Extracellulaires enregistrement de l'activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

L'objectif général de cette procédure est de manipuler l'impact des entrées synaptiques dans le traitement neuronal à l'aide d'injections microiontophorétiques de substances neuroactives chez des animaux éveillés. Cette méthode peut aider à démêler les fonctions clés en utilisant des systèmes sensoriels, tels que le rôle des neurotransmetteurs et leurs interactions sur les stimuli sensoriels et le codage. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de manipuler les entrées synaptiques locales dans la région ciblée et d'étudier les systèmes modulateurs neuronaux sans être affecté par l'anesthésie.

Bien que ce dispositif ait été utilisé ici chez des souris restreintes, il peut également être employé chez d'autres mammifères tels que les chauves-souris, les rats ou les cobayes. Pour commencer cette procédure, insérez les fils de tungstène dans un outil d'alignement sur mesure destiné à la coupe. Fixez soigneusement les extrémités libres des fils avec du ruban adhésif et coupez-les à la longueur souhaitée.

Ensuite, tirez délicatement sur le ruban adhésif afin d'extraire les fils de tungstène de l'outil d'alignement, en veillant à ce que tous les fils restent fixés au ruban. Puis, enroulez le ruban sur un mandrin en laiton poli et maintenez fermement les fils contre le mandrin afin d'assurer une bonne connexion électrique.

Ensuite, connectez le rotor à un moteur de 5 tr/min dans la station de travail. L'accès au rotor est incliné de 45 degrés par rapport à la surface de la solution de gravure. Plongez ensuite un tiers des fils dans la solution.

Ensuite, immergez une électrode en barreau de carbone dans le bain de gravure afin de fermer le circuit. Mettez en marche la station pour que le mandrin commence à tourner, puis réglez le courant traversant les électrodes et la solution de gravure à 250 milliampères. Arrêtez la gravure de la pointe lorsque le courant chute à 200 milliampères afin d'obtenir des extrémités de fil très fines.

Placez maintenant un fil dans une capillarité en verre borosilicaté dont l'extrémité inférieure est obturée avec de la pâte à modeler. Tenez la pipette à l'aide d'un filament chauffant et d'un plongeur suspendu. Fixez le fil recouvert de verre sur une lame avant de le placer sous le microscope.

Réglez la pointe et touchez votre perle de borate de manière à ce qu'elle soit nette. Ensuite, chauffez la perle jusqu'à ce qu'elle fonde légèrement. Après cela, insérez environ 10 à 15 microns de la pointe du fil et éteignez les potentiomètres de chauffage.

Alors que la perle se refroidit, retirez le verre de l'extrémité de l'électrode pour exposer le tungstène. Pour obtenir une pointe d'environ 15 millimètres, réglez le polarisateur aux paramètres appropriés. Tirez la capillaire pour obtenir deux pipettes dont la pointe est isolée.

Fixez une pipette polaire sur une lame à l’aide d’argile à modeler et cassez son extrémité à l’aide de ciseaux fins, de pinces ou du côté plat d’un scalpel. Ajustez légèrement l’angle entre l’électrode et le multi-barillet afin d’obtenir une meilleure adhérence et un ensemble plus fin. Sous le microscope, alignez soigneusement l’électrode en tungstène au-dessus de l’extrémité du multi-barillet.

Une fois alignée, abaisser l'électrode jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec le multi-barillet. En la plaçant dans la rainure située entre les deux barillets supérieurs, faire ensuite glisser la pointe de l'électrode jusqu'à ce qu'elle dépasse de 15 à 20 micromètres par rapport à l'extrémité du multi-barillet. Appliquer maintenant une petite goutte d'adhésif durcissable à la lumière sur l'ensemble constitué par le tungstène et le multi-barillet, à environ 5 millimètres de leurs extrémités.

Évitez que la colle n'atteigne les extrémités afin de ne pas obstruer les canaux à plusieurs canaux, puis durcissez la colle à l'aide d'une lampe à LED de lumière bleue. Placez ensuite l'animal anesthésié sur une couverture chauffante afin de maintenir sa température à 38 degrés Celsius et stabilisez la tête de l'animal dans un cadre stéréotaxique à l'aide de deux barres auriculaires et d'une barre à mâcher. Appliquez ensuite un gel ophtalmique pour protéger les yeux. Ensuite, rasez le cuir chevelu et appliquez de la povidone iodée pour désinfecter la peau. À l’aide d’un scalpel, faites une incision le long de la ligne médiane afin d’exposer le crâne et rétractez le pérastium recouvrant les os pariétaux et la partie plus rostrale des os occipitaux.

Ensuite, appliquer une fine couche d'adhésif durcissable à la lumière sur le crâne et à la base du support crânien. Attendre 10 secondes, puis positionner le support crânien au-dessus de la région rostrale des os pariétaux, le long de la ligne médiane. Utiliser une source de lumière bleue pour durcir l'adhésif pendant 20 secondes afin d'obtenir une résistance adhésive optimale.

