Name: Récolte sélective de Marginating-hépatiques Leucocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez la récolte sélective de leucocytes hépatiques marginants par perfusion forcée chez le rat et la souris. Cette méthode permet d'isoler des cellules immunitaires pures des sinusoïdes hépatiques pour étudier leurs fonctions immunologiques uniques.

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Les auteurs et ce travail ont été soutenus par la subvention NIH/NCI # R01CA172138 (à SBE).

Déclaration d&#39;éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité des soins et l&#39;utilisation des animaux institutionnels (IACUC) à l&#39;Université de Tel-Aviv. Protocole 1. Rats <ol><li> Les préparatifs <ol><li> Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) de solution pour être utilisé à la température ambiante (RT), par addition de 30 unités d&#39;héparine sans conservateur, par ml de solution saline de phosphate (PBS) 1 x solution tampon. Calculer 35 ml par animal. </li><li> Passer du PBS héparinisé par les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles à ailettes pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Stériliser outils chirurgicaux - 2 paires de ciseaux, une pince émoussée-avivés, 2 hémostatiques, et des pinces à dents tissus (autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec)). </li></ol></li><li> Perfusion du foie et de la collection de MH-leucocytes <ol><li> Euthanasier l&#39;animal par une surdose de 8% isoflurane. Par précaution, placez un tube de 50 ml contenant un isofluranepad -soaked autour de la tête de rat jusqu&#39;à l&#39;ouverture de sa cavité thoracique. </li><li> Ouvrez les cavités péritonéale et de la poitrine pour exposer le foie et le complexe cardiorespiratoire immédiatement après la cessation de la respiration. Évitez les saignements à travers ce processus. <ol><li> Plus précisément, commencer l&#39;incision au niveau du point médian abdominale basse, sans organes internes dommageables, et les progrès des deux côtés en diagonale vers les côtes, coupe à travers eux à des niveaux de la poitrine-cavité supérieure. </li></ol></li><li> Dans environ une minute, de recueillir autant de sang que possible (~ 6 ml de 250 g animale) du ventricule droit dans une seringue. </li><li> Fixer la veine cave caudale avec un hémostatique aussi près que possible du coeur, afin de permettre la collecte de perfusat. </li><li> Tirez sur les intestins et en dehors de l&#39;animal à la droite de l&#39;expérimentateur, pour exposer la veine porte. </li><li> Insérer un cathéter 25 G IV, relié à une pompe péristaltique, dans la veine porte, comme caudale que possible,mais rostrale à la veine splénique. </li><li> Insérer une aiguille de calibre 25 de papillon, relié à une seringue de 5 ml, dans la veine cave inférieure, caudale par rapport à la pince hémostatique. </li><li> Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d&#39;environ 3 ml / min et de recueillir doucement les premiers ml de perfusat qui sont contaminés par du sang dans la seringue. Continuez jusqu&#39;à ce que la couleur perfusat est tour à tour rouge pâle (environ 3-5 ml). Notez que la couleur du foie évolue vers brun clair. </li><li> Sans arrêter la pompe péristaltique, remplacer la seringue de 5 ml de récolte avec une seringue de 20 ml, la récolte et la collecte d&#39;au moins 20 ml d&#39;une solution de perfusion du foie en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu&#39;à 4 ml / min). Surveiller en permanence le flux de perfusat dans la seringue de collecte, et d&#39;éviter le vide qui est trop forte (qui peut obstruer l&#39;aiguille à travers l&#39;effondrement des murs de veine cave). </li><li> Terminate perfusion lorsque la couleur du foie se transforme en brun clair. </li></ol></li><li> leucocytes Extraction <ol&gt; <li> Centrifuger le liquide de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g, 24 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant </li><li> Ajouter 10 ml de PBS, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le surnageant. Sur la base des objectifs de l&#39; étude, utiliser la préparation en est, ou de procéder à des purifications supplémentaires (par exemple, séparation par gradient de densité). <ol><li> Plus précisément, la couche 4 ml de solution de perfusion sur 4 ml de séparation de masse à gradient de densité dans un tube de centrifugation de polypropylene de 50 ml. Faites