolution de masse de 60 000, un mode positif de 5 kV, 1 microbalayage, un temps d’injection maximal de 150 millisecondes et un contrôle de gain automatique activé. Lancez l’acquisition de données MSI, puis construisez des images MS à partir de fichiers MS bruts, comme décrit dans le protocole texte.

Configurez le système à sonde unique selon les instructions de MSI et ajustez le débit de solvant. Lavez les cellules cultivées fixées sur les lames de verre à microcouverture avec du PBS pour éliminer les milieux culturels et les composants extracellulaires des médicaments. Placez ensuite la lame de verre contenant la cellule sur le système de platine de translation XYZ motorisé pour l’expérience.

Focalisez le stéréomicroscope numérique au-dessus de l’échantillon, sur l’extrémité de la sonde unique pour surveiller la pénétration des cellules pendant l’analyse. Utilisez le microscope numérique USB sur le côté de la sonde unique pour surveiller les conditions de fonctionnement de l’émetteur nanoESI sur la sonde unique. Utilisez le programme de contrôle de platine XYZ motorisé et le stéréomicroscope numérique pour localiser une cellule d’intérêt et positionner avec précision la pointe de la sonde unique au-dessus de l’échantillon.

Démarrez l’acquisition de données MS avant que la pointe d’une seule sonde ne soit insérée dans la cellule. Abaissez la plaque contenant la cellule pour retirer l’extrémité de la sonde unique hors de la cellule. Enfin, laissez le solvant s’écouler pendant environ trois minutes, pour rincer complètement la sonde unique.

L’imagerie par spectrométrie de masse ambiante de coupes de rein de souris a été réalisée, et un grand nombre de molécules présentes à la surface du tissu ont pu être détectées. La distribution spatiale et l’abondance relative de plusieurs molécules à la surface du tissu ont été tracées. Une résolution spatiale de 8,5 microns a été obtenue grâce à l’observation de transitions brusques de caractéristiques présentes dans les données de spectrométrie de masse.

La fabrication de la sonde unique avec une pointe pointue et des canaux ouverts est essentielle pour l’analyse d’une seule cellule. Des microscopes sont nécessaires pour localiser les cellules cibles et surveiller le processus de pénétration des cellules. Le changement de signal à partir des spectres de masse fournit également des informations supplémentaires pour confirmer la pénétration de la cellule.

Un grand nombre de molécules ont été détectées à partir de cellules individuelles vivantes. Lorsqu’elles sont utilisées pour des études de médicaments anticancéreux, les expériences sur des cellules témoins sont utilisées pour montrer la différence du traitement médicamenteux anticancéreux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de la sonde unique et de la façon dont cet appareil est utilisé pour l’analyse par spectrométrie de masse de l’imagerie par spectrométrie de masse de cellules uniques et ambiantes de tissus biologiques.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car des instructions détaillées sont nécessaires pour fabriquer le dispositif à sonde unique, configurer l’ensemble du système et faire fonctionner les instruments. Une fois maîtrisée, l’analyse unicellulaire peut être réalisée en continu pour de nombreuses cellules. Et chaque analyse prend moins de trois minutes.

La réalisation d’une expérience d’imagerie MS à température ambiante peut prendre quelques heures, en fonction de la taille de l’échantillon, de la résolution spatiale et du spectromètre de masse utilisé. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la fabrication d’une sonde unique de haute qualité est l’étape clé. De plus, l’accord et le fonctionnement de l’instrument sont essentiels pour mener à bien une expérience.

D’autres méthodes peuvent être développées en suivant des procédures similaires à celles présentées ici. Par exemple, des réactifs peuvent être ajoutés dans le solvant de l’échantillon et une analyse réactive sur cellule unique et une MSI ambiante peuvent être effectuées pour améliorer la détection des molécules à partir des échantillons. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans l’analyse de cellules uniques et les études d’imagerie par spectrométrie de masse dans des conditions ambiantes.

Cette technique peut potentiellement être utilisée pour la recherche en biologie cellulaire, les études pharmacologiques et les tests cliniques. N’oubliez pas que travailler avec des capillaires en quartz pointus et de l’époxy durcissant aux UV peut être dangereux, et des précautions telles que le port de gants et de lunettes de sécurité UV doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.