Ensuite, percer deux trous autour et à l'arrière de la base du support crânien à l'aide d'un petit foret. Placer une vis de montre dans un trou percé afin de servir de point de contact supplémentaire entre le crâne et le support de tête. Effectuer un tour et demi pour ajuster fermement les vis, puis les tester avec une pince afin de s'assurer qu'elles ne sont pas desserrées.

Ensuite, insérez l'extrémité du fil de masse en argent dans le troisième trou et assurez-vous qu'il entre en contact avec la dure-mère. Appliquez une petite goutte de colle cyanoacrylate résistante à l'eau pour fixer le fil au crâne. Par la suite, appliquez un composite photopolymérisable afin de renforcer l'adhérence du support crânien au crâne, en recouvrant la base du support, la partie inférieure du fil en argent et les vis.

Veillez à ne pas dépasser le lambda afin de permettre l'accès pendant l'enregistrement, puis polymérisez le composite à l'aide d'une source lumineuse bleue. Ensuite, rétractez le muscle à l'arrière du cou près de son insertion sur le crâne. À l’aide d’un petit trépan, percez une fenêtre ronde juste en dessous de la suture lambda et latérale par rapport à la ligne médiane pour exposer le colliculus inférieur.

Dans cette procédure, placer le corps de l'animal dans un dispositif de contention en mousse sur mesure. Fixer le support de la tête à un support attaché au cadre stéréotaxique. C'est le bon moment pour donner à l'animal une récompense liquide.

Ensuite, recouvrez le corps de l'animal avec une couverture en coton et fixez-la légèrement à l'aide d'un hémicylindre en plastique et de ruban adhésif. Utilisez une seringue dotée d'une embout flexible pour remplir les barillets avec les médicaments choisis. À l’aide du micromanipulateur, placez l’électrode multibarillet sur son support.

Ensuite, insérez un fil d'argent non isolé dans chaque alvéole de sorte qu'une extrémité touche la solution et que l'autre extrémité soit accessible. Puis reliez ces extrémités au dispositif de micro-iontophoretique. Après cela, reliez la borne positive à l'extrémité de l'électrode en tungstène et la borne de masse au fil d'argent en contact avec la dure-mère.

Ensuite, déplacer l'électrode multicanal jusqu'à ce que la pointe entre en contact avec la surface du cerveau. Appliquer une solution saline stérile tiède afin d'éviter la dessiccation du tissu cérébral. À ce stade, appliquer un courant de rétention pour éviter toute fuite de médicament par l'extrémité du canal tout en recherchant une activité unitaire unique.

Enregistrer l'activité neuronale et l'application iontophorétique de gabazine. On observe ici la zone de réponse en fréquence de quatre neurones enregistrés dans le colliculus inférieur avant et pendant l'injection micro-iontophorétique de gabazine. Les croix noires indiquent les fréquences choisies pour être présentées sous forme de sons rares et répétitifs.

Ici, sont présentés les histogrammes cumulés de temps péri-stimulus de la réponse neuronale à toutes les fréquences et intensités présentées pour construire la zone de réponse, avant et pendant l'injection de gabazine. Les barres noires indiquent la durée du son. Voici les trames de points de la réponse en sursauts à une paire de fréquences, présentée comme stimulus rare en rouge et stimulus répétitif en bleu, avant et pendant l'application de gabazine.

L’arrière-plan ombré indique la durée du stimulus. Ces matrices de points montrent les réponses lorsque les probabilités relatives des parafréquences ont été inversées. Ce graphique présente les réponses d’un seul neurone à sept paires de fréquences, présentées comme son rare et son répétitif, avant et pendant l’application de gabazine.

Et ce graphique montre les indices SSA des réponses neuronales aux sons rares et répétitifs, mesurés avant et pendant l'application de gabazine. Une fois maîtrisée, la procédure décrite permet d'ajuster les paramètres spécifiques en fonction de la structure neuronale et du type de neurone d'intérêt. Lors de l’enregistrement chez des animaux soumis à une contention de la tête, il est essentiel de garder à l’esprit que la durée des enregistrements est déterminée et limitée par le degré d’habituations de l’animal, mais un avantage important est que plusieurs incisions d’enregistrement peuvent être réalisées sur le même animal à plusieurs jours d’intervalle, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.

En effectuant une microiontophorèse à l'aide d'électrodes « piggy back », d'autres procédures, telles que l'injection de transistors neuronaux, peuvent être combinées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'origine des entrées et la cible de projection des neurones situés au niveau du site d'enregistrement. Un point critique lorsqu'on travaille avec des animaux éveillés est leur bien-être ; ne jamais dépasser la durée maximale de rappel approuvée dans votre protocole et surveiller constamment la présence de tout signe de malaise. Dans ce cas, vous devez interrompre immédiatement l'enregistrement.