Extracellulaires enregistrement de l'activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

L’objectif global de cette procédure est de manipuler l’impact des entrées synaptiques du traitement neuronal en utilisant des injections microiontophorétiques de substances neuroactives chez des animaux éveillés. Cette méthode peut aider à démêler des fonctionnalités clés à l’aide de systèmes sensoriels tels que le rôle des neurotransmetteurs et leur interaction sur les stimuli sensoriels et le codage. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de manipuler les entrées synatiques locales de la languette et d’étudier les systèmes modulateurs neuronaux sans être affecté par l’anesthésie.

Bien que ce fils prodigue soit présent chez les souris entravées, il peut également être utilisé chez d’autres mammifères tels que les chauves-souris, les rats ou les cochons d’Inde. Pour commencer cette procédure, placez les fils de tungstène dans un outil d’alignement personnalisé pour la coupe. Fixez soigneusement les extrémités libres des fils avec du ruban adhésif et coupez-les à la longueur souhaitée.

Ensuite, tirez doucement sur le ruban adhésif afin de retirer les fils de tungstène de l’outil d’alignement. Assurez-vous que tous les fils restent attachés au ruban. Ensuite, enroulez le ruban sur une broche en laiton poli et maintenez fermement les fils contre la broche afin qu’il y ait une bonne connexion électrique.

Après cela, connectez la broche à un moteur de 5 tours dans le poste de travail. L’accès à la broche est incliné de 45 degrés par rapport à la surface de la solution de gravure. Par la suite, plongez un tiers des fils dans la solution.

Ensuite, plongez une électrode à tige de carbone dans le bain de gravure pour fermer le circuit. Allumez le poste de travail pour que la broche commence à tourner, puis ajustez le courant qui passe à travers les électrodes et la solution de gravure à 250 milliampères. Arrêtez la gravure de la pointe lorsque le courant descend à 200 milliampères afin de graver les pointes de fil en pointes très fines.

Maintenant, placez un fil dans un capillaire en verre borosilicaté avec son extrémité inférieure bloquée par de la pâte à modeler. Tenez la pipette à l’aide d’une bobine chauffante et d’un piston suspendu. Fixez le fil recouvert de verre à une lame avant de le placer sous le microscope.

Réglez la pointe et touchez votre perle borique en point final. Faites ensuite chauffer la perle jusqu’à ce qu’elle fonde légèrement. Après cela, insérez environ 10 à 15 microns de la pointe du fil et éteignez les potentiomètres de chauffage.

Au fur et à mesure que la bille refroidit, retirez le verre de la pointe de l’électrode pour exposer le tungstène. Pour obtenir une pointe d’environ 15 millimètres, réglez la polaire sur les paramètres appropriés. Tirez sur le capillaire pour obtenir deux pipettes avec la pointe isolée.

Montez une pipette à perche sur une lame à l’aide de pâte à modeler et cassez sa pointe à l’aide de ciseaux fins, d’une pince ou du côté plat d’un scalpel. Ajustez légèrement l’angle entre l’électrode et le multi-barillet pour obtenir une meilleure adhérence et un ensemble plus fin. Au microscope, alignez soigneusement l’électrode de tungstène sur la pointe à plusieurs canons.

Une fois aligné, abaissez l’électrode jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le multi-baril. En insérant la rainure entre les deux canons supérieurs, faites glisser la pointe de l’électrode jusqu’à ce qu’elle dépasse de 15 à 20 micromètres de la pointe du multi-canon. Appliquez maintenant une petite goutte d’adhésif photopolymérisable sur le tungstène et l’ensemble multi-barils à environ 5 millimètres de leurs pointes.

Empêchez la colle d’atteindre les pointes pour éviter de bloquer les canaux multi-barils et durcissez la colle à l’aide d’une lampe LED à lumière bleue Maintenant, placez l’animal anesthésié sur une couverture chauffante pour maintenir sa température à 38 degrés Celsius et stabilisez la tête de l’animal dans un cadre stéréotaxique avec deux barres d’oreille et une barre de morsure Ensuite, appliquez du gel ophtalmique pour protéger les yeux. Ensuite, rasez le cuir chevelu et appliquez de la povidone iodée pour désinfecter la peau. À l’aide d’un scalpel, faites une incision le long de la ligne médiane pour exposer le crâne et rétracter le perastium couvrant le péridal et la partie plus rostrale des os occipitaux.

Ensuite, appliquez une fine couche d’adhésif photopolymérisable sur le crâne et la base du tenon de la tête. Attendez 10 secondes et placez le tenon de la tête sur la zone rostrale des os pariétaux le long de la ligne médiane. Utilisez une source de lumière bleue pour durcir l’adhésif pendant 20 secondes pour une force d’adhérence efficace.

