Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l'intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

L’objectif global de cette technique d’imagerie est de surveiller les fluctuations des taux de calcium de la RS lumenale en réponse aux agents mobilisateurs du calcium, en particulier dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Cette méthode peut être utile pour élucider le cycle cellulaire du calcium de manière plus directe. Par exemple, il est très important de connaître la relation entre notre transport de calcium dans le réticulum sarcoplasmique et le stress du RE.

L’avantage de cette technique est que nous pouvons mesurer directement le calcium à l’intérieur de la lumière du réticulum sarcoplasmique plutôt que d’avoir à l’extrapoler à partir de mesures indirectes des changements dans le cytoplasme. Gabriela Ziomek, étudiante diplômée dans mon laboratoire, fera la démonstration de cette technique. Pour commencer cette procédure, préparez une dilution de un à 25 du mélange de protéines dans du DMEM.

Ensuite, transférez 200 microlitres de mélange de protéines DMEM dans chaque plaque à fond de verre de 35 milles pour couvrir entièrement le cercle de verre intérieur inférieur. Laissez les plaques à température ambiante à l’intérieur de l’enceinte de sécurité pendant au moins 30 minutes. En attendant, réchauffez le DMEM avec 10 % de NCS à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Ensuite, retirez le DMEM du ballon de culture à l’aide d’une pipette en verre. Par la suite, laver le fond du ballon avec du PBS stérile chaud pour éliminer les résidus de DMEM restants. Pour déloger les cellules musculaires lisses cultivées du fond du ballon, lavez rapidement le ballon avec un millilitre de trypsine et retirez-le.

Ajoutez ensuite un autre millilitre de trypsine. Agitez le ballon pendant environ 30 à 60 secondes pour vous assurer que l’enzyme entre en contact avec tout le fond du ballon avant de le retirer. Une fois que les cellules ont été délogées avec de la trypsine, ajoutez du DMEM frais avec 10 % de NCS dans le ballon pour arrêter la réaction de la trypsine.

Transférez la solution cellulaire résultante du ballon dans un tube conique de 50 millilitres étiqueté et propre. Ajoutez ensuite un millilitre de DMEM frais plus 10 % de NCS dans chaque assiette en cours de préparation. Après cela, retournez doucement le tube contenant la solution cellulaire à plusieurs reprises pour briser toute pastille qui aurait pu se former.

Pipeter le volume souhaité de solution cellulaire délicatement mélangée dans chaque plaque. Par la suite, faites tourner chaque plaque à fond dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour assurer une répartition égale des cellules sur le verre au fond. Il est nécessaire d’ajouter suffisamment de cellules à la plaque pour s’assurer qu’elles atteignent une confluence suffisamment élevée au cours des prochaines 48 heures pour une imagerie efficace.

Après l’ajout du milieu et de la solution cellulaire à chaque plaque, incubez les plaques à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant au moins une heure pour permettre aux cellules de se fixer correctement au fond de verre. Vérifiez les plaques au microscope à quinze minutes d’intervalle jusqu’à ce que les cellules soient clairement fixées. Ensuite, récupérez l’aliquat Adenavirus D one SR de l’entrepôt à moins 80 degrés Celsius et transportez-le vers l’enceinte de sécurité biologique dans un bain de glace mobile. Après.

Pipetez la dose souhaitée de D réfrigéré un SR dans chaque plaque et incubez les cellules infectées à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplissez les cellules avec un millilitre de DMEM frais plus dix pour cent de NCS. Par la suite, incubez les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Après une nuit d’incubation, retirer le milieu de culture de la plaque. Lavez trois fois la plaque de culture avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS chaud. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon HEPES-PSS frais et chaud immédiatement avant l’enregistrement.

Effectuez une première imagerie à l’aide de l’application FRET SE en ouvrant le logiciel associé au microscope confocal. Une fois l’application ouverte, cliquez sur l’onglet de configuration pour ajuster les paramètres expérimentaux souhaités. Modifiez manuellement les paramètres du canal afin que les cellules soient excitées en séquence à 440 nanomètres pour le donneur et le FRET et à 513 nanomètres pour l’accepteur.

