Une méthode pour cibler et Isoler Airway-innervant neurones sensoriels chez la souris

L'objectif général de cette expérience est de marquer et d'isoler les neurones du ganglion nodosus du nerf vague qui innervent les voies respiratoires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie périphérique, telles que : quelles sont les propriétés caractéristiques des neurones innervant les voies respiratoires ?

Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une méthode robuste et à haut débit pour cibler et isoler des populations neuronales spécifiques. Après avoir récolté les ganglions sensoriels, aspirez 500 microlitres de solution de dissociation des ganglions de chaque tube, sans perturber les ganglions. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS à chaque échantillon, et attendez que les ganglions se déposent au fond des tubes.

Ensuite, retirez le PBS et ajoutez un millilitre de solution de dissociation des ganglions supplémentée en enzyme de digestion aux neurones, suivi de l'ajout de 20 microlitres de Bleu rapide dans le tube témoin positif. Incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant la durée appropriée selon l'âge de l'enzyme de digestion. Agitez et secouez brièvement les tubes toutes les 15 minutes afin de garantir que les ganglions soient bien recouverts par la solution de digestion.

Pendant que les cellules nerveuses sont digérées, ajoutez lentement et soigneusement 400 microlitres de solution fraîchement préparée à 12 % de densité sur 400 microlitres de solution à 28 % de densité dans un tube de 1,5 millilitre par échantillon. Deux couches distinctes doivent être visibles, l'une plus foncée que l'autre. Ensuite, étiquetez des tubes de collecte de 1,5 millilitre pour le tri, en incluant un tube positif au Fast Blue et un tube négatif au Fast Blue par échantillon à trier.

À la fin de la période de digestion, éliminer l'enzyme de digestion et laver les ganglions deux fois avec un millilitre de PBS, comme vient d'être démontré. Après le deuxième lavage, ajouter 200 microlitres de solution fraîche de dissociation des ganglions dans chaque tube. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres réglée sur un volume de 100 microlitres, aspirer et expulser les ganglions plusieurs fois afin de dissocier les cellules en une suspension monocellulaire, en prenant soin d’éviter la formation de bulles.

Lorsqu'aucun fragment de tissu intact n'est visible, maintenir fermement un filtre cellulaire de 70 micromètres dans une main et pipeter la solution de cellules dissociées au centre du filtre. Ensuite, laver le tube de dissociation avec 100 microlitres de solution fraîche de dissociation des ganglions afin de récupérer les cellules supplémentaires. Filtrer ce lavage à travers le filtre et utiliser une nouvelle pointe de pipette pour aspirer toute solution restante contenant des cellules située sur la face inférieure du filtre, puis l'ajouter à la suspension cellulaire.

Superposez maintenant soigneusement l'ensemble des 300 microlitres de cellules au-dessus du gradient de densité préparé précédemment. Et recueillez les cellules ganglionnaires par centrifugation. Pendant que les cellules tournent, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse fraîchement préparé dans le tube de collecte Fast Blue positif et 600 microlitres de tampon de lyse dans le tube de collecte négatif afin de garantir que le fluide de gaine de tri n'entraîne pas une dilution significative du tampon de lyse.

À la fin de la centrifugation, retirez soigneusement les 700 microlitres supérieurs de solution contenant la majeure partie des débris cellulaires. Ensuite, mélangez 700 microlitres de solution fraîche de dissociation des ganglions avec les cellules restantes. Récupérez les cellules par centrifugation et éliminez soigneusement le surnageant.

Ensuite, re-suspendre les cellules dans 200 à 300 microlitres de solution de dissociation pour tri des ganglions à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres réglée sur 200 microlitres. Placer ensuite les cellules sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être triées. Après purification des cellules ganglionnaires par tri en flux activé des cellules (FACS), homogénéiser les neurones dans du tampon de lyse pendant une minute par vortexage.

Ensuite, mélangez les cellules plusieurs fois avec un volume d'éthanol à 70 % et transférez jusqu'à 700 microlitres de l'échantillon dans une colonne de centrifugation. Centrifugez la colonne pendant 15 secondes à 8 000 × g dans une microcentrifugeuse et jetez le flux traversant. Une fois que l'ensemble de l'échantillon a traversé la colonne de centrifugation, extrayez l'ARN selon les protocoles standards de purification de l'ARN.

Ensuite, utilisez un système d'électrophorèse microfluidique pour évaluer la qualité de l'ARN conformément aux spécifications du fabricant. Sur ces graphiques, les contrôles négatif et positif au Fast Blue, utilisés pour définir les fenêtres de tri, sont indiqués. Les cellules dissociées du ganglion nodosé marquées au Fast Blue peuvent alors être triées en populations Fast Blue positives et Fast Blue négatives.

L'efficacité de tri pour cette méthode est de 73 à 85 %, avec environ 1 500 cellules positives au bleu rapide ou moins, et près de 60 000 cellules négatives au bleu rapide collectées en moyenne. Comme observé pour cet échantillon représentatif, les pics 18S et 28S obtenus par électrophorèse microfluidique peuvent ensuite être utilisés pour calculer le nombre d'intégrité de l'ARN afin de déterminer la qualité de l'ARN extrait. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures et demie si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d’avancer rapidement dans les étapes et d’utiliser des solutions fraîchement préparées pour l’extraction de l’ARN. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la culture de neurones peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que quelles propriétés fonctionnelles sont propres aux neurones innervant les voies respiratoires ? Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie périphérique pour explorer les propriétés uniques d’une population spécifique de neurones innervant les voies respiratoires situés dans le ganglion nodosum du nerf vague.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment marquer et dissocier des neurones spécifiques des ganglions nodosés, qui peuvent ensuite être utilisés pour le séquençage de l'ARN ou mis en culture pour des études fonctionnelles. N'oubliez pas que le travail avec le 2-mercaptoéthanol peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de gants et le travail sous une hotte chimique doivent toujours être prises lors de l'utilisation de ce composé.