Name: Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à lintérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez l'imagerie confocale FRET pour mesurer directement les fluctuations calciques dans le réticulum sarcoplasmique des cellules musculaires lisses vasculaires. Cette méthode améliore la précision des mesures calciques intracellulaires.

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Ce travail a été soutenu financièrement par les Instituts de recherche en santé du Canada [MOP-1112666 à CVB &amp; ME].

déclaration éthique: Toutes les expériences et les procédures ont été menées en accord avec les lignes directrices de biosécurité en laboratoire de l&#39;Université de la Colombie-Britannique, Vancouver, Canada. 1. Préparation de 35 plats Culture mm à fond de verre pour base de FRET Microscopie confocale <ol><li> Préparer des plaques en utilisant la procédure suivante 36-48 h avant les expériences. </li><li> Récupérez mélange de protéines gélatineuse choisi et 0,25% de trypsine-EDTA de -20 ° C stockage et conservez-les dans un bain de glace mobiles jusqu&#39;à utilisation. NOTE: Le mélange de protéine de revêtement ne doit être exposé à la température ambiante pendant une brève période de temps pour empêcher le mélange de se solidifier avant son utilisation. solution de trypsine devrait également être garder réfrigéré jusqu&#39;à ce que nécessaire; En variante, la trypsine peut être extraite de stockage à -20 ° C après la fin de l&#39;étape 1.5. </li><li> Préparer une dilution 1:25 du mélange de protéines: DMEM (pas de sérum ajoutée, réfrigérés). Transfert volume approprié de la protéine mélange / DMEM à chaque plaque en cours de préparation. Pour 35 plaques de verre à fond mm, ajouter environ 200 pi pour couvrir entièrement le cercle intérieur en verre sur le fond de la plaque. </li><li> Laisser les plaques reposer pendant au moins 30 min à l&#39;intérieur de l&#39;enceinte de sécurité et à la température ambiante. DMEM chaud avec 10% de NCS à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant cette période. </li><li> trypsine chaud dans un bain d&#39;eau à 37 ° C immédiatement avant les prochaines étapes. </li><li> Enlever DMEM qui est actuellement en flacon de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette de verre et d&#39;aspiration. Laver étage de la fiole avec du PBS chaud stérile pour éliminer les résidus restants DMEM. </li><li> Déloger les cellules musculaires lisses préalablement cultivées à partir du bas du ballon: REMARQUE: Fiole jour a été établie à cette étape pour permettre aux cellules d&#39;atteindre une confluence souhaitée (environ 80%) avant la préparation de la plaque. Les cellules ont été initialement mis en suspension dans le flacon dans 20 ml de DMEM avec 10% de NCS et incubées à 37 ° C avec 5% de CO 2 d&#39; alimentation pendant 24 heures, après quoi DMEM approvisionnement a été rafraîchi et les cellules ont été retournés dans l&#39;incubateur. DMEM a été rafraîchie veillery 48 heures suivant ces étapes initiales jusqu&#39;à ce que les cellules ont atteint la confluence. <ol><li> Laver rapidement flacon avec 1 ml de trypsine, puis retirez 1 ml de trypsine par aspiration. </li><li> Ajouter encore 1 ml de trypsine et laisser pendant une période plus longue (environ 30 à 60 secondes), swishing flacon pour assurer l&#39;enzyme en contact avec l&#39;ensemble du fond du flacon. </li><li> Observez combien les cellules ont détaché au microscope jusqu&#39;à ce que satisfait de la séparation du flacon. solution bruissement de trypsine Alternate et le détachement des cellules vérification jusqu&#39;à satisfaits proportion de cellules séparées du flacon. NOTE: Le flacon peut être retourné à l&#39;incubateur pendant environ 30-60 secondes pour accélérer ce processus à 37 ° C. </li><li> Une fois que les cellules ont été délogées à l&#39; aide de trypsine, ajouter DMEM frais avec 10% NCS dans le ballon pour arrêter la réaction de la trypsine (volume suffisant pour que la trypsine forme 1/8 du volume total dans la fiole). NOTE: Par exemple, lorsque vous utilisez un 250 ml flacon de culture, ce seraitsoit 7 ml de DMEM ajouté à la 1 ml de trypsine pour aboutir dans 8 ml de solution de cellules. </li></ol></li><li> Transfert solution de cellules de la fiole à un (marqués) 50 ml tube conique propre résultant. </li><li> Ajouter 1 ml de DMEM frais plus 10% NCS à chaque plaque en cours de préparation (moyenne suffisante pour durer 24 heures). </li><li> Retourner doucement le tube contenant la solution de cellules à plusieurs reprises pour briser toute pastille qui aurait pu se former. </li><li> Pipette désiré volume de solution cellulaire doucement mélangé dans chaque plaque. REMARQUE: Le numéro CML recommandé plaqué pour ce protocole est de 0,5-0,8 x 10 6 par 35 boîtes de culture de mm. Ces chiffres peuvent varier en fonction du type de cellule et doivent être testés et modifiés par chaque laboratoire. </li><li> Agiter chaque plaque à fond dans le sens horaire / anti-horaire pour assurer une répartition égale des cellules à travers à fond de verre. </li></ol> 2. Transfection transitoire avec vecteur adénoviral de transport Indicateur de D1SR Ca <ol><li> Après addition de moidium et solution de cellules à chaque plaque, laisser les plaques à incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 d&#39; alimentation pendant au moins 1 heure pour permettre aux cellules de se fixer correctement au verre sur le fond des plats. Vérifiez les plaques au microscope à intervalles de 15 minutes jusqu&#39;à ce que les cellules sont clairement fixés. </li><li> Récupérer adénovirus-D1SR aliquote de -80 ° C stockage et maintenir dans un bain de glace mobile pour transporter au cabinet de sécurité biologique. </li><li> dose souhaitée pipette (multiplicité d&#39;infection de 100) D1SR refroidie à chaque plaque. NOTE: Le calcul du volume de solution adénoviral nécessaire par plaque dépend du titre du virus dans la solution mère