Name: Une méthode pour cibler et Isoler Airway-innervant neurones sensoriels chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Découvrez une méthode robuste pour cibler et isoler les neurones nodose innervant les voies aériennes chez la souris. Cette technique de marquage Fast Blue permet l'extraction d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression génique.

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Soutenu par des subventions du NIH R01HL105635 à SEJ. Les auteurs tiennent à remercier Diego V. Bohórquez pour des conseils techniques. Nous remercions également R. Ian Cumming pour l&#39;assistance technique et en effectuant la cytométrie en flux à l&#39;installation de vaccin humain Duke Institut de recherche de cytométrie en flux de ressources partagées (Durham, Caroline du Nord). La cytométrie en flux a été réalisée dans le laboratoire de bioconfinement régional à Duke, qui a reçu un soutien partiel pour la construction des Instituts nationaux de la santé, Institut national des allergies et des maladies infectieuses (UC6-AI058607).

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université Duke. 1. intranasale administration de Fast Blue Pour Fast Blue, administrer le colorant au moins 2 jours avant euthanasier la souris. Le colorant va persister pendant un maximum de huit semaines. <ol><li> Anesthetize la souris avec l&#39;anesthésie par inhalation de lumière (2,5% de sévoflurane) jusqu&#39;à ce que la respiration commence à ralentir. </li><li> Utiliser une pipette de 200 pi avec des conseils filtrés pour instiller lentement 40 pl de solution de colorant (0,4 mM bleu rapide, 1% de diméthylsulfoxyde, salins DMSO, dans un tampon phosphate, PBS) dans la narine, une pause de temps en temps pour assurer la souris est aspiration de la solution (figure 1A). </li><li> Maintenez la souris verticale, la tête, et masser doucement la poitrine pour assurer le colorant se répand dans les poumons. </li></ol> 2. Préparatifs sur Dissection et Day Analyse <ol><li> Préparer 10 ml0; Ganglions Dissociation Solution (GAD) en combinant les ingrédients comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Effectuer l&#39;extraction d&#39;ARN dans une zone de laboratoire dédiée. Avant de commencer l&#39;expérience, des surfaces propres avec 70% d&#39;éthanol, 10% l&#39;eau de Javel, et RNase réactif de décontamination. Cela comprend la centrifugeuse d&#39;ARN, des supports pour tubes et pipettes. Assurez-vous qu&#39;il ya des boîtes de pointe de filtre dédiés à l&#39;utilisation d&#39;ARN seulement. Ne pas utiliser cet équipement et la zone de préparation de l&#39;ADN, car cela va contaminer les échantillons. </li><li> Mélanger frais 70%, et 80% d&#39;éthanol avec de l&#39;eau sans RNase. Préparer 1 ml par échantillon à utiliser dans l&#39;extraction de l&#39;ARN. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Avancée DMEM / f12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutamine </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> supplément N2 </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> B27 (pas de vitamine A) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> NGF (50 ng / ml) </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactif Mélange pour Ganglions Dissociation Solution (GAD). 3. Procédure Dissection <ol><li> Remplir tubes de 1,5 ml avec 500 ul GADS, un pour chaque échantillon expérimental, un pour un contrôle de tri positif, et un pour un contrôle de tri négatif. tubes de magasins sur la glace tout au long de la dissection. </li><li> Disséquer le ganglion noueux et faire deux coupes partielles pour faciliter la dissociation, puis le mettre dans le tube d&#39;échantillon expérimental. S&#39;il vous plaît se référer au protocole JoVE suivante pour la dissection des ganglions noueux 16 et DRG 17. </li><li> Disséquer et partiellement coupé ganglion non marqué, comme les ganglions de la racine dorsale (DRG), pour les contrôles de tri. Utilisez deux noyaux pour le contrôle positif et deux Gangliun pour le contrôle négatif. </li><li> Pour obtenir des neurones noueux assez pour le tri réussi, combiner ganglion de 5 souris dans un seul tube échantillon expérimental contenant GADS. </li></ol> 4. Sensory Ganglions Dissociation <ol><li> Pipeter sur 500 