tourner les tubes à 754 xg, RT, pendant 30 min avec la pause au large. </li><li> Obtenir les couches mononucléaires à la séparation-surnageant interface gradient de densité par pipetage manuel, lavage dans du PBS, et l&#39;insérer dans un tube de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protocole de souris <ol><li> Les préparatifs <ol><li> Préparer une solution de PBS héparinisé (30 unités / ml) à utiliser à la température ambiante (RT), par addition de 30 unités d&#39;héparine sans conservateur par ml de tampon phosphate salin (PBS) 1 x solution. Calculer 20 ml par animal. </li><li> Passer du PBS héparinisé par les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles à ailettes pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Stériliser outils chirurgicaux - 2 paires de ciseaux, une pince émoussée-avivés, 2 hémostatiques, et des pinces à dents tissus (autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec)). </li></ol></li><li> Perfusion du foie et de la collection de MH-Leucocytes <ol><li> Euthanasier l&#39;animal par une surdose de 8% isoflurane. Par précaution, placez un tube de 15 ml contenant un tampon imbibé isoflurane autour de la tête de la souris jusqu&#39;à l&#39;ouverture de sa cavité thoracique. </li><li> Fixer les membres de la souris à un lit. </li><li> Ouvrez les cavités péritonéale et de la poitrine pour exposer le foie et le complexe cardiorespiratoire immédiatement après la cessation de la respiration, en gardant l&#39;aspect inférieur de la membrane intacte (pour créer un pool de cavité thoracique de drainage). Évitez les saignements à travers ce processus. <ol><li> Plus précisément, commencer l&#39;incision dans la partie inférieurePoint abdominale médiane, sans organes internes dommageables, et les progrès des deux côtés en diagonale vers les côtes, coupe à travers eux à des niveaux de la poitrine-cavité supérieure. </li></ol></li><li> Gigognes les intestins et en dehors de l&#39;animal à la droite de l&#39;expérimentateur, pour exposer la veine porte. </li><li> Insérer une aiguille de 30 g, relié à une pompe péristaltique dans le rostre de la veine dans la veine splénique. </li><li> Couper la veine cave inférieure au-dessus du diaphragme pour permettre le drainage et la collecte de la solution de perfusion à partir de la cavité thoracique. </li><li> Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d&#39;environ 3 ml / min et doucement recueillir les 3 premiers ml de perfusat qui sont contaminés par du sang de la piscine de la cavité thoracique. </li><li> Jeter cette perfusat. Répéter un tel lavage à nouveau si nécessaire, à l&#39;aide d&#39;une solution saline, et ensuite seulement commencer à recueillir perfusat du foie. </li><li> Ré-amorcer la perfusion à une vitesse pouvant aller jusqu&#39;à 4 ml / min, et de recueillir 10 ml de liquide de perfusion à partir de la cavité de la poitrine à l&#39;aideun papillon relié à une seringue. </li><li> Terminate perfusion lorsque la couleur du foie se transforme en brun clair. </li></ol></li><li> leucocytes Extraction <ol><li> Centrifuger la solution de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g. </li><li> Aspirer le surnageant. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le surnageant en fonction des objectifs de l&#39; étude, utiliser la préparation comme est, ou effectuer des purifications supplémentaires (par exemple, séparation par gradient de densité). <ol><li> Plus précisément, chaque couche 4 ml de solution de perfusion sur 4 ml de séparation de masse à gradient de densité dans un tube de centrifugation de polypropylene de 50 ml. Faites tourner les tubes à 754 xg, RT, pendant 30 min avec la pause au large. </li><li> Obtenir les couches mononucléaires à la séparation-surnageant interface gradient de densité par pipetage manuel, lavage dans du PBS, et l&#39;insérer dans un tube de 5 ml. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La méthode de perfusion du foie présenté ici permet une récolte sélective et à l&#39;étude de la population unique de marginating leucocytes hépatiques. Cellules NK hépatiques, également appelées cellules fosse 3, constituent une population de cellules NK distinctif qui résident dans les sinusoïdes hépatiques. On les trouve chez les rats, les souris 17 et chez les humains 18,19. Par rapport aux cellules périphériques isolées NK, des cellules de puits montré une cytotoxicité plus élevée c...