d&#39;origine, qui est présenté comme l&#39;unité de formation de plaques (PFU). Sur la base de notre expérience, nous recommandons une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 100, ce qui est interprété comme le nombre ou particules virales nécessaires pour infecter une cellule de muscle lisse (SMC) dans la plaque de culture. </li><li> Incuber les cellules infectées à 37 ° C avec 5% de CO 2 d&#39; alimentation O / N. </li><li> Le lendemain, reconstituer les cellules avec 1 ml de DMEM frais plus 10% NCS. </li><li> Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 ° C dans 5% de CO 2 O / N. </li></ol> 3. Mesure de la SR Luminal Ca 2+ Utilisation basée FRET-imagerie confocale <ol><li> Après O / N incubation, éliminer le milieu de culture de la plaque. </li><li> Laver la plaque de culture avec 1 ml de tampon chaud physiologiques HEPES-PSS contenant (en mmol·L - 1) NaCl 140, glucose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl2 1,5 et MgCl2 1 (pH 7,4) à trois reprises. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon chaud frais HEPES-PSS juste avant le début de l&#39;enregistrement. </li><li> Effectuer l&#39;imagerie initiale à l&#39;aide de l&#39;application FRET SE (Sensitized Emission) (ou une fonction similaire) sur le logiciel associé au microscope confocal. <ol><li> Une fois que l&#39;application est ouverte, cliquez sur l&#39;onglet &quot;Configuration&quot; pour régler les paramètres pour obtenir des conditions expérimentales souhaitées. </li> &lt;li&gt; modifier manuellement les paramètres de canal de sorte que les cellules sont excités en séquence à 440 nm (pour le donneur et FRET canaux) et 513 nm (pour le canal accepteur). Collecter les longueurs d&#39;onde d&#39;émission à 488 nm (pour donneur) et 535 nm (pour FRET et accepteur). </li><li> Réglez l&#39;intensité de la lumière à l&#39;émission de 15%, avec 150 ms excitation temps d&#39;exposition des cellules (temps d&#39;enregistrement pour trois séquentiel donneur CFP, FRET et canaux accepteur YFP) et 10 seconde d&#39;intervalle entre les expositions. </li></ol></li><li> Stabiliser plaque sur la platine du microscope. </li><li> Utilisez le bouton &quot;Live&quot; pour vérifier la résolution d&#39;image. Tweak paramètres encore jusqu&#39;à la résolution souhaitée est atteinte. </li><li> Toujours sous l&#39;onglet &quot;Configuration&quot;, prendre une image de l&#39;échantillon en utilisant le bouton &quot;Capture d&#39;image&quot;. </li><li> Passons à l&#39;onglet &quot;Evaluation&quot;, choisissez la méthode appropriée pour calculer l&#39;efficacité de FRET pour les expériences étant effectuées. Méthode 3, en utilisant le calcul Ratiométrique [E A (i) = B / A], Est recommandé pour les expériences impliquant des caméléons tels que l&#39;indicateur de D1SR. </li><li> Commutation sur l&#39;onglet &quot;Graph&quot; pour être en mesure d&#39;observer les valeurs d&#39;intensité enregistrées sous forme de graphique pendant l&#39;expérience. </li><li> Dessinez un retour sur investissement dans la visionneuse d&#39;image pour observer l&#39;intensité moyenne correspondante de cette zone d&#39;intérêt sur le graphique que l&#39;expérience produit. NOTE: enquêteur peut également choisir de dessiner plusieurs ROIs et ont correspondant intensités enregistrées et affichées simultanément sur le graphique. Alternativement, les enquêteurs peuvent présenter un seul retour sur investissement pour l&#39;enregistrement initial, et passez à décrire plusieurs ROIs à un moment plus tard, en ouvrant le fichier d&#39;expérience sur une version de données orientée analyse-du logiciel. NOTE: De plus amples détails sur les étapes nécessaires pour mettre en place des expériences à base de FRET peut être trouvée dans FRET manuels de l&#39;assistant d&#39;application. Si le microscope est pas équipé de l&#39;Assistant FRET, le protocole suivant peut être utilisé pour configurer les paramètres pourl&#39;enregistrement manuellement. </li><li> Commencer l&#39;enregistrement et de permettre la collecte de données pendant au moins 3 min pour assurer un enregistrement basale stable du signal avant l&#39;introduction de l&#39;agent d&#39;intérêt. </li><li> Introduire Ca 2+ agent de -moving (par exemple 2 uM thapsigargine; 100 nm endothéline-1) comme un outil d&#39;appauvrissement SR Ca 2+, par pipetage manuellement la dose prédéterminée directement dans la plaque à un endroit aussi près de la région d&#39;intérêt étant enregistré que possible. Continuer l&#39;enregistrement pour un traitement désiré de poste de temps. </li><li> Capture des images ratiométrique FRET série (512 x 512 pixels) avec un objectif à immersion dans l&#39;huile 63X du microscope confocal inversé en utilisant l&#39;application de FRET SE. </li><li> Recueillir des données résultant de l&#39;imagerie à partir d&#39;un groupe de 5-10 CML dans chaque région d&#39;intérêt (ROI) et ensuite formater et analyser l&#39;utilisation de logiciels à base de statistiques. <ol><li> Pour enregistrer des données pour une utilisation ultérieure, cliquez-droit sur la trace enregistrée et choisissez l&#39;option &quot;Exporter&quot; pour save la feuille de calcul avec enregistrées intensités de signal moyennes sur le lecteur choisi de l&#39;enquêteur. </li><li> Normaliser les données de chaque expérience individuelle en divisant chaque point de données par la valeur d&#39;intensité à partir observé au point 0 sec de temps. </li><li> Importer des données normalisées à partir des feuilles de calcul dans un fichier de projet de programme statistique en copiant et collant les lignes de données pertinentes à partir de leur origine feuille de calcul / sec manuellement. </li><li> Générer automatiquement des graphiques correspondant aux ensembles de données collées dans le programme. REMARQUE: les paramètres par défaut du programme génèrent des graphiques linéaires à partir des données importées. Type de graphique affiché peut être modifié en cliquant