GADS ul, laissant ganglion dans le tube. Laver une fois ganglion en ajoutant 1 ml de PBS, attendez ganglion à déposer au fond du tube, puis pipetez sur PBS. </li><li> Ajouter 1 ml Gads et 22 ul de digestion enzymatique (collagénase I / II et de protéase du mélange, 2,5 mg / ml dans H 2 O) dans chaque tube. </li><li> Ajouter 20 ul bleu rapide (5,26 mM) au tube de contrôle positif. </li><li> Mettre les tubes dans un bloc de bain d&#39;eau ou de chauffage déjà réglé à 37 ° C. Remarque: Le temps de digestion ganglion dépend de l&#39;âge de l&#39;enzyme de digestion. Moins de 1 mois de dissoudre l&#39;enzyme de digestion, la digestion pendant 30 minutes, à l&#39;intérieur de 2 - 6 mois à digérer pendant 45 minutes. Si l&#39;enzyme est âgé de plus de six mois, digérer ganglion fou 60 min. </li><li> Chaque 15 min tubes agités brièvement et flick eux pour assurer ganglion sont couverts par la solution. </li><li> Alors que les ganglions sont digérées, de préparer des gradients de densité en utilisant une solution de particules (particules de silice colloïdale enrobées avec de la polyvinylpyrrolidone). <ol><li> Mélanger la solution de 12% de particules dans GADS, 500 ul par échantillon. </li><li> Mélanger la solution de 28% de particules dans GADS, 500 ul par échantillon. </li><li> Lentement et soigneusement ajouter 400 ul solution de densité de 12% au-dessus de la solution de densité de 400 ul de 28% dans un tube de 1,5 ml frais pour chaque échantillon. Ne pas laisser les deux couches de se mélanger. Deux couches distinctes doivent être visibles dans le tube; une plus foncé que l&#39;autre. </li></ol></li><li> Alors que les ganglions sont digérés, étiqueter les nouveaux tubes de 1,5 ml de collecte pour le tri (un bleu positif et un tube bleu rapide rapide négative par échantillon de tri). Selon les exigences de l&#39;installation de tri, ces tubes doivent avoir des couvercles amovibles afin de ne pas interférere avec le trieur de cellules. </li><li> Après le temps de la digestion appropriée, enlever GADS avec digestion enzymatique et laver deux fois avec ganglion 1 ml de PBS. Ajouter 200 pi de GADS frais à chaque tube. </li><li> Utiliser une pipette de 200 pi, réglé sur un volume de 100 pi, et la pipette ganglion monter et descendre plusieurs fois pour séparer les cellules. Répétez jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun morceau de tissu intact est vu. Évitez de créer des bulles dans la solution. </li><li> Passez cellules dissociées à travers une cellule crépine de 70 um. </li><li> Ajouter un autre 100 GADS pi au tube d&#39;origine de dissociation pour ramasser toutes les cellules restantes errants gauche et passer la solution supplémentaire à travers le tamis de la cellule. L&#39;utilisation d&#39;un nouvel embout de pipette, recueillir tout liquide contenant des cellules restantes qui a passé à travers le tamis et accroché à la maille. Le volume final de cellules en suspension dans GADS est de 300 pi. </li><li> superposer soigneusement les 300 pi de cellules sur le dessus du gradient de densité préalablement réalisé. Éviter les bulles et le mélange de caunes avec les couches de densité. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 2900 xg à la température ambiante. </li><li> Alors que les cellules sont dans la centrifugeuse, mélanger le tampon de lyse (1 ml par échantillon expérimental) comme suit: 10 pi de 2-mercaptoéthanol dans 1 ml de tampon RLT (de la trousse d&#39;extraction d&#39;ARN). <ol><li> Ajouter 300 pi de tampon de lyse rapide au tube de collecte positif bleu et 600 pi à tube de Fast Blue négative de collection (tubes marqués à l&#39;étape 4.7). Ce volume dépend du nombre de cellules qui devraient être collectées. Pour &lt;2.000 cellules, ajouter 300 pi pour&gt; 7000 cellules ajouter 600 pi. Cela permettra d&#39;assurer le fluide gainant le tri ne dilue pas de manière significative le tampon de lyse. </li></ol></li><li> Une fois la centrifugation est terminée, retirez soigneusement et jeter la couche ul top 700. Cette couche contient la majorité des débris cellulaires qui, autrement, interférer avec le tri cellulaire. </li><li> Ajouter 700 ul GADS frais à la cellule restante contenant la solution et pipetteste monter et descendre plusieurs fois pour mélanger. </li><li> Centrifuger