Les sinusoïdes hépatiques contiennent de nombreux sous-types de leucocytes de diverses activités immunitaires importantes pour l&#39;organisme. Par exemple, marginating hépatique (MH) tueuses naturelles (cellules NK), aussi appelées cellules de la fosse, se caractérisent morphologiquement comme grands lymphocytes granuleux (LGL) et fonctionnellement comme leucocytes avec une capacité cytotoxique spontanée, permettant hépatique résistance contre l&#39;établissement de encéphalique métastases tumorales supportés. L&#39;objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective des leucocytes MH, afin d&#39;étudier cette population cellulaire importante et unique (et le compartiment immunitaire), et d&#39;élucider l&#39;impact des diverses manipulations (par exemple l&#39; activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques. En dépit de l&#39;absence d&#39;immunité pour éliminer une tumeur primaire en développement, la preuve chez les patients cancéreux et les modèles animaux indiquent que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles Throul&#39;immunité à médiation cellulaire gh (CMI). Cependant, il y a une contradiction apparente entre ces capacités dans vivo et des études in vitro chez l&#39; homme et chez les animaux, qui démontrent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par circulation ou leucocytes spléniques 1,2. Cette incohérence peut être attribuée, au moins en partie, à l&#39;existence in vivo d&#39;une sous - population leucocytaire distincte, à savoir les (sinusoïdes) leucocytes marginating-hépatique et leur sous - population de cellules NK activées, à savoir les cellules de la fosse 3. En effet, les données non publiées provenant de notre laboratoire ont indiqué que des rats F344 cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélées résistantes aux leucocytes circulants et spléniques, ont été lysées par les cellules MH-NK 4. Ainsi, les cellules tumorales qui sont prétendument &quot;NK-résistant&quot; aux leucocytes circulants peuvent être contrôlées par les cellules MH-NK. Il convient de noter, chez la souris l&#39;activité accrue de MH-NK est évident qu&#39;à la suite in vivo immunitairela stimulation (par exemple , par l&#39;utilisation de poly I: C , ou le CpG-C) 5. Les cellules NK spécifiques hépatiques (MH-NK) sont situés à l&#39;intérieur de la lumière sinusoïdales, adhérant aux cellules endothéliales et les cellules de Kupffer. Cellules MH-NK sont caractérisées exclusivement par des granules denses sphériques et des vésicules de tige-évidée 6, qui contiennent de la phosphatase acide que les enzymes lysosomales et perforine et granzymes comme substances bioactives 7,8. Par rapport à circulation des cellules NK, les cellules MH-NK présentent un plus grand nombre et la taille des granules et des vésicules 9-11. Dans des conditions inflammatoires, des cellules MH-NK ont été révélés présenter une expression plus élevée de LFA-1 12 par rapport à la circulation des cellules NK. Cette expression accrue peut constituer un mécanisme par lequel les cellules MH-NK sont plus cytotoxiques contre certaines cellules tumorales circulantes que les cellules NK 13,14. nterestingly, après une incubation in vitro avec l&#39; interleukine (IL) -2, les cellules MH-NK se dilatent etleur nombre et la taille des granules augmentent, qui sont tous compatibles avec un pro fi le du tueur de lymphokine activé (LAK) cellules 15. leucocytes actifs MH ne peuvent pas être exclusivement obtenues par les méthodes de récolte leucocytaires du foie standard, qui sont basées sur le broyage et la dégradation biologique du tissu. Notre approche de perfusion décrit ici présente deux avantages majeurs par rapport aux approches standard. Premièrement, l&#39;approche de perfusion récolte sélective des leucocytes MH, empêchant la contamination par d&#39;autres leucocytes d&#39;autres compartiments du foie. Deuxièmement, la meilleure technique de perfusion préserve l&#39;intégrité, l&#39;activité, et le milieu physiologique des leucocytes MH, contrairement au traitement des tissus approches qui endommagent les cellules ou modifier leur morphologie, et en raison de lésions tissulaires, induisent la libération de divers facteurs qui modulent nettement immunitaire activité. Le foie est un organe cible majeur pour les métastases du cancer and pour diverses infections 16. Comme les cellules MH présentent des caractéristiques uniques, il est important d&#39;étudier cette population spécifique dans diverses conditions à l&#39;égard de ces pathologies. Par exemple, il est intéressant de noter que l&#39; activation immunitaire systémique par divers BRM (par exemple poly I: C ou CpG-C) ont été montré pour activer MH-leucocytes plus de leucocytes 5 circulation.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Pompe</td><td></td><td></td><td></td>péristaltique</tr><tr><td>Aiguille papillon</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Aiguille papillon</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4"</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Pic solution</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Pic solution</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Pic solution</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Pic solution</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Pic solution</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Pince à bords arrondis Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hémostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td>à tissus</tr><tr><td>22 W Lampe</td><td></td><td></td><td></td> loupe</tr></tbody></table> fluorescente