Réglez ensuite les longueurs d’onde d’émission à 488 nanomètres pour le donneur et à 535 nanomètres pour le FRET et l’accepteur. Par la suite, réglez l’intensité lumineuse à 15 % de transmission avec un temps d’exposition d’excitation de 150 millisecondes des cellules et des intervalles de 10 secondes entre les expositions. Ensuite, stabilisez la plaque sur la platine du microscope.

Utilisez le bouton en direct pour vérifier la résolution de l’image. Ajustez davantage les paramètres pour la résolution souhaitée. Sous l’onglet Configuration, prenez une image de l’échantillon à l’aide du bouton de capture d’image.

Passons maintenant à l’onglet d’évaluation, choisissez la méthode appropriée pour calculer l’efficacité FRET pour les expériences en cours de réalisation. La troisième méthode, qui utilise le calcul ratiométrique, est recommandée pour les expériences impliquant des caméléons, comme l’indicateur D one SR. Après cela, passez à l’onglet graphique afin d’observer les valeurs d’intensité enregistrées dans un graphique.

Si vous le souhaitez, dessinez un retour d’intérêt dans la visionneuse d’images pour observer l’intensité moyenne correspondante de cette zone d’intérêt sur le graphique. Commencez l’enregistrement pour collecter les données pendant au moins trois minutes afin d’assurer un signal de ligne de base stable avant d’introduire l’agent d’intérêt. Ensuite, introduisez un agent mobile du calcium comme outil pour épuiser le calcium SR en l’appliquant directement dans la plaque près de la région d’intérêt enregistrée.

Poursuivez l’enregistrement pendant la durée souhaitée après le traitement. Ensuite, capturez les images série FRET ratiométriques avec un microscope inversé confocal à l’aide de l’application FRET SE. Dans cette étape, pour préparer les plaques de culture de cellules musculaires lisses aortiques de rat, lavez trois fois la plaque de culture avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS chaud.

Ensuite, mélangez l’indicateur avec un millilitre de HEPES-PSS chaud et chargez-le sur les plaques de culture. Incuber les cellules musculaires lisses avec l’indicateur pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, retirez l’indicateur de la plaque de culture et lavez-le trois fois avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS chaud.

Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon HEPES-PSS frais et chaud immédiatement avant l’enregistrement. Capturez des images en série avec le microscope confocal inversé. Par la suite, introduisez l’agent mobile du calcium comme outil pour épuiser le calcium SR et continuez l’enregistrement pendant la durée souhaitée après le traitement.

Voici les instantanés représentatifs d’une cellule musculaire lisse transfectée avec l’indicateur D one SR à l’aide de filtres passe-bande CFP, FRET et YFP. Cette figure montre les instantanés en pseudo-couleur en temps réel des cellules musculaires lisses aortiques de rat cultivées transfectées avec D un SR. Le traitement avec deux micromolaires de Thapsigargin a montré une diminution de l’intensité du signal, ce qui indiquait une baisse significative de la teneur en calcium de la RS due à la libération de calcium induite par la Thapsigargin. Et ce graphique montre la trace représentative du rapport D un SR normalisé dans les cellules musculaires lisses cultivées traitées avec deux micromolaires de Thapsigargin qui ont confirmé une baisse significative du calcium SR.

Voici les instantanés représentatifs des cellules musculaires lisses aortiques de rat en culture chargées d’un indicateur de calcium cytoplasmique et traitées avec deux micromolaires de Thapsigargin. Comme indiqué, la thapsigargine provoque une augmentation significative de l’intensité du signal dans le cytoplasme en raison de la libération de calcium par le SR. Et ce graphique montre une trace représentative du rapport Fluo quatre AM normalisé dans les cellules musculaires lisses cultivées traitées avec deux micromolaires de Thapsigargin. L’augmentation du signal calcique décrite est considérée comme proportionnelle à la quantité de calcium libérée par le SR. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 48 heures du début à la fin si elle est bien faite.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder les cellules dans les conditions décrites pour assurer leur santé avant la transfection avec l’indicateur de calcium. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la façon de préparer les cellules cultivées pour permettre la mesure des niveaux de calcium LUMENAL SR à l’aide de l’indicateur D one SR.