pendant 15 min à 2900 xg pour sédimenter les cellules. </li><li> Alors que les cellules sont dans la centrifugeuse, mélangez le tri GADS (500 pi par échantillon) en ajoutant 5 pi DNase (10 mg / ml) à 1 ml GADS. </li><li> Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement et éliminer le surnageant, en laissant le culot cellulaire. </li><li> Re-suspendre culot cellulaire dans 200 - 300 pi de tri GADS par pipetage de haut en bas avec une pipette de 1000 pi réglé à 200 pi plusieurs fois. Mettre les échantillons sur la glace. Les cellules sont maintenant prêts à être triés. </li></ol> 5. Fluorescence cellulaire activé (FAC) Tri Remarque: Cette section nécessite une connaissance opérationnelle d&#39;un trieur FACS ou l&#39;assistance d&#39;un personnel qualifié. <ol><li> Ajouter 1 ul d&#39;iodure de propidium (PI) solution mère (50 pg / ml) à chaque échantillon pour tester la viabilité des cellules. Divisez contrôle négatif en 2 tubes, une avec PI et l&#39;autre sans. PI lie à l&#39;ADN seulement dans les cellules mortes. Siaprès quelques sortes, il n&#39;y a pas de cellules mortes à étiqueter, l&#39;utilisation de PI est pas nécessaire. </li><li> Cellules de transport à la cytométrie de flux instrument, par exemple., BD FACS AriaII exécutant le logiciel Diva 8, sur la glace. </li><li> Étant donné que la taille des cellules est variable dans cette population, utiliser une grande buse (100 um) pour le tri. Pour diminuer la quantité de stress l&#39;expérience des cellules et augmenter la viabilité cellulaire utiliser une faible pression (20 psi). </li><li> Utilisez le logiciel trieur FACS pour mettre en place les parcelles d&#39;analyse, de dispersion vers l&#39;avant, diffusion latérale (SSC), bleu rapide, et PI, si nécessaire. </li><li> Pour les cellules re-suspendre, vortex doucement brièvement l&#39;échantillon avant de le charger dans la trieuse. </li><li> Commencez par le contrôle négatif, aucun Fast Blue ou PI, de fixer le seuil de la porte (figure 2A). Cela permettra de déterminer la quantité d&#39;autofluorescence dans la population cellulaire. Facultatif: Exécutez l&#39;échantillon négatif avec PI pour déterminer s&#39;il y a une population de cellules mortes. </li><li> Trier l&#39;échantillon de contrôle positif (incubated avec Blue rapide), pour définir les paramètres de compensation. </li><li> Une fois que les portes et les paramètres sont définis, commencer à trier les échantillons expérimentaux. Les échantillons sont classés dans les tubes de collecte d&#39;ARN préparés contenant un tampon de lyse. </li><li> Conserver les échantillons triés sur la glace jusqu&#39;à ce que le tri cellulaire est terminée. </li><li> Commencer l&#39;étape d&#39;extraction d&#39;ARN immédiatement après que les cellules sont triées. </li></ol> 6. Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Vortex cellules triées dans un tampon de lyse pendant 1 min à homogénéisent. </li><li> Ajouter 1 volume de 70% d&#39;éthanol et mélange par pipetage de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Transférer jusqu&#39;à 700 ul de l&#39;échantillon à une colonne de centrifugation. Centrifugeuse pendant 15 secondes à 8000 x g. Jeter l&#39;écoulement. <ol><li> Répéter jusqu&#39;à ce que le volume total de l&#39;échantillon est passé à travers la colonne. </li></ol></li><li> Ajouter 350 pi de tampon RW1 et poursuivre le processus de purification de l&#39;ARN, comprenant l&#39;étape de traitement par la DNase, selon le protoco du fabricantl pour les cellules. </li><li> Une fois que l&#39;ARN a été extrait, de tester la qualité de l&#39;ARN en utilisant un système d&#39;électrophorèse microfluidique selon les spécifications du fabricant. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce protocole décrit un procédé pour cibler des neurones innervant des voies aériennes dans les ganglions noueux du nerf vague. Une fois marqué, les ganglions sont doucement dissociés pour préserver de manière optimale le nombre de cellules et la viabilité. Ces neurones sont ensuite triés FAC directement dans le tampon de lyse et l&#39;ARN est extrait. L&#39;importance de ce protocole est la capacité de cibler, d&#39;isoler et de préserver la qualité d&#39;une population spécifique de cellules sensorielles. L&#39;express...

nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces nerfs afférents sont situés dans les ganglions sensoriels, comme la racine dorsale, du trijumeau ou des ganglions noueux. Chaque ganglions sensitifs innerve régions spécifiques du corps et contient des cellules qui innervent les organes et tissus séparés dans cette région. Par exemple, les ganglions de la racine dorsale (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d&#39; étendre les processus à travers le corps et les membres, tandis que les ganglions trigéminés sont situés dans le crâne, contenant les neurones qui innervent le visage, les yeux, des méninges ou des voies aériennes supérieures 1, 2. Les ganglions noueux du nerf pneumogastrique est situé dans le col au- dessous du crâne et qui contient des corps cellulaires qui prolongent les fibres nerveuses dans tout le tractus gastro - intestinal, le cœur et les poumons et les voies respiratoires inférieures 3. Chez l&#39;homme, ganglion noueux est seule, cependant, chez la souris, il est fusionnéavec le ganglion jugulaires, qui innerve aussi les poumons 4. Ce ganglion fusionné est souvent appelée la jugulaire / noueux complexe, ganglion vagal, ou simplement ganglion noueux 5. Ici, elle est désignée sous le ganglion noueux. afférences du noueux transmettent des informations à partir des viscères vers le noyau du tractus solitaire (NTS) dans le tronc cérébral. Entrée sensorielle à ce ganglion unique contrôle un large éventail de fonctions, telles que la motilité intestinale 6, la fréquence cardiaque 7, respiration 8,9, et les réponses respiratoires irritantes activées 10,11. Avec cette diversité de fonctions et organes innervés, il est essentiel de cibler et d&#39;isoler des sous-populations spécifiques d&#39;organes du ganglion noueux afin d&#39;étudier les voies neuronales individuelles. Toutefois, étant donné la petite taille de l&#39;noueux et le nombre limité de neurones qu&#39;il contient ce n&#39;est pas une tâche triviale. Chaque souris noueux ganglion contient environ 5000 neurones 12en plus d&#39;une population étendue de cellules de soutien du satellite. Sur les 5.000 neurones noueux, seulement 3-5% innervent les voies respiratoires. Par conséquent, les modifications fonctionnelles, morphologiques ou moléculaires dans les neurones des voies aériennes innervant, en raison de la stimulation ou pathologies respiratoires, seront perdus dans le ganglion noueux dense. Pour résoudre ce problème, un procédé a été développé pour identifier et isoler les neurones qui innervent les voies respiratoires. Les voies respiratoires ont été exposés à un colorant traceur fluorescent pour identifier les neurones innervant de noueux ultérieures. Fast Blue a été repris par les neurones et se déplace rapidement à leurs corps cellulaires où elle est conservée pendant jusqu&#39;à huit semaines 13 - 15. Une fois identifié, un protocole de dissociation douce mais efficace a été utilisée pour préserver l&#39;étiquetage de colorant et la viabilité des cellules pour les cellules activées par fluorescence (FAC) de tri. Les cellules triées sont utilisées pour extraire l&#39;acide ribonucléique de haute qualité (ARN) afin de déterminer l&#39;expression du gène ou de fou une autre analyse moléculaire en aval. Ce protocole fournit une technique utile et robuste pour isoler les neurones sensoriels qui innervent un tissu d&#39;intérêt.