sur le bouton &quot;Choisir un type de graphique différent» dans le cadre du &quot;changement&quot; cap trouvés dans la barre d&#39;outils principale. </li><li> données Pool représentant plusieurs essais indépendants au sein d&#39;un groupe plus large d&#39;expériences identiques dans une seule fiche de données pour produire une trace moyenne pour le test spécifique effectué. </li></ol></li></ol&gt; 4. Préparation de l&#39;indicateur de Ca2 + cytoplasmique <ol><li> Dissoudre 0,0125 g Pluronic acide (PA) dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tube de microcentrifugeuse noir (peut avoir pour réchauffer le tube dans un bain d&#39;eau mobile pour aider à dissoudre PA). </li><li> Extraire un tube (50 ug) du Ca2 + cytoplasmique colorant indicateur (Fluo-4 AM) de stockage de -20 ° C. </li><li> Envelopper le tube dans une feuille de colorant pour le protéger autant que possible de tout contact avec la lumière. </li><li> Introduire à la pipette 45 ul de la solution dans le DMSO + PA dans le tube contenant le colorant. Enveloppez solution DMSO + PA dans du papier et conserver à la température ambiante. </li><li> Mélanger le contenu du tube à fond en pipetant une solution de haut en bas plusieurs fois. Alternativement, sonication le tube de teinture pendant 10 min. NOTE: Toute méthode de distribution soigneusement le colorant dans la solution DMSO + PA sera suffisant; il est simplement une question de préférence de l&#39;investigateur. Si l&#39;enquêteur choisit de sonication solution, ildevrait être fait dans une zone / pièce isolée où les autres ne seront pas affectés par le bruit. Enquêteur devrait également utiliser des silencieux lourds pour protéger les oreilles. <ol><li> Si la solution sonication, insérer le tube de papier d&#39;aluminium enveloppé contenant le colorant dans un support de tube de mousse et place à l&#39; intérieur du plein (avec dH 2 O) bain sonicateur 2/3. </li><li> Lieu bain sonicateur en région isolée / chambre et machine de mise sous tension (assurer un casque protecteur est en place avant de commencer processus de sonication). Laissez de la place et de laisser la machine en cours d&#39;exécution pendant 10 minutes avant de l&#39;arrêter et de récupérer le tube (garder enveloppé dans du papier pour protéger de la lumière aussi longtemps que possible). </li></ol></li><li> Aliquoter la solution maintenant complètement mélangé dans des tubes de microcentrifugation sombres (5 pi par tube, devrait être en mesure de faire 10 tubes total). </li><li> Enveloppez chaque tube aliquote dans du papier. tubes d&#39;étiquetage et de stocker dans déshydratant à -20 conditions ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 5. Mesure de cytoplasmique Ca 2+ <ol><li> Suivez les étapes à 01/01 au 01/12 pour préparer des plaques de culture de CML aortiques de rat. </li><li> Retirez le milieu de culture de la plaque au niveau post culture de 48 h. </li><li> Retirer la aliquote préalablement préparée de Ca2 + cytoplasmique indicateur (5 pi) de -20 ° C et maintenir le stockage dans un bain de glace mobiles jusqu&#39;à leur utilisation. </li><li> Laver la plaque de culture avec 1 ml de tampon chaud physiologiques HEPES-PSS contenant (en mmol·L - 1) NaCl 140, glucose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl2 1,5 et MgCl2 1 (pH 7,4) à trois reprises. </li><li> Mélanger l&#39;indicateur avec 1 ml de chaud HEPES-PSS et le charger sur la plaque de culture. </li><li> Incuber CML avec l&#39;indicateur pendant 1 heure à température ambiante (24 ° C). </li><li> Retirer l&#39;indicateur de la plaque de culture et laver avec 1 ml chauds physiologiques HEPES-PSS tampon trois fois. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon chaud frais HEPES-PSS juste avant le début de l&#39;enregistrement. </li><li> Capture d&#39;images de série (512 x 512 pixels) avec un o 63Xobjectif il-immersion du confocal microscope inversé. <ol><li> Modifier manuellement les paramètres de sorte que les cellules sont excités à 488 nm, et les longueurs d&#39;onde d&#39;émission sont recueillies à 555 nm avec une vitesse de 700 Hz de balayage. </li><li> Réglez l&#39;intensité de la lumière à l&#39;émission de 15%, avec 150 msec temps d&#39;exposition d&#39;excitation des cellules (la quantité de temps que les cellules sont exposées à la lumière à des intervalles de temps désignés pendant l&#39;enregistrement) et intervalles de 5 secondes entre les expositions. </li></ol></li><li> Stabiliser plaque sur la platine du microscope et de commencer l&#39;enregistrement. </li><li> Enregistrez pendant au moins 3 min pour assurer un enregistrement basale stable du signal avant l&#39;introduction de l&#39;agent d&#39;intérêt. </li><li> Introduire Ca 2+ agent de -moving (par exemple 2 uM thapsigargine) comme un outil d&#39;appauvrissement SR Ca 2+ (comme décrit à l&#39; étape 3.16) et continuer à enregistrer pour la quantité désirée de post - traitement de temps. </li><li> Enregistrez l&#39;intensité du signal en utilisant un logiciel spécifique au microscope par fluorescence moyenne signaux (F / F 0) à partir d&#39; un groupe de 5-10 CML dans chaque région d&#39;intérêt (ROI). Collecter, le format, et analyser les données résultant de l&#39;imagerie en utilisant un logiciel d&#39;analyse de données. Voir les étapes 3.18.1-3.18.5 pour la description de la collecte de données et d&#39;analyse à l&#39;aide de ce logiciel. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce protocole décrit la transfection de CMLV avec l&#39;adénovirus D1SR pour étudier les concentrations de Ca2 + dans la lumière du SR. Cette méthode permet la mesure directe de Ca2 + à l&#39;intérieur de cet organite, ainsi que son mouvement vers / hors de la RS à la suite de l&#39;application de différents agents de calcium en mouvement. Cette méthode présente de nombreux avantages pour les chercheurs qui travaillent à une compréhension globale de la façon dont les changements à SR et cytoplasmiqu...