Par la suite, percez deux trous autour et derrière la base du poteau de tête à l’aide d’un petit foret. Placez une vis de montre dans un trou percé pour servir de point de contact supplémentaire entre le crâne et la tête. Faites un tour et demi pour bien ajuster les vis et testez avec une pince pour vous assurer qu’elles ne sont pas desserrées.

Ensuite, insérez la pointe du fil de terre en argent dans le troisième trou et assurez-vous qu’il entre en contact avec la dure-mère. Appliquez une petite goutte de colle cyanoacrylate résistante à l’eau pour lier le fil au crâne. Ensuite, appliquez un composite photopolymérisable pour renforcer le lien entre le tenon de tête et le crâne en couvrant la base du poteau de tête, la partie inférieure du fil d’argent et les vis.

Attention à ne pas dépasser la lambda afin de permettre l’accès pendant l’enregistrement et polymériser le composite à l’aide d’une source de lumière bleue. Ensuite, rétractez le muscle à l’arrière du cou près de son insertion sur le crâne. À l’aide d’un petit trépan, percez une fenêtre ronde juste en dessous de la suture lambda et latéralement à la ligne médiane pour exposer le colliculus inférieur.

Dans cette procédure, placez le corps de l’animal dans une contention rembourrée en mousse sur mesure. Fixez le poteau de tête à un support fixé au cadre stéréotaxique. C’est le bon moment pour donner à l’animal une récompense liquide.

Ensuite, couvrez le corps de l’animal avec une couverture en coton et fixez-le sans serrer à l’aide d’un hémi-cylindre en plastique et de ruban adhésif. Utilisez une seringue avec un embout flexible pour remplir les barils avec les médicaments choisis. À l’aide du micro-manipulateur, placez l’électrode multi-barillet sur son support.

Ensuite, placez un fil d’argent non codé à l’intérieur de chaque baril de sorte qu’une extrémité entre en contact avec la solution et que l’autre extrémité soit accessible. Connectez ensuite ces extrémités au dispositif de microionophorèse. Après cela, connectez la borne positive à l’extrémité de l’électrode en tungstène et la borne de terre au fil d’argent qui entre en contact avec la dure-mère.

Par la suite, déplacez l’électrode à plusieurs barils jusqu’à ce que la pointe entre en contact avec la surface du cerveau. Appliquez une solution saline stérile chaude pour prévenir la dessiccation du tissu cérébral. À ce stade, appliquez un courant de rétention pour éviter les fuites de médicament de l’extrémité du canon tout en recherchant une activité unitaire.

Enregistrer l’activité neuronale et l’application iontophorétique de gabazine. On voit ici l’aire de réponse en fréquence de quatre neurones enregistrés dans le colliculus inférieur avant et pendant l’injection micro-iontophorétique de gabazine. Les croix noires indiquent que les fréquences choisies pour être présentées comme des sons rares et répétitifs.

Voici, les histogrammes de temps péristimulus accumulés de la réponse neuronale à toutes les fréquences et intensités présentées pour construire la zone de réponse avant et pendant l’injection de gabazine. Les barres noires indiquent la durée du son. Voici les trasters de points de la réponse de dopage à une paire de fréquences présentées comme rares en rouge et stimulus répétitifs en bleu avant et pendant l’application de gabazine.

L’arrière-plan ombré indique la durée du stimulus. Ces rasters de points montrent les réponses lorsque les probabilités relatives des parafréquences ont été commutées. Ce graphique montre les réponses d’un seul neurone à sept paires de fréquences présentées comme les sons rares et répétitifs avant et pendant l’application de gabazine.

Et ce graphique, montre les indices SSA de la réponse neuronale aux sons rares et répétitifs mesurés avant et pendant l’application de la gabazine. Une fois maîtrisée, la procédure décrite permet d’ajuster les paramètres spécifiques en fonction de la structure neuronale et du type de neurone d’intérêt. Lors de l’enregistrement d’un animal avec un appuie-tête, il est essentiel de se rappeler que la durée de l’enregistrement est déterminée et limitée par le niveau d’accoutumance de l’animal, mais un avantage important est que plusieurs incisions d’enregistrement peuvent être pratiquées sur le même animal plusieurs jours, minimisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

En effectuant des microiontophorétiques à l’aide d’électrodes superposées, d’autres procédures, comme les injections de transistors neuronaux, peuvent être combinées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la source des entrées et la cible de projection des neurones dans le site d’enregistrement. Un problème critique lorsque vous travaillez avec des animaux éveillés est leur bien-être, alors ne dépassez jamais le temps de rappel approuvé dans votre protocole et veuillez surveiller constamment pour vérifier tout signe d’inconfort. Si c’est le cas, vous devez arrêter l’enregistrement immédiatement.