récolte sélective de marginating-hépatiques leucocytes

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Les leucocytes hépatiques marginaux (MH) (leucocytes adhérant aux sinusoïdes du foie) ont montré une composition et des caractéristiques uniques par rapport aux leucocytes d’autres compartiments immunitaires. Plus précisément, les preuves suggèrent un profil pro- et anti-inflammatoire distinct de la population de MH-leucocytes et une cytotoxicité plus élevée des cellules NK spécifiques du foie (à savoir, les cellules de fosse) par rapport aux immunocytes circulants ou spléniques chez les souris et les rats. La méthode présentée ici permet la récolte sélective de leucocytes MH par perfusion forcée du foie chez la souris et le rat. Contrairement à d’autres méthodes utilisées pour extraire les leucocytes du foie, y compris le broyage des tissus et la dégradation biologique, cette méthode produit exclusivement des leucocytes à partir des sinusoïdes hépatiques, non contaminés par des cellules d’autres compartiments hépatiques. De plus, la technique de perfusion préserve mieux l’intégrité et le milieu physiologique des leucocytes MH, épargnant les réponses physiologiques connues au traitement tissulaire. Comme de nombreuses cellules malignes circulantes et cellules infectées sont retenues lors de leur passage par les sinusoïdes hépatiques, interagissant physiquement avec les cellules endothéliales et les leucocytes résidents, la population unique de leucocytes MH est stratégiquement située pour interagir, identifier et réagir face aux cellules circulantes aberrantes. Ainsi, la récolte sélective de leucocytes MH et leur étude dans diverses conditions peuvent faire progresser notre compréhension de la signification biologique et clinique des leucocytes MH, en particulier en ce qui concerne les cellules aberrantes circulantes, les maladies hépatiques et les métastases cancéreuses.

Chez les rats F344, nous avons comparé la cytotoxicité des cellules MH-NK (collectées à partir des sinusoïdes du foie par perfusion du foie forcée) à la cytotoxicité de l&#39;ensemble de la population de cellules du foie suite à un broyage mécanique du tissu hépatique et à la cytotoxicité des leucocytes circulants. Toutes les préparations de cellules ont été lavées au moins 3 fois, de routine dans des essais immunologiques, et en tant que lignées de cellules cibles, nous avons utilisé le...

Les leucocytes marginaux-hépatiques présentent des caractéristiques uniques et des fonctions immunologiques distinctes par rapport aux autres populations de leucocytes. Nous décrivons ici une méthode de récolte sélective de cette population spécifique de cellules hépatiques, par perfusion forcée du foie de rats ou de souris. Les leucocytes hépatiques marginaux semblent essentiels pour déterminer la susceptibilité aux maladies hépatiques et aux métastases.

Récolte sélective de Marginating-hépatiques Leucocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