Ca 2+ est un ion très important qu&#39;on trouve en abondance au sein de chaque cellule dans le corps. Il a un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires différentes, y compris la croissance, la prolifération, la migration et l&#39; apoptose 1-4. Il est bien établi que le Ca 2+ peut affecter ces processus à travers les deux actions directes et indirectes, et par conséquent, les modifications des concentrations intracellulaires normales de cet ion peut facilement aboutir à des résultats négatifs pour les cellules affectées. Le SR est considéré comme la plus grande concentration intracellulaire de Ca 2+ magasin dans la cellule 5. Les niveaux de l&#39; état ​​d&#39; équilibre de Ca 2+ tant dans le SR et le cytoplasme sont normalement maintenus grâce à un flux constant dans et hors des canaux Ca 2+ -transporting de cet organite. Les conditions stressantes imposées sur les cellules en raison de toute forme de blessure ou de maladie sont généralement associées à des changements significatifs dans SR Ca 2+ qui vont sur ​​d&#39;avoir des effets à long terme sur l&#39;ilalth de la cellule. Dans la plus grave des cas, l&#39;incapacité d&#39;une cellule souligné de récupérer et de maintenir l&#39; état ​​d&#39; équilibre SR Ca 2+ niveaux peuvent même aboutir à la mort par apoptose 6-8. Les recherches actuelles sur cellulaires Ca 2+ dynamique est limitée par le fait que quelques tests d&#39;études organite le contenu de la mémoire de Ca directement 9-11. La pratique la plus courante consiste à la place de la mesure cytoplasmiques Ca2 niveaux comme des mesures indirectes des changements dans SR Ca 2+ contenu 12-14. Dans ces expériences, le Ca 2+ est généralement amené à être libéré du SR grâce à l&#39;utilisation d&#39;agents pharmacologiques provoquant la diminution de l&#39;organelle (par exemple , la thapsigargine). Les conclusions sont ensuite tirées à l&#39; égard des modifications apportées à SR Ca 2+ basé sur les fluctuations des cytoplasmiques Ca2 concentrations. Malgré la capacité restante pour les enquêteurs de tirer de telles conclusions dans un rond-point manner, cette méthode de mesure de SR Ca est clairement un moyen indirect de glaner ces informations, avec de nombreuses limitations concernant l&#39;interprétation des données recueillies. Afin de contourner cette restriction claire, il est nécessaire de mesurer la quantité de Ca 2+ trouvé directement dans le réseau luminal SR. Vital pour le résultat final d&#39;être en mesure d&#39;enregistrer directement intraluminaux SR Ca 2+ niveaux sont les outils de culture cellulaire et l&#39;indicateur Ca 2+ utilisé. Pour les données référencées dans le manuscrit en cours, il est important de noter que les CMLV utilisées provenaient d&#39;une lignée de cellules congelées. Les cellules ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum de veau nouveau - né (NCS) au- dessus des passages 22-26 pour les expériences décrites, mises en incubation à une température constante de 37 ° C avec 5% de CO 2 d&#39; alimentation. En utilisant la méthode courante, par exemple, les cellules ont été cultivées avec succès sur un mélange de protéines extracellulaires qui simule lal&#39; environnement d&#39; un grand nombre de différents types de tissus 15. Important pour le succès le long de la veine de SR Ca2 + recherche est le type de mélange de protéines utilisé; dans ce cas, une faible variété de facteur de croissance est nécessaire pour éviter que des composants de cet outil d&#39;affecter la signalisation régulière Ca 2+ et les mouvements se produisant constamment dans les cellules testées. Après une croissance réussie de cellules de test, l&#39;indicateur de Ca2 + doit également être efficacement introduit dans ces cellules en culture. Ceci est devenu possible grâce à l&#39; utilisation d&#39; un vecteur adenoviral qui porte le SR-résident Ca2 + indicateur D1SR. Pour parvenir à une haute efficacité de transfection, les cellules doivent être mises en incubation avec des vecteurs viraux pendant au moins 36 à 48 heures avant l&#39;imagerie. Cette préparation fournit un outil fiable pour mesurer Ca 2 + transitoires dans la lumière SR avec une grande précision et la reproductibilité. Indicateur D1SR utilisé dans ce protocole est une variante modifiée du D1ER Ca 2+ indicateur qui a été créé à l&#39; origine par le laboratoire du Dr Roger Tsien à l&#39;Université de Californie, San Diego, Etats - Unis 9,16. La D1ER originale appartient à une deuxième génération de génétiquement codés Ca 2+ indicateurs appelés caméléons qui affichent Ca de sensibilités sur une gamme beaucoup plus large (0,5 à 160 uM) par rapport aux précédentes Ca 2+ indicateurs 9,16. La nouvelle variante D1SR, un cadeau genre du Dr Wayne Chen (Université de l&#39;Alberta, Canada), cependant, porte une séquence de calséquestrine mutant (au lieu d&#39;une séquence de calréticuline comme dans le D1ER original). Le calséquestrine mutant a une liaison réduite à Ca 2+ qui élimine la question de la concurrence avec calséquestrine endogène dans la liaison à Ca 2+ dans le SR lumen 11. L&#39;indicateur de D1SR porte une cyan améliorée tronquée protéine fluorescente (PCP) et de la protéine fluorescente jaune (YFP) qui se lient par une protéine de liaison contenant la calmoduline modifiée (CaM) et M13 (til peptide 26-résidu de la myosine chaîne légère kinase qui se lie à CaM) séquences. La séquence CaM-M13 a été modifiée pour empêcher M13 de se lier à la calmoduline endogène. En outre, pour assurer une rétention SR, une séquence calséquestrine a été ajoutée à l&#39;extrémité 5 &#39;de la PCP 11. Lorsqu&#39;il est lié à Ca 2+, le domaine CaM-M13 passe par des changements conformationnels qui se traduisent par une augmentation du transfert d&#39;énergie entre la PCP et d&#39; accompagnement YFP, qui est enregistré comme une augmentation de l&#39;intensité du signal FRET. D&#39;autre part, lorsque la concentration de SR luminal Ca 2+ gouttes, le domaine CaM-M13 passe par des changements conformationnels inverse, ce qui entraîne une diminution du transfert d&#39;énergie entre la PCP et d&#39; accompagnement YFP, et une baisse significative de FRET intensité du signal .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (teneur élevée en glucose, pyruvate)</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Matrigel Membrane basale Matrice Facteur de croissance réduit, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Maintenir à -20 &deg ; C jusqu’à juste avant l’utilisation</td></tr><tr><td>Sérum de veau nouveau-né</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Maintenir à -20 &deg ; C jusqu’à juste avant l’utilisation</td></tr><tr><td>Plaques à fond de verre de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 &mu ; M vented blue plug seal cap flask</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Life technologies</td><td>25200056</td><td>Maintenir à -20 &deg ; C jusqu’à la bonne avant utilisation</td></tr><tr><td>50 ml Polypropylène Tube Conique</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gift</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>Conserver à -20 &deg ; C jusqu’à juste avant l’utilisation</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes microcentrifuges noirs</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (avec application FRET SE Wizard)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie confocale à base de fret mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de cultured cellules musculaires lisses utilisation

