Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l'intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

L'objectif général de cette technique d'imagerie est de surveiller les fluctuations des concentrations de calcium dans la lumière du réticulum sarcoplasmique en réponse à des agents mobilisateurs de calcium, spécifiquement dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Cette méthode peut être utile pour élucider le cycle cellulaire du calcium de manière plus directe. Par exemple, il est très important de connaître la relation entre le transport du calcium dans le réticulum sarcoplasmique et le stress du réticulum endoplasmique.

L'avantage de cette technique est que nous pouvons mesurer directement le calcium à l'intérieur de la lumière du réticulum sarcoplasmique, plutôt que d'avoir à l'extrapoler à partir de mesures indirectes des variations dans le cytoplasme. Cette technique sera démontrée par Gabriela Ziomek, étudiante diplômée dans mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez une dilution de 1 à 25 du mélange protéique dans du DMEM.

Ensuite, transférez 200 microlitres de mélange protéique DMEM dans chaque plaque de 35 millimètres à fond en verre afin de recouvrir complètement le cercle intérieur en verre. Laissez les plaques à température ambiante à l'intérieur de la hotte de sécurité pendant au moins 30 minutes. Pendant ce temps, réchauffez le DMEM contenant 10 pour cent de NCS à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Ensuite, retirez le DMEM du flacon de culture à l’aide d’une pipette en verre. Puis, rincez le fond du flacon avec du PBS stérile tiède afin d’éliminer les résidus de DMEM restants. Pour détacher les cellules musculaires lisses cultivées du fond du flacon, rincez rapidement le flacon avec un millilitre de trypsine, puis retirez-la.

Ensuite, ajoutez un autre millilitre de trypsine. Agitez le flacon pendant environ 30 à 60 secondes pour vous assurer que l'enzyme entre en contact avec toute la surface du fond du flacon avant de l'enlever. Une fois que les cellules ont été détachées par la trypsine, ajoutez du DMEM frais contenant 10 pour cent de SNC au flacon afin d'arrêter la réaction de la trypsine.

Transférez la solution cellulaire obtenue du flacon dans un tube conique de 50 millilitres propre et étiqueté. Ensuite, ajoutez un millilitre de DMEM frais contenant 10 pour cent de SNC à chaque plaque à préparer. Après cela, retournez délicatement le tube contenant la solution cellulaire plusieurs fois afin de rompre tout culot qui pourrait s'être formé.

Prélèvez au pipet le volume souhaité de solution cellulaire doucement mélangée et déposez-le dans chaque plaque. Ensuite, agitez soigneusement chaque plaque dans le sens horaire ou antihoraire afin d'assurer une répartition uniforme des cellules sur toute la surface du verre au fond de la plaque. Il est nécessaire d'ajouter suffisamment de cellules dans la plaque pour s'assurer qu'elles atteignent un taux de confluence suffisamment élevé au cours des 48 heures suivantes afin de permettre une imagerie efficace.

Après l'ajout du milieu et de la solution cellulaire dans chaque plaque, incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant au moins une heure afin de permettre aux cellules de s'attacher correctement au fond en verre. Vérifier les plaques au microscope toutes les quinze minutes jusqu'à ce que les cellules soient clairement attachées. Ensuite, récupérer l'aliquot d'Adénovirus D un SR entreposé à moins 80 degrés Celsius et le transporter vers la cabine de sécurité biologique dans un bain de glace mobile.

Prélevez à la pipette la dose souhaitée de D one SR refroidi dans chaque plaque et incubez les cellules infectées à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, renouvelez le milieu en ajoutant un millilitre de DMEM frais complété avec dix pour cent de NCS. Incubez ensuite les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Après une incubation nocturne, retirez le milieu de culture de la plaque. Lavez la plaque de culture trois fois avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS chaud. Ensuite, ajoutez immédiatement un millilitre de tampon HEPES-PSS chaud et frais avant l'enregistrement.

Effectuez l'imagerie initiale à l'aide de l'application FRET SE en ouvrant le logiciel associé au microscope confocal. Une fois l'application ouverte, cliquez sur l'onglet configuration pour ajuster les paramètres expérimentaux souhaités. Modifiez manuellement les paramètres des canaux afin d'exciter les cellules successivement à 440 nanomètres pour le donneur et le FRET et à 513 nanomètres pour l'accepteur.