L'objectif général de cette procédure est de recueillir de manière sélective les leucocytes hépatiques marginaux, des cellules immunitaires qui adhèrent aux sinusoides du foie, par perfusion forcée à partir de foies de souris ou de rat. Cette méthode permet l'étude des leucocytes hépatiques qui présentent des caractéristiques uniques et des fonctions immunologiques distinctes par rapport aux autres populations de leucocytes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit des leucocytes provenant exclusivement des sinusoides hépatiques, sans contamination par des cellules issues d'autres compartiments hépatiques tels que le parenchyme.Liat Sorski et Lee Shaashua, deux étudiantes diplômées exceptionnelles de mon laboratoire, démontreront la procédure. Avant de commencer la perfusion hépatique, faites circuler du PBS hépariné à travers les tuyaux de la pompe péristaltique et les aiguilles papillon afin d'éliminer toutes les bulles d'air. Ensuite, immédiatement après l'arrêt de la respiration, utilisez des ciseaux stériles et une pince à tissus dentée pour pratiquer une incision abdominale médiane, en partant du bas-ventre du rat euthanasié jusqu'au processus xiphoïde, en prenant soin de ne pas endommager les organes internes.Ensuite, utilisez la pince pour soulever le sternum et couper soigneusement le diaphragme et la cage thoracique des deux côtés. Placez une pince hémostatique sur le sternum et repliez la cage thoracique vers l'avant pour exposer le complexe cardio-pulmonaire. Préparez ensuite une aiguille papillon de 21 gauge reliée à une seringue de 10 millilitres et insérez-la dans le ventricule droit du cœur.Ensuite, utilisez la seringue de 10 millilitres pour recueillir le plus de sang possible. Lorsque tout le sang a été recueilli, utilisez un clamp hémostatique pour pincer la veine cave caudale aussi près que possible du cœur. Puis, déplacez les intestins hors de la cavité abdominale vers le côté gauche de l'animal afin d'exposer la veine porte.Ensuite, préparez un cathéter intraveineux de calibre 25 relié au tube de sortie de la pompe péristaltique et insérez-le dans la veine porte aussi caudalement que possible tout en restant rostral par rapport à la veine splénique. Puis, préparez une aiguille papillon de calibre 21 reliée à une seringue de cinq millilitres et insérez-la dans la veine cave inférieure, en position caudale par rapport au clamp. Mettez la pompe péristaltique en marche à une vitesse d'environ trois millilitres par minute et recueillez les premiers millilitres de perfusat contaminés par le sang dans la seringue.Placer la seringue de récolte de cinq millilitres avec la seringue de récolte de 20 millilitres sans arrêter la pompe lorsque le perfusat prend une couleur rouge pâle. Ensuite, recueillir au moins 20 millilitres de perfusat hépatique à raison de sept millilitres par minute. Lorsque l'ensemble du foie est devenu brun clair, arrêter la perfusion.Ensuite, centrifuger le liquide de perfusion et aspirer le surnageant. Pour recueillir les leucocytes hépatiques marginaux de souris, immédiatement après l'arrêt de la respiration, utiliser des ciseaux stériles et une pince à tissu dentée pour pratiquer une incision abdominale médiane jusqu'au processus xiphoïde. Puis, utiliser la pince pour soulever le sternum et couper soigneusement le diaphragme et la cage thoracique des deux côtés.Fixer une pince hémostatique sur le sternum et replier la cage thoracique en direction rostrale pour exposer le complexe cardio-pulmonaire. Déplacer les intestins à l'extérieur de la cavité abdominale, vers la gauche de l'animal, afin d'exposer la veine porte. Ensuite, relier une aiguille de calibre 30 à une pompe péristaltique et l'insérer dans la veine porte en position rostrale par rapport à la veine splénique.Couper la veine cave inférieure au-dessus du diaphragme afin de permettre l'écoulement et la collecte du perfusat depuis la cavité thoracique. Ensuite, mettre en marche la pompe péristaltique à une vitesse d'environ trois millilitres par minute et recueillir les premiers millilitres de perfusat contaminé par le sang provenant du réservoir dans la cavité thoracique. Une fois que trois millilitres ont été collectés, arrêter la pompe.Ensuite, après avoir inséré une aiguille papillon de 21 gauge reliée à une seringue de 10 millilitres, réinitialiser la perfusion à une vitesse allant jusqu'à quatre millilitres par minute, jusqu'à ce que 10 millilitres de liquide de perfusion soient recueillis dans la cavité thoracique. Lorsque le foie devient brun clair, arrêter la perfusion. Puis, transférer le liquide de perfusion dans un tube de 15 millilitres.Le centrifuger. Ensuite, aspirer le surnageant. Alors que les cellules NK marginales hépatiques présentent une cytotoxicité profonde contre des lignées cellulaires cibles allogéniques, l'ensemble de la population cellulaire hépatique et les leucocytes circulants affichent des niveaux de cytotoxicité nettement plus faibles et presque aucune activité de lyse contre une lignée cellulaire cible syngénique.Les mêmes niveaux relatifs plus faibles de cytotoxicité sont observés lorsque les foies traités mécaniquement subissent un lavage et une séparation par gradient de densité. L'analyse factuelle des populations spécifiques de leucocytes révèle des différences marquées dans la composition des populations de cellules immunitaires provenant des compartiments circulants et hépatiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement.Après cette procédure, la cellule peut être utilisée pour la cytométrie en flux, la PCR ou toute autre méthode permettant de caractériser cette population importante de leucocytes. Cette technique permet la collecte sélective des leucocytes hépatiques marginaux afin de faire progresser notre compréhension de la signification biologique et clinique. Plus précisément, nous nous attendons à contrôler les cellules aberrantes circulantes et les maladies liées au foie.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment recueillir les leucocytes hépatiques marginaux.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages de culture primaire de cellules de foie de rat est décrit. Cette méthode utilise la prolifération des macrophages dans la culture, suivie par la secousse de flacons de culture et de la purification par l'attachement sélectif plats en plastique. Cette technique fournit efficacement des macrophages du foie, sans équipement complexe et des compétences.

Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

Cette vidéo décrit une méthode de séparation spatiale de trois sous-populations de cellules leucémiques : les cellules leucémiques suspendues flottant librement dans le milieu, les cellules leucémiques en phase brillante adhérant à la surface de la monocouche de cellules stromales mésenchymateuses et les cellules leucémiques en phase faible qui ont migré sous la monocouche de cellules stromales mésenchymateuses à partir de la co-culture 2D.

Récolte de sous-populations leucémiques : une méthode de séparation spatiale des sous-populations de cellules leucémiques à partir de la co-culture 2D

Dans cette vidéo, nous démontrons l’isolement des leucocytes hépatiques marginants du foie de souris par perfusion forcée.

Isolement de leucocytes hépatiques marginaux à partir du foie d’une souris

Cette vidéo démontre l’isolement des lymphocytes, y compris les cellules tueuses naturelles ou cellules NK, à partir du tissu hépatique humain pour une expansion sélective. La digestion enzymatique et mécanique, suivie d’une séparation par gradient de densité, favorise l’isolement des lymphocytes, y compris les cellules NK. Les lymphocytes collectés peuvent être utilisés pour l’expansion sélective des cellules NK.

Isolement de cellules tueuses naturelles à partir du tissu hépatique pour une expansion sélective

Une technique permettant d’isoler des hépatocytes humains et des cellules hépatiques non parenchymateuses du même donneur est décrite. Les différents types de cellules hépatiques constituent la base des modèles hépatiques fonctionnels et de l’ingénierie tissulaire. Cette nouvelle méthode vise à isoler les cellules hépatiques avec un rendement et une viabilité élevés.

Protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

Les leucocytes marginaux-pulmonaires présentent des caractéristiques uniques et des fonctions immunologiques distinctes par rapport aux autres populations de leucocytes. Nous décrivons ici le prélèvement sélectif de cette sous-population de leucocytes pulmonaires, par perfusion forcée des poumons chez le rat et la souris. Les leucocytes pulmonaires marginaux semblent essentiels pour déterminer la susceptibilité aux maladies transmissibles par le sang et les maladies pulmonaires.

Récolte sélective de Marginating-pulmonaires Leucocytes

lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.

Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole pour l’isolement des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques primaires (LSEC) de souris. Le protocole est basé sur la perfusion de collagénase hépatique, la purification des cellules non parenchymateuses par centrifugation à basse vitesse et la sélection de billes magnétiques CD146. Nous phénotypons et caractérisons également ces LSTEC isolés à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie électronique à balayage.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Les hépatocytes chargés de lipides sont inhérents à la régénération du foie, mais sont généralement perdus lors de la centrifugation par gradient de densité. Ici, nous présentons un protocole d’isolement cellulaire optimisé qui conserve les hépatocytes stéatotiques, produisant des populations représentatives d’hépatocytes en régénération après hépatectomie partielle chez la souris.

Isolement des hépatocytes régénérants après hépatectomie partielle chez la souris

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.

Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

Découvrez la récolte sélective de leucocytes hépatiques marginants par perfusion forcée chez le rat et la souris. Cette méthode permet d'isoler des cellules immunitaires pures des sinusoïdes hépatiques pour étudier leurs fonctions immunologiques uniques.

Récolte sélective de Marginating-hépatiques Leucocytes

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