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Le maintien des taux de calcium à l’état d’équilibre (Ca2+) dans le réticulum sarcoplasmique (SR) des cellules musculaires lisses vasculaires (CMV) est vital pour leur santé globale. Une partie importante du contenu intracellulaire en Ca2+ se trouve dans les réserves de SR dans les VSMC. En tant que seul organite intracellulaire étroitement associé à l’espace extracellulaire environnant par le biais des jonctions membrane plasmique-RS, le RS peut être considéré comme constituant la première ligne de réponse à toute irrégularité des transitoires Ca2+, ou au stress subi par la cellule. Parmi ses nombreuses fonctions, l’une des plus importantes est son rôle dans la transmission de signaux régulés par le Ca2+ dans toute la cellule pour induire d’autres réactions à l’échelle de la cellule en aval. L’utilisation plus courante des indicateurs cytoplasmiques Ca2+ à cet égard est globalement insuffisante pour la recherche sur les changements hautement dynamiques de la réserve intraluminale de Ca2+ SR qui n’ont pas encore été entièrement caractérisés. Nous vous proposons ici un protocole détaillé pour la mesure directe et claire de la SR Ca2+ luminale. Cet outil est utile pour l’étude des changements nuancés de la RS Ca2+ qui ont des effets ultérieurs significatifs sur le fonctionnement normal et la santé de la cellule. Les fluctuations de la teneur en SRCa 2+ peuvent nous fournir une quantité importante d’informations relatives aux réponses cellulaires aux maladies ou aux conditions de stress ressenties par la cellule. Dans cette méthode, une version modifiée d’un indicateur Ca2+ ciblé par la RS, D1SR, est utilisée pour détecter les fluctuations de Ca2+ en réponse à l’introduction d’agents dans des cellules musculaires lisses aortiques (CMS) de rat en culture. Après l’incubation avec l’indicateur D1SR, la microscopie confocale à fluorescence et l’imagerie basée sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) sont utilisées pour observer directement les changements des niveaux de Ca2+ SR intraluminal dans des conditions de contrôle et avec l’ajout d’agents agonistes qui fonctionnent pour induire le mouvement intracellulaire de Ca2+.

Cette section fournit des exemples des résultats qui peuvent être obtenus en utilisant la méthode décrite pour capturer SR luminal Ca2 données de concentration, par rapport à la manière couramment employée de mesurer indirectement les changements à organites les concentrations de magasin de Ca en observant les fluctuations cytoplasmique Ca 2+ . La figure 1A montre un instantané...

Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

L'objectif général de cette technique d'imagerie est de surveiller les fluctuations des concentrations de calcium dans la lumière du réticulum sarcoplasmique en réponse à des agents mobilisateurs de calcium, spécifiquement dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Cette méthode peut être utile pour élucider le cycle cellulaire du calcium de manière plus directe. Par exemple, il est très important de connaître la relation entre le transport du calcium dans le réticulum sarcoplasmique et le stress du réticulum endoplasmique.L'avantage de cette technique est que nous pouvons mesurer directement le calcium à l'intérieur de la lumière du réticulum sarcoplasmique, plutôt que d'avoir à l'extrapoler à partir de mesures indirectes des variations dans le cytoplasme. Cette technique sera démontrée par Gabriela Ziomek, étudiante diplômée dans mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez une dilution de 1 à 25 du mélange protéique dans du DMEM.Ensuite, transférez 200 microlitres de mélange protéique DMEM dans chaque plaque de 35 millimètres à fond en verre afin de recouvrir complètement le cercle intérieur en verre. Laissez les plaques à température ambiante à l'intérieur de la hotte de sécurité pendant au moins 30 minutes. Pendant ce temps, réchauffez le DMEM contenant 10 pour cent de NCS à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.Ensuite, retirez le DMEM du flacon de culture à l’aide d’une pipette en verre. Puis, rincez le fond du flacon avec du PBS stérile tiède afin d’éliminer les résidus de DMEM restants. Pour détacher les cellules musculaires lisses cultivées du fond du flacon, rincez rapidement le flacon avec un millilitre de trypsine, puis retirez-la.Ensuite, ajoutez un autre millilitre de trypsine. Agitez le flacon pendant environ 30 à 60 secondes pour vous assurer que l'enzyme entre en contact avec toute la surface du fond du flacon avant de l'enlever. Une fois que les cellules ont été détachées par la trypsine, ajoutez du DMEM frais contenant 10 pour cent de SNC au flacon afin d'arrêter la réaction de la trypsine.Transférez la solution cellulaire obtenue du flacon dans un tube conique de 50 millilitres propre et étiqueté. Ensuite, ajoutez un millilitre de DMEM frais contenant 10 pour cent de SNC à chaque plaque à préparer. Après cela, retournez délicatement le tube contenant la solution cellulaire plusieurs fois afin de rompre tout culot qui pourrait s'être formé.Prélèvez au pipet le volume souhaité de solution cellulaire doucement mélangée et déposez-le dans chaque plaque. Ensuite, agitez soigneusement chaque plaque dans le sens horaire ou antihoraire afin d'assurer une répartition uniforme des cellules sur toute la surface du verre au fond de la plaque. Il est nécessaire d'ajouter suffisamment de cellules dans la plaque pour s'assurer qu'elles atteignent un taux de confluence suffisamment élevé au cours des 48 heures suivantes afin de permettre une imagerie efficace.Après l'ajout du milieu et de la solution cellulaire dans chaque plaque, incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant au moins une heure afin de permettre aux cellules de s'attacher correctement au fond en verre. Vérifier les plaques au microscope toutes les quinze minutes jusqu'à ce que les cellules soient clairement attachées. Ensuite, récupérer l'aliquot d'Adénovirus D un SR entreposé à moins 80 degrés Celsius et le transporter vers la cabine de sécurité biologique dans un bain de glace mobile.Prélevez à la pipette la dose souhaitée de D one SR refroidi dans chaque plaque et incubez les cellules infectées à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, renouvelez le milieu en ajoutant un millilitre de DMEM frais complété avec dix pour cent de NCS. Incubez ensuite les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant la nuit.Après une incubation nocturne, retirez le milieu de culture de la plaque. Lavez la plaque de culture trois fois avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS chaud. Ensuite, ajoutez immédiatement un millilitre de tampon HEPES-PSS chaud et frais avant l'enregistrement.Effectuez l'imagerie initiale à l'aide de l'application FRET SE en ouvrant le logiciel associé au microscope confocal. Une fois l'application ouverte, cliquez sur l'onglet configuration pour ajuster les paramètres expérimentaux souhaités. Modifiez manuellement les paramètres des canaux afin d'exciter les cellules successivement à 440 nanomètres