Ensuite, régler les longueurs d'onde d'émission à 488 nanomètres pour le donneur et à 535 nanomètres pour le transfert d'énergie par résonance (FRET) et l'accepteur. Puis régler l'intensité lumineuse à 15 pour cent de transmission avec un temps d'exposition d'excitation de 150 millisecondes pour les cellules et des intervalles de 10 secondes entre les expositions. Ensuite, stabiliser la plaque sur la platine du microscope.

Utilisez le bouton direct pour vérifier la résolution de l'image. Ajustez davantage les paramètres pour obtenir la résolution souhaitée. Sous l'onglet configuration, prenez une image de l'échantillon à l'aide du bouton capturer l'image.

Passons maintenant à l'onglet d'évaluation et choisissons la méthode appropriée pour calculer les rendements de FRET pour les expériences en cours de réalisation. La méthode trois, qui utilise un calcul rapportmétrique, est recommandée pour les expériences impliquant des Cameleons, comme l'indicateur D un SR. Ensuite, passons à l'onglet graphique afin d'observer les valeurs d'intensité enregistrées sous forme de graphique.

Si désiré, dessinez une région d'intérêt (ROI) dans le visualiseur d'image pour observer l'intensité moyenne correspondante de cette zone sur le graphique. Commencez l'enregistrement pour collecter les données pendant au moins trois minutes afin de garantir un signal de base stable avant d'ajouter l'agent d'intérêt. Ensuite, introduisez un agent mobilisant le calcium comme outil pour épuiser le calcium du réticulum sarcoplasmique en l'appliquant directement dans la plaque près de la région d'intérêt en cours d'enregistrement.

Poursuivre l’enregistrement pendant la durée souhaitée après le traitement. Ensuite, acquérir les images sérielles ratiométriques de FRET à l’aide d’un microscope confocal inversé en utilisant l’application FRET SE. Dans cette étape, pour préparer les plaques de culture de cellules musculaires lisses aortiques de rat, laver la plaque de culture trois fois avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS tiède.

Ensuite, mélanger l'indicateur avec un millilitre de HEPES-PSS tiède et l'ajouter sur les plaques de culture. Incuber les cellules musculaires lisses avec l'indicateur pendant une heure à température ambiante. Après une heure, retirer l'indicateur de la plaque de culture et rincer avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS tiède, trois fois.

Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon HEPES-PSS frais et tiède immédiatement avant l'enregistrement. Capturez des images en série à l'aide du microscope confocal inversé. Introduisez ensuite l'agent de déplacement du calcium comme outil permettant de vider le calcium du réticulum sarcoplasmique et poursuivez l'enregistrement pendant la durée souhaitée après le traitement.

On voit ici des images représentatives d'une cellule musculaire lisse transfectée avec l'indicateur D one SR, obtenues à l'aide de filtres passe-bande pour le CFP, la FRET et le YFP. Cette figure montre des images en fausses couleurs en temps réel de cellules musculaires lisses aortiques de rat en culture, transfectées avec D one SR. Le traitement par deux micromoles de thapsigargine a entraîné une diminution de l'intensité du signal, indiquant une baisse importante de la teneur en calcium du réticulum sarcoplasmique due à la libération de calcium induite par la thapsigargine. Et ce graphique présente l'enregistrement représentatif du rapport D one SR normalisé dans les cellules musculaires lisses en culture traitées par deux micromoles de thapsigargine, confirmant une diminution significative du calcium du réticulum sarcoplasmique.

Voici des images représentatives de cellules musculaires lisses aortiques de rat en culture, chargées avec un indicateur cytoplasmique de calcium et traitées avec deux micromoles de thapsigargine. Comme indiqué, la thapsigargine provoque une augmentation significative de l'intensité du signal dans le cytoplasme en raison de la libération de calcium du réticulum sarcoplasmique. Ce graphique montre un tracé représentatif du rapport normalisé de Fluo quatre AM dans les cellules musculaires lisses en culture traitées avec deux micromoles de thapsigargine. L'augmentation du signal en calcium illustrée est considérée comme proportionnelle à la quantité de calcium libérée à partir du réticulum sarcoplasmique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 48 heures du début à la fin, si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir les cellules dans les conditions décrites afin d'assurer leur bon état avant la transfection avec l'indicateur calcique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la préparation des cellules en culture permettant la mesure des concentrations de calcium dans la lumière du réticulum sarcoplasmique à l'aide de l'indicateur D one SR.