<table><tbody><tr><td>Fast Blue</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>stock 2 mg/ml dans l’eau</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 coloration rouge Nissle</td> Life <td>Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) sans Ca et Mg</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamine ( Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (sans vitamine A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance nerveuse (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &micro ; g/ml dans l’enzyme de digestion PBS/10 % FBS</td></tr><tr><td>, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>stock 2,5 mg/ml dans</td></tr><tr><td>une solution aqueuse de particules (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; Filtre à cellules m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Eau libre RNase</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de décontamination RNase, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ARN, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Kit DNase, Kit DNase sans RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>stock 10 mg/ml en 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>stock 10 &micro ; g/ml dans le</td></tr><tr><td>système d’électrophorèse microfluidique PBS (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode pour cibler et isoler airway-innervant neurones sensoriels chez la souris

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

nerfs somatosensoriels transduction des stimuli nocifs causés par les deux agents endogènes et environnementaux thermiques, mécaniques, chimiques et. Les corps cellulaires de ces neurones afférents se trouvent à l&#39;intérieur des ganglions sensoriels. ganglions sensoriels innervent un organe ou une partie spécifique du corps. Par exemple, les ganglions rachidiens (DRG) sont situés dans la colonne vertébrale et d&#39;étendre les processus à travers le corps et les membres. Le ganglion de Gasser sont situés dans le crâne et innervent la face, et des voies respiratoires supérieures. afférences vagales des ganglions noueux prolongent tout au long de l&#39;intestin, le cœur et les poumons. Les neurones noueux contrôlent un large éventail de fonctions telles que: la fréquence respiratoire, irritation des voies respiratoires, et les réflexes de toux. Ainsi, de comprendre et de manipuler leur fonction, il est essentiel d&#39;identifier et d&#39;isoler des sous-populations neuronales spécifiques des voies respiratoires. Chez la souris, les voies respiratoires sont exposés à un colorant traceur fluorescent, bleu rapide, pour le traçage rétrograde spécifique des voies aériennes noueux neurones. Les ganglions noueux sont dissociés et cellules activées par fluorescence (FAC) tri est utilisé pour recueillir des cellules positives de colorant. Ensuite, l&#39;acide ribonucléique de haute qualité (ARN) est extrait à partir des cellules positives de colorants pour le séquençage de la prochaine génération. En utilisant cette méthode intubation expression spécifique du gène neuronal est déterminé.

En utilisant cette méthode, les neurones des voies aériennes innervant sont marquées par voie intranasale instillant Fast Blue (figure 1A). Au bout de deux jours, les cellules marquées bleu rapide apparaissent dans les ganglions noueux (figure 1C). Ces cellules représentent 3 à 5% de la population neuronale totale des ganglions noueux. D&#39;autres colorants rétrogrades qui ont été utilisés à cet effet comprennent Dil (1,1&#39;-dioctadécyl-3,3,3 &#39;, 3...

Les neurones sensoriels spécifiques à un organe sont difficiles à identifier. Le traçage Fast Blue est utilisé pour identifier les neurones nodoses qui innervent les voies respiratoires pour le tri cellulaire. Les neurones nodoses triés sont utilisés pour extraire de l’acide ribonucléique (ARN) de haute qualité pour le séquençage. À l’aide de ce protocole, l’expression génique de neurones spécifiques des voies respiratoires est déterminée.

Une méthode pour cibler et Isoler Airway-innervant neurones sensoriels chez la souris

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

L'objectif général de cette expérience est de marquer et d'isoler les neurones du ganglion nodosus du nerf vague qui innervent les voies respiratoires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie périphérique, telles que : quelles sont les propriétés caractéristiques des neurones innervant les voies respiratoires ?Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une méthode robuste et à haut débit pour cibler et isoler des populations neuronales spécifiques. Après avoir récolté les ganglions sensoriels, aspirez 500 microlitres de solution de dissociation des ganglions de chaque tube, sans perturber les ganglions. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS à chaque échantillon, et attendez que les ganglions se déposent au fond des tubes.Ensuite, retirez le PBS et ajoutez un millilitre de solution de dissociation des ganglions supplémentée en enzyme de digestion aux neurones, suivi de l'ajout de 20 microlitres de Bleu rapide dans le tube témoin positif. Incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant la durée appropriée selon l'âge de l'enzyme de digestion. Agitez et secouez brièvement les tubes toutes les 15 minutes afin de garan

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Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

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Découvrez une méthode robuste pour cibler et isoler les neurones nodose innervant les voies aériennes chez la souris. Cette technique de marquage Fast Blue permet l'extraction d'ARN de haute qualité pour l'analyse d'expression génique.

Une méthode pour cibler et Isoler Airway-innervant neurones sensoriels chez la souris

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