pour le donneur et le FRET et à 513 nanomètres pour l'accepteur.Ensuite, régler les longueurs d'onde d'émission à 488 nanomètres pour le donneur et à 535 nanomètres pour le transfert d'énergie par résonance (FRET) et l'accepteur. Puis régler l'intensité lumineuse à 15 pour cent de transmission avec un temps d'exposition d'excitation de 150 millisecondes pour les cellules et des intervalles de 10 secondes entre les expositions. Ensuite, stabiliser la plaque sur la platine du microscope.Utilisez le bouton direct pour vérifier la résolution de l'image. Ajustez davantage les paramètres pour obtenir la résolution souhaitée. Sous l'onglet configuration, prenez une image de l'échantillon à l'aide du bouton capturer l'image.Passons maintenant à l'onglet d'évaluation et choisissons la méthode appropriée pour calculer les rendements de FRET pour les expériences en cours de réalisation. La méthode trois, qui utilise un calcul rapportmétrique, est recommandée pour les expériences impliquant des Cameleons, comme l'indicateur D un SR. Ensuite, passons à l'onglet graphique afin d'observer les valeurs d'intensité enregistrées sous forme de graphique.Si désiré, dessinez une région d'intérêt (ROI) dans le visualiseur d'image pour observer l'intensité moyenne correspondante de cette zone sur le graphique. Commencez l'enregistrement pour collecter les données pendant au moins trois minutes afin de garantir un signal de base stable avant d'ajouter l'agent d'intérêt. Ensuite, introduisez un agent mobilisant le calcium comme outil pour épuiser le calcium du réticulum sarcoplasmique en l'appliquant directement dans la plaque près de la région d'intérêt en cours d'enregistrement.Poursuivre l’enregistrement pendant la durée souhaitée après le traitement. Ensuite, acquérir les images sérielles ratiométriques de FRET à l’aide d’un microscope confocal inversé en utilisant l’application FRET SE. Dans cette étape, pour préparer les plaques de culture de cellules musculaires lisses aortiques de rat, laver la plaque de culture trois fois avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS tiède.Ensuite, mélanger l'indicateur avec un millilitre de HEPES-PSS tiède et l'ajouter sur les plaques de culture. Incuber les cellules musculaires lisses avec l'indicateur pendant une heure à température ambiante. Après une heure, retirer l'indicateur de la plaque de culture et rincer avec un millilitre de tampon physiologique HEPES-PSS tiède, trois fois.Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon HEPES-PSS frais et tiède immédiatement avant l'enregistrement. Capturez des images en série à l'aide du microscope confocal inversé. Introduisez ensuite l'agent de déplacement du calcium comme outil permettant de vider le calcium du réticulum sarcoplasmique et poursuivez l'enregistrement pendant la durée souhaitée après le traitement.On voit ici des images représentatives d'une cellule musculaire lisse transfectée avec l'indicateur D one SR, obtenues à l'aide de filtres passe-bande pour le CFP, la FRET et le YFP. Cette figure montre des images en fausses couleurs en temps réel de cellules musculaires lisses aortiques de rat en culture, transfectées avec D one SR. Le traitement par deux micromoles de thapsigargine a entraîné une diminution de l'intensité du signal, indiquant une baisse importante de la teneur en calcium du réticulum sarcoplasmique due à la libération de calcium induite par la thapsigargine. Et ce graphique présente l'enregistrement représentatif du rapport D one SR normalisé dans les cellules musculaires lisses en culture traitées par deux micromoles de thapsigargine, confirmant une diminution significative du calcium du réticulum sarcoplasmique.Voici des images représentatives de cellules musculaires lisses aortiques de rat en culture, chargées avec un indicateur cytoplasmique de calcium et traitées avec deux micromoles de thapsigargine. Comme indiqué, la thapsigargine provoque une augmentation significative de l'intensité du signal dans le cytoplasme en raison de la libération de calcium du réticulum sarcoplasmique. Ce graphique montre un tracé représentatif du rapport normalisé de Fluo quatre AM dans les cellules musculaires lisses en culture traitées avec deux micromoles de thapsigargine. L'augmentation du signal en calcium illustrée est considérée comme proportionnelle à la quantité de calcium libérée à partir du réticulum sarcoplasmique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 48 heures du début à la fin, si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir les cellules dans les conditions décrites afin d'assurer leur bon état avant la transfection avec l'indicateur calcique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la préparation des cellules en culture permettant la mesure des concentrations de calcium dans la lumière du réticulum sarcoplasmique à l'aide de l'indicateur D one SR.

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Biology

Biologie

Signaux calciques jouent un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires, y compris l'expression des gènes, la survie et la différenciation. Ici, nous montrent comment effectuer l'imagerie calcique utilisant Fura-2 heures. Imagerie calcique est un outil précieux pour étudier la régulation du calcium intracellulaire en temps réel et de sa réglementation des cascades de signalisation.

Imagerie calcique des neurones corticaux utilisant Fura-2 heures

Détails des méthodes à haute résolution...

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Nous présentons une méthode pour isoler rapidement des événements de calcium (microseconde) à partir des flux plus lent dans les cellules vivantes en utilisant microscopie confocale à balayage laser. La méthode de mesures des fluctuations d'intensité de fluorescence des indicateurs de calcium par les analyses en ligne l'enregistrement de plusieurs centaines de pixels dans une cellule. Analyse de l'histogramme nous permet d'isoler les échelles de temps des différents flux de calcium.

Mesurer les flux de calcium dans les cardiomyocytes rapide

Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l'aide d'un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

Nous présentons ici des techniques d’imagerie des événements Ca2+ médiés par IP3 locaux à l’aide de la microscopie à fluorescence dans des cellules de mammifères intactes chargées d’indicateurs Ca2+ ainsi qu’un algorithme qui automatise l’identification et l’analyse de ces événements.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer le réticulum sarcoplasmique Ca2 + réserve et fonction de suppression de calcium diastolique dans les cardiomyocytes en un système d’imagerie de calcium.

Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Nous présentons des protocoles pour l'application de notre indicateur de calcium codé génétiquement (GECI) CatchER + pour la surveillance des transitoires rapides de calcium dans le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique (ER / SR) des cellules HEK293 et ​​C2C12 du muscle squelettique en utilisant une microscopie à fluorescence en temps réel. Un protocole pour la mesure et l'étalonnage in situ K d est également discuté.

Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Ici, nous décrivons une méthodologie pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'un tissu musculaire adulte. Ces cellules sont utilisées pour étudier la différenciation in vitro des muscles squelettiques et, en particulier, pour étudier les protéines impliquées dans la signalisation du Ca 2+ .

L&#39;isolement des myoblastes humains, l&#39;évaluation de la différenciation myogénique et la mesure de l&#39;entrée de calcium par magasin

Le protocole décrit la méthode de chargement d’un colorant calcique fluorescent à travers le nerf coupé dans les terminaisons nerveuses motrices de souris. En outre, une méthode unique d’enregistrement rapide des transitoires de calcium dans les terminaisons nerveuses périphériques à l’aide de la microscopie confocale est présentée.

Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

Le présent protocole décrit la préparation et l’utilisation de tranches pulmonaires coupées avec précision par des souris pour évaluer la contractilité des voies respiratoires et des muscles lisses artériels intrapulmonaires dans un milieu presque in vivo .

Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

Découvrez l'imagerie confocale FRET pour mesurer directement les fluctuations calciques dans le réticulum sarcoplasmique des cellules musculaires lisses vasculaires. Cette méthode améliore la précision des mesures calciques intracellulaires.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à